Summary
A perda do reflexo de endireitamento serviu durante muito tempo como um substituto do comportamento padrão para a inconsciência, também chamado de hipnose, em animais de laboratório. As alterações na sensibilidade do anestésico volátil decorrentes de intervenções farmacológicas pode ser detectado com um sistema de avaliação controlada cuidadosamente de alto rendimento, que pode ser adaptado para a entrega de qualquer terapêutico inalado.
Abstract
Um ponto final desejável de anestesia geral é o estado de inconsciência, também conhecida como hipnose. Definindo o estado hipnótico em animais é menos simples do que em pacientes humanos. Um substituto de comportamento amplamente utilizado para a hipnose em roedores é a perda do reflexo de endireitamento (LORR), ou o ponto em que o animal já não responde ao seu instinto inato para evitar a vulnerabilidade de decúbito dorsal. Nós desenvolvemos um sistema para avaliar LORR em 24 camundongos simultaneamente, controlando cuidadosamente para potenciais fatores de confusão, incluindo flutuações de temperatura e diferentes fluxos de gás. Estas câmaras permitir uma avaliação fiável da sensibilidade anestésico, conforme medido pela latência para retornar do reflexo de endireitamento (RORR) após uma exposição anestésico fixo. Em alternativa, a utilização de incrementos graduais (ou diminui) a concentração de anestésico, as câmaras também permitem a determinação da sensibilidade de uma população de indução (ou emergência) como medido porEC 50 e Hill encosta. Finalmente, as câmaras climatizadas descritos aqui pode ser adaptado para uma variedade de usos alternativos, incluindo a entrega por inalação de outras drogas, os estudos de toxicologia, e simultânea de monitorização em tempo real dos sinais vitais.
Introduction
Os anestésicos gerais são definidos por sua capacidade de causar um estado reversível da hipnose em uma grande variedade de espécies, mas uma explicação sobre a forma como uma classe tão diversificado de drogas podem provocar uma endpoint singular permanece indefinida. Uma série de teorias têm sido posta ao longo dos anos, a partir da correlação de Meyer-Overton entre potência anestésica e solubilidade lipídica, o que sugere rupturas de membranas gerais como base para a hipnose 1,2. Evidências mais recentes sugerem que os alvos da proteína que afetam a sinalização neuronal contribuir para efeitos anestésicos. Os ratos têm provado ser um modelo indispensável para explorar estas teorias, devido à homologia entre murino e responsividade anestésico humano. Apesar de ser um rato não pode ser questionado sobre sua percepção subjetiva sob anestesia geral, alguns reflexos primitivos servir medidas substitutas como úteis de roedor hipnose. Nos primeiros dias após o nascimento, os ratos desenvolvem uma resp endireitamento reflexivaonse que impede que eles sejam passivamente colocado em decúbito dorsal 3. A dose de anestesia em que um rato perde o seu reflexo de endireitamento correlaciona-se bem com doses hipnóticas humanos 4.
A avaliação da perda do reflexo de endireitamento (LORR) tornou-se um padrão de laboratório amplamente utilizado para testar a sensibilidade da anestesia em ratinhos, bem como uma variedade de outras espécies, incluindo ratos, cobaias, coelhos, furão, ovelhas, cães e 5-8. A dose de um dado anestésico LORR em que vai ocorrer a membros de uma espécie é extremamente consistente, mas pode ser deslocado significativamente por factores ambientais. Por exemplo, ratos privados de sono são mais sensíveis a ambos os agentes anestésicos voláteis e intravenosas e 9 ratos com alta capacidade aeróbia são menos sensíveis ao isoflurano 10. Hipotermia Também foi demonstrado para diminuir a dose de numerosos anestésicos necessários para a hipnose num largo espectro de espécies de 11-14. Em ordempara identificar com fiabilidade a dose do anestésico no qual LORR ocorre num grupo de animais experimentais, é fundamental que o ambiente de avaliação ser cuidadosamente controladas para minimizar a tensão, manter euthermia, e fornecer a mesma quantidade de droga para todos os indivíduos. Não surpreendentemente, os fatores genéticos também são conhecidos por alterar a sensibilidade do anestésico 15-18. Consequentemente, a consideração cuidadosa deve ser dada para o controle de fundo genético 19.
Desenvolvemos um dispositivo que garante a entrega anestésico gasoso idêntico a cada um dos 24 ratinhos, mantendo um ambiente de 37 º C constantes. O design cilíndrico transparente dos nossos câmaras de exposição permite uma avaliação LORR rápido e fácil integração de medidas fisiológicas de telemetria. Este sistema tem sido mostrado para medir com precisão o isoflurano, halotano, e indução sevoflurano CE 50 e hora de aparecimento em ratinhos de tipo selvagem 20. Temos também utilizadoesse sistema para observar as mudanças na sensibilidade anestésico em camundongos com mutações genéticas e lesões hipotálamo-alvo 21-23. Aqui descrevemos duas maneiras em que a sensibilidade do anestésico podem ser avaliados após uma intervenção farmacológica usando nosso aparelho ambiente controlado. Fenotipagem em estado estacionário de indução de anestesia volátil e sensibilidade surgimento requer 8-10 horas e é, consequentemente, melhor adaptado para estudos em que condições experimentais não mudam, como em intervenções farmacológicas crônicas ou de longa duração. No entanto, para tratamentos de curta duração, cujos efeitos se dissipam de forma significativa ao longo do tempo apresentamos também um procedimento simples para avaliar mudanças no reflexo de endireitamento seguintes microinjeções estereotaxicamente-alvo ou tratamentos de drogas intravenosas que impactam significativamente surgimento da anestesia. Esses ensaios representam um pequeno subconjunto das potenciais aplicações para este sistema de ambiente controlado, o que pode ser adaptado para qualquer número de subjjectos de uma variedade de espécies para receber qualquer tipo de terapêutica por inalação.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os procedimentos envolvendo animais aqui descritos foram aprovados pela Universidade do Comitê Institucional Animal Care e Use da Pensilvânia.
1. Visão geral do aparelho de teste
- O aparelho de teste consiste em 24 câmaras cilíndricas claras acrílico com 10 cm de comprimento e 5 cm de diâmetro (volume total de 200 ml). Este tamanho é adequado para uma típica de 25 g do rato adulto. Chambers tem portas em cada extremidade para entrada e saída de gás. A extremidade de saída é removível, de modo que os animais podem ser facilmente carregados para dentro da câmara. Aberturas de gás são cuidadosamente selados com fita de Teflon, enquanto juntas O-ring de borracha são usados para selar o terminal amovível das câmaras cilíndricas.
- Cada câmara é montado sobre um suporte que se situa dentro de um banho de água. A prateleira é montada de modo que apenas a porção inferior das câmaras (abaixo das entradas de gás) é submerso. Para a estabilidade, a extremidade traseira da câmara repousa sobre um suporte, de modo que toda a chamber fica na horizontal. Isso garante até mesmo o contato de toda a câmara com o banho.
- Tubos de polietileno conecta um tanque de oxigénio a um vaporizador de anestésico, e, em seguida, passa através de um L / medidor de fluxo de 10 min. A tubagem 25 divide-se em resistências de pequeno diâmetro, de comprimento igual para assegurar a igualdade de fluxo é fornecido a cada uma das câmaras 24 e um analisador de agente.
- As linhas de vácuo de cada câmara de sair na extremidade oposta da entrada de gás. Isso promove o fluxo unidirecional que elimina reinalação de dióxido de carbono exalado. As linhas de vácuo combinar em um colector para se conectar a uma linha de sucção em casa. Uma válvula pop-off ao longo da principal linha de vácuo garante condições de pressão atmosférica dentro de cada câmara.
- O banho é preenchido com água o suficiente para contactar plenamente a parte inferior de cada câmara. A água é distribuída através do banho e mantida à temperatura constante de 37 ° C por uma bomba.
2. Verifique se os sistemas antes da exposição
- Cos pedaços que a temperatura do banho de água é de 37 ° C durante todo o banho.
- O fluxo de oxigênio a uma taxa de 5 L / min (200 ml / min por câmara + analisador de agente). Mergulhe cada câmara debaixo de água e procure por bolhas ou entrada de água na câmara, os quais são indicativos de vazamentos. Vede todas as fugas antes de iniciar o experimento.
- Para cada câmara, ligue um ml / min metro 500 fluxo na linha após a câmara ter certeza de que os fluxos são equilibrados em cada uma das linhas de gás 25. Isso garante que as entrada de 5 L / min fluxos serão distribuídas uniformemente, para que cada uma das câmaras recebe 200 mL / min de fluxo. Qualquer câmara não receber o fluxo esperado deve ter a sua entrada e saída de tubulação verificado se há obstruções.
- Calibrar o analisador agente para assegurar uma leitura de 0,00% isoflurano quando 100% de oxigênio está fluindo.
3. Implant Transponder Temperatura
- Uma semana antes da habituação, anestesiar cada rato com 2% de isoflurano.
- Esterilizar área do pescoço dorsal com betadine.
- Injetar um transponder via subcutânea temperatura entre as omoplatas, usando o estéril, agulha injetora pré-embalados.
- Monitorar o local da injeção diária de infecção e migração do transponder.
4. Habituar Animais de Câmaras de testes
- Quatro dias antes da primeira avaliação, coloque todos os ratos em câmaras individuais para 2 h com 100% de oxigênio fluindo.
- Repita o passo 4,1 diária para os quatro dias antes da avaliação, para evitar os efeitos de confusão de estresse devido a um novo ambiente.
5. Realizar a intervenção farmacológica que você deseja testar para efeitos sobre Anestésica Sensibilidade
- Esta intervenção poderá ser uma injecção estereotáxica numa parte específica do cérebro de 24, uma injecção intravenosa ou intraperitoneal 25, ou distribuição de um fármaco a uma área específica do cérebro através de uma cânula 26.
- Porque esses mesmos procedimentos podem alterar a sensibilidade anestésico em relação a um animal ingênuo, um grupo controle adequado devem ser submetidos ao mesmo procedimento com injeções de veículos.
- Certifique-se de que a intervenção farmacológica tem uma forma adequada longa duração de ação, se você está planejando fazer um gradual aumento e / ou diminuição da determinação da sensibilidade do anestésico, como mostrado na etapa 6 abaixo, caso contrário, pule para o passo 7.
6. Avaliar Anestésica Sensibilidade usando o Stepwise EC 50 Determinação para indução e Emergência
- Coloque cada animal em câmaras individuais com 100% de oxigênio fluindo.
- Definir a concentração de isoflurano a 0,4% * por 15 min. Durante os últimos 2 minutos deste período, avaliar o reflexo de endireitamento de cada animal por suavemente ondulado a câmara até que o mouse é colocado sobre suas costas. O reflexo de endireitamento é considerada intacta, se e somente se o mouse é capaz de restaurar todosde suas patas para o chão da câmara dentro de 2 min.
- * Note-se que 0,4% de isoflurano é uma dose subhypnotic em ratos C57BL/6J. Se quaisquer ratinhos perdem o reflexo de endireitar-se a primeira etapa, a dose inicial era demasiado grande e deve ser reduzida em dias subsequentes.
- Grave o estado do reflexo de endireitamento para cada rato e digitalizar cada rato para os dados de temperatura. Um registo do modelo é mostrado na Tabela 1.
- Aumentar a concentração de isoflurano por ~ 0,05% por 15 min e repita o passo 7.2. Continue a fazer isso até que todos os animais perderam o reflexo de endireitamento.
- Opcional: repita o mesmo procedimento para diminuir doses isoflurano passo a passo até que todos os animais recuperaram a sua reflexo de endireitamento (veja o passo 6.3).
- Para finalizar a experiência, desligue o isoflurano e lave todo o sistema com oxigênio a 100% por 15 min. Isso vai ajudar a evitar a hipóxia como os ratos recuperar antes de serem devolvidos aos seus gaiolas e protegerá o experimenter de qualquer exposição do anestésico.
- Opcional: se o número de animais ou o número de concentrações anestésicas são limitados devido a limitações de tempo ou de recursos, as estimativas-particularmente dos parâmetros da curva de ajuste da inclinação pode-Hill têm subvalorizado, falsamente baixa estimativa de erro. Em tais casos, pode ser necessário repetir a medição da sensibilidade anestésico descrito nos passos 6,1-6,6 em até dois dias experimentais adicionais para obter totalmente parâmetro do verdadeiro declive Hill e as suas estimativas de erro correspondente.
7. Avaliar as mudanças de curto prazo na Anestésica Sensibilidade com tempo de Emergência
- Coloque cada animal em câmaras individuais com 100% de oxigênio fluindo.
- Definir a concentração de isoflurano a 1,2%, o que corresponde à indução de ED 99 para ratinhos do tipo selvagem da estirpe C57BL/6J 20. Manter por 30-60 min, dependendo da duração esperada da ação da intervenção aguda.
- Confirme LORR emtodos os animais por suavemente ondulado cada câmara até que os ratos são colocados em suas costas.
- Desligue o isoflurano eo fluxo de 100% de oxigênio. Medir o tempo até que cada animal recupere a sua reflexo de endireitamento. Isto é definido pela colocação de todas as quatro patas no chão da câmara, e confirmou a presença de três ensaios consecutivos com um reflexo de endireitamento intacta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A Figura 1 demonstra a utilidade do ensaio de LORR passo a passo para a determinação de efeitos a longo prazo de uma intervenção farmacológica. Ácido iboténico (IBA) é um agonista do N-metil-D-aspartato (NMDA) do receptor glutamatérgico que é frequentemente utilizado como uma excitotoxina para causar lesões neuronais permanentes. Aqui nós injectados 10 nl de 1% de IBA bilateralmente na área pré-óptica ventrolateral (VLPO) de ratos C57BL/6J uma semana antes do ensaio. A maioria dos neurônios neste núcleo apresentam baixas taxas de disparo durante a vigília e aumentar especificamente a sua actividade durante o sono não-movimento rápido dos olhos, sono do movimento rápido dos olhos, e com a exposição a doses hipnóticas de anestésicos gerais 23,27-29. Lesões bem sucedidos no VLPO deve causar resistência à hipnose induzida por isoflurano. Em cada nível crescente de isoflurano, a fracção de ratinhos que tinham perdido o reflexo de endireitamento foi representada graficamente contra a concentração de anestésico numa escala de log 10. Dadospara cada grupo de ratos (e IBA-injetado com injecção de veículo) foi então ajuste com uma curva dose-resposta sigmoidal. Porque este ensaio começa sempre com todos os animais em pé e sempre termina com todos os animais que perderam o reflexo de endireitamento, inferior e superior constantes foram constrangidos a 0 e 1, respectivamente. Os restantes parâmetros livres das curvas estão a CE 50, ou a concentração de anestésico para o qual 50% dos ratos perderam o reflexo de endireitamento, e o declive Hill, o que reflecte a variação da população durante a sua transição de estado hipnótico. Um F-teste foi utilizado para consultar se uma curva de indução único com CE compartilhado 50 e parâmetros encosta melhor se encaixam no veículo e grupos de AIB ou se curvas de indução separados com parâmetros distintos melhor ajuste dos dados. Os graus de liberdade neste teste surgir a partir dos pontos de dados brutos subjacentes ajustamento da curva e, consequentemente, depender do número de concentrações anestésicas testados e o número de parâmetros a ser fit-CE 50 e Hill inclinação nesse caso. Dados emergência passo a passo foram analisados e modelados de forma idêntica aos dados para indução. Note-se que a EC50 para a emergência é quase sempre menor do que a da indução devido à histerese anestésico também conhecido como inércia neural 30. Ao contrário do que os resultados esperados, os animais que receberam IBA no VLPO não mostraram diferenças significativas na EC 50 ou Colina inclinação para a indução ou surgimento em relação aos controles de injecção de veículos (F 2,80 = 1,73 e p = 0,184 para a indução, F 2, 88 = 2,89 e p = 0,061 para a emergência). Isto indica que os neurónios do rato VLPO são resistentes à lesão com 1% de IBA, um facto confirmado com histologia post-mortem (não mostrado). Lu et ai. já demonstraram que uma dose de 10% de IBA é necessária para a lesão do rato VLPO 31, mas o exame histológico do VLPO rato a seguir à injecção de 10% IBA também não mostrou significânciaPerda de células de escala (não mostrado). O VLPO rato é conhecido por expressar receptores de NMDA 32. Desde 10% IBA é capaz de exercer um efeito agudo sobre a sensibilidade do anestésico quando injetado no VLPO (ver Figura 2, a discussão abaixo), este afirma que o mouse VLPO também deve possuir os receptores NMDA necessárias para as ações do IBA. Assim, a razão para a discrepância entre espécies permanece obscura. Lesões rato VLPO sucesso foram alcançados usando uma galanin-saporina alvo 23.
Embora AIB não tem um efeito a longo prazo sobre a sensibilidade isoflurano quando injectado no VLPO, a natureza aguda excitatório desta droga seria esperado para estimular neurónios VLPO e transitoriamente aumentar a sensibilidade do anestésico. Na Figura 2, utilizou-se o tempo de teste de emergência para demonstrar uma grande mudança na sensibilidade aguda isoflurano imediatamente após microinjecção bilateral AIB em VLPO como evidenciado por marcadamente prolongadahipnose após a cessação de fornecimento de anestésico (p <0,001). Por outro lado, a microinjecção de IBA no septo medial vizinhas não causou alteração no tempo de emergência em comparação com os controlos injectados com veículo (p> 0,05). Esta descoberta acrescenta uma faceta interessante trabalho anterior mostrando que a inativação deste núcleo aumenta o tempo de surgimento 33,34. Os dados para os grupos experimental e controle do tempo de teste de emergência foi média e comparados com um one-way ANOVA.
| Tempo | Isoflurano (% atm) | Mouse # 1 | Mouse # 2 | Mouse # 3 | ... |
| 0,4 | - | - | - | - | |
| 12:15 | 0,45 | - | X | - | - |
| 12:30 | 0,5 | - | X | X | - |
| 12:45 | 0,55 | - | X | X | |
| ... | 0,6 | - | X | X | X |
. Tabela 1 Exemplo de uma folha de registo de longo prazo Anestésico Avaliação Sensibilidade: a cada 15 min, a dose de anestésico foi aumentado em 0,05% e reflexo de endireitamento foi avaliada para cada animal. "X" indica a animais que tinham perdido o seu reflexo de endireitamento durante um dado ponto de tempo e "-" indica aqueles que mantiveram o seu reflexo de endireitamento.
Figura 1. Avaliação do reflexo de endireitamento de uma semana após injeção de ácido Ibotênico no ventrolateral preoptic NucLEU: O ensaio de sensibilidade do anestésico a longo prazo foi realizada em ratos com veículo ou ácido iboténico (IBA) injectado na área pré-óptica ventrolateral (VLPO) uma semana antes do ensaio. Indução e dados emergência para cada grupo foi se encaixam com uma curva dose-resposta sigmoidal (indução em linhas contínuas, a emergência em linhas tracejadas), juntamente com o intervalo de confiança de 95% entre parênteses as curvas de melhor ajuste (bares sombreadas). Concentração anestésica foi plotado em uma escala log 10. Intervalos de confiança sobrepostos 95% são mostrados em púrpura. O sigmoidal dose repsonse se encaixa tanto para veículos e IBA grupos sugerem nenhuma evidência para as curvas de melhor ajuste distintas baseadas em EC 50 e Hill encosta. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 2. Tempo para Emergence Após microinjecção local de ácido iboténico: Imediatamente antes da avaliação, os ratinhos receberam uma microinjecção do N-metil-D-aspartato (NMDA), agonista do receptor de ácido iboténico (IBA) para o núcleo pré-óptico ventrolateral (VLPO). Esta área é conhecida para ser ativado durante a hipnose induzida por isoflurano. Injeção IBA levou a um aumento agudo na hora de voltar do reflexo de endireitamento em relação aos controles de injecção de veículos (p <0,001). Hora de emergência para animais com IBA injetado septo medial não diferiu do grupo controle (p> 0,05). Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Embora a avaliação de LORR em um único rato é uma tarefa aparentemente simples, é, no entanto, essencial para manter as condições fisiológicas idênticas entre os indivíduos, a fim de coletar dados confiáveis de um grupo de animais. A, aparelho LORR de alta capacidade bem regulamentada aqui apresentado oferece uma maneira de padronizar experiências e maximizar a eficiência. Ao seguir os princípios básicos da termorregulação e distribuição do fluxo igual, este sistema pode ser facilmente recriada e personalizado para atender as necessidades dos experimentadores individuais. Dimensão da câmara pode ser dimensionada para outras espécies, tais como ratos, e câmaras adicionais podem ser acomodados, anexando mais pontos de ramificação para o influxo e de vácuo. Todos os indivíduos são facilmente visíveis através das câmaras de acrílico transparente, o que faz com que seja possível para as experiências de registo vídeo para confirmação post-hoc secundário de resultados. O acrílico também é compatível com os sistemas de telemetria de rádio frequência, que podem ser utilizados para monitorar temperaturatura, pressão arterial, e biopotenciais.
Apresentam-se dois métodos diferentes para avaliar a sensibilidade de anestésico após uma intervenção farmacológica. Tanto o tempo de aparecimento e os testes de indução por passos exigem o experimentador para marcar a presença ou ausência do reflexo de endireitamento. Mesmo com uma definição explícita de LORR, como "incapaz de colocar todas as quatro patas no chão câmara dentro de dois minutos de ser rolou para suas costas", a avaliação pode ser um pouco subjetivo. É melhor ter marcarem o mesmo indivíduo cego-tratamento de cada animal para a duração do experimento para garantir a consistência. Ao escolher o teste a ser usado para a avaliação da sensibilidade do anestésico, a duração esperada do efeito da intervenção farmacológica deve ser o fator decisivo. Muitas drogas têm uma curta duração de ação, para o qual o tempo de aguda a paradigma surgimento pode fornecer informações úteis sobre a sensibilidade do anestésico em um período limitadode tempo. No entanto, a droga pode afetar preferencialmente sensibilidade de um animal para indução de hipnose em vez de emergência, mudanças no tempo de indução são muitas vezes difíceis de detectar porque a indução ocorre rapidamente e, portanto, requer uma avaliação contínua. O teste passo a passo mais tempo para EC 50 de indução e emergência pode dar informações tanto de entrada e saída do hipnose. O comprimento total do experimento, dependerá do tamanho do incremento pelo qual a concentração do anestésico é alterada em cada passo, com indução + emergência testes típicos duram cerca de 8 horas. Diminuindo o tamanho anestésico passo em torno do CE antecipado 50 e o aumento do número de animais em cada grupo vai dar uma curva de dose-resposta de melhor equipada, mas também aumentar o tempo necessário para concluir o ensaio.
Algumas intervenções farmacológicas podem diferencialmente alterar a ventilação dos animais experimentais minutos quando comparados aos seus controles. Tsua poderia causar um grupo para exalar o anestésico volátil no tempo de teste de emergência mais rapidamente do que o outro, confundindo assim os resultados. Solt et al. descrever um bom método alternativo para testar a sensibilidade anestésico neste cenário 35. Em seu experimento, o metilfenidato sistêmica é entregue durante a exposição constante isoflurano em animais que já equilibrada com anestésico. Efeitos de confusão potencial na ventilação minuto são, portanto, excluídos durante a exposição contínua de anestésico como a captação e distribuição de anestésico durante condições de estado estacionário são precisamente relação ao metabolismo e eliminação. As câmaras que descrevem podem ser facilmente modificados com uma porta à prova de gás adicional para permitir a passagem do tubo para a entrega de drogas por via intravenosa ou intracraniana. Também deve ser notado que o descrito 15 min de equilibração a cada concentração de anestésico no ensaio de passo a passo pode não ser suficiente em alguns casos. Anestésicosics com uma maior solubilidade do que o isoflurano, como halotano, vai demorar mais tempo para chegar a suas concentrações completos no tecido. Os animais maiores e animais submetidos a passos maiores na concentração de anestésico podem também requerer mais tempo para equilibrar. Para determinar se 15 min é realmente adequada para atingir o equilíbrio, os níveis nos tecidos anestésicos na mesma concentração de anestésico em ambas as extremidades ascendentes e descendentes de exposição deve ser medido.
Nos casos em que a capacidade de um animal para mover fisicamente ou farmacologicamente impediram, LORR não pode servir como uma boa medida substituta da hipnose. A alternativa mais confiável e amplamente utilizado é de eletroencefalograma (EEG) corticais. Apesar de EEG pode ser melhor capaz de pegar as mudanças mais sutis na sensibilidade anestésico, é significativamente mais caro de configurar do que o aparelho que descrevemos. Implante de eletrodos de EEG é um procedimento invasivo e demorado, ea capacidade de obtaem dados de vários ratinhos simultaneamente é frequentemente limitada pela disponibilidade de equipamento. Além disso, a análise de EEG é conceitualmente mais abstrato e difícil de interpretar do que a saída binária simples de avaliação LORR. Por estas razões, os testes comportamentais, como as descritas aqui são muitas vezes os métodos mais viáveis para rápida triagem sensibilidade anestésico. Note-se que padrões de EEG sugestivos de excitação e hipnose pode não se correlacionam bem com o comportamento. LORR e EEG são pontos finais distintos que ambos provavelmente fornecem informações úteis sobre a sensibilidade do anestésico.
Além de potenciais alterações induzidas pela droga na ventilação minuto e mobilidade, existem várias outras limitações para os métodos aqui descritos. Embora LORR é um substituto para a hipnose padrão em todo o campo, os critérios e metodologia utilizados para a sua medição diferem entre laboratórios. Alguns defendem que os ratos deve ser rodado a uma velocidade constante para avaliar o reflexo de endireitamento. A avaliação contínua estreita logicamente o momento preciso com o qual o reflexo de endireitamento está perdido e / ou retorno, no entanto, o ato de ser transformado em decúbito dorsal pode ser mais estimulante do que simplesmente permanecer em decúbito dorsal. Além disso, a avaliação por etapas LORR é um ensaio demorado que pode ser ainda mais prolongada se 15 minutos de equilibração em cada passo é considerado insuficiente.
Apesar destas limitações, as aplicações potenciais para este protocolo se estendem muito além dos casos específicos que apresentamos. Claramente, as intervenções farmacológicas não são o único método pelo qual a sensibilidade do anestésico pode ser alterado, lesões específicas, anormalidades anatômicas, e mutações genéticas podem todos ser testados usando o mesmo passo a passo EC 50 determinação. O sistema de ambiente controlado aqui apresentados podem ser utilizados para fornecer qualquer tipo de droga inalada, tais como corticosteróides, antibióticos ou terapêuticas experimentais. A capacidade de expor muitas ratinhos ao mesmo amount da droga ao mesmo tempo faz com que esta configuração ideal para estudos de toxicologia. Além disso, as câmaras servir como um ambiente de recuperação pós-cirúrgica ideal com temperatura ambiente regulado e fluxo de oxigênio fresco. Este aparelho é útil para qualquer instância em que animais os sinais vitais básicas precisam ser monitorados e controlados.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por R01 GM088156 e T32 HL007713-18. Gostaríamos de agradecer a Bill Pennie e Michael Carman, da Universidade da Pensilvânia Research Instrumentation Loja de sua ajuda na montagem de nosso aparato reflexo de endireitamento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Oxygen | Airgas | OX300 | |
| Isoflurane | Butler Schein | Any volatile anesthetic of interest may be substituted | |
| Name of Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Mass flow meter- 10 SLPM | Omega Engineering | FMA-A2309 | |
| Mass flow meter- 500 SCCM | Omega Engineering | FMA-A2305 | |
| Anesthetic agent analyzer/gas indicator | AM Bickford | FI-21 Riken | |
| Heating water pump | Fisher Scientific | 13-874-175 | |
| Temperature transponders | BMDS | IPTT-300 | |
| RF temperature reader | BMDS | DAS-6007 |
References
- Meyer, H. H. Zur theorie der alkoholnarkose. I. Mittheilung. Welche Eigenschaft der An#228;sthetica bedingt ihre narkotische Wirkung? Naunyn Schmiedebergs Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 42, 109-137 Forthcoming.
- Overton, C. E. Studien über die Narkose: Zugleich ein Beitrag zur allgemeinen Pharmakologie. , Fischer. Jena. (1901).
- Bignall, K. E. Ontogeny of levels of neural organization: the righting reflex as a model. Exp. Neurol. 3 (3), 566-573 (1974).
- Franks, N. P. General anaesthesia: from molecular targets to neuronal pathways of sleep and arousal. Nat. Rev. Neurosci. 9 (5), 370-386 (2008).
- Smith, W. Responses of laboratory animals to some injectable anaesthetics. Lab. Anim. 27 (1), 30-39 (1993).
- Schernthaner, A., Lendl, C., Busch, R., Henke, J. Clinical evaluation of three medetomidine--midazolam--ketamine combinations for neutering of ferrets (Mustela putorius furo)]. Berliner und Münchener tierärztliche Wochenschrift. 121 (1-2), 1-10 (2008).
- Mohammad, F. K., Zangana, I. K., Abdul-Latif, A. R.
- Nicholls, E. A., Louie, G. L., Prokocimer, P. G., Maze, M. Halothane anesthetic requirements are not affected by aminophylline treatment in rats and dogs. Anesthesiology. 65 (6), 637-641 (1986).
- Tung, A., Szafran, M. J., Bluhm, B., Mendelson, W. B. Sleep Deprivation Potentiates the Onset and Duration of Loss of Righting Reflex Induced by Propofol and Isoflurane. Anesthesiology. 97 (4), 906-911 (2002).
- Pal, D., et al. Determination of Minimum Alveolar Concentration for Isoflurane and Sevoflurane in a Rodent Model of Human Metabolic Syndrome. Anesth. 2 (2), 297-302 (2012).
- Eger, E. I., Saidman 2nd,, J, L., Brandstater, B. Temperature dependence of halothane and cyclopropane anesthesia in dogs: correlation with some theories of anesthetic action. Anesthesiology. 26 (6), 764-770 (1965).
- Vitez, T. S., White, P. F., Eger, E. I. 2nd Effects of hypothermia on halothane MAC and isoflurane MAC in the rat. Anesthesiology. 41 (1), 80-81 (1974).
- Antognini, J. F. Hypothermia eliminates isoflurane requirements at 20 degrees C. Anesthesiology. 78 (6), 1152-1156 (1993).
- McKenzie, J. D., et al. Effects of temperature on the anaesthetic potency of halothane, enflurane and ethanol in Daphnia magna (Cladocera: Crustacea). Comp. Biochem. Physiol. C. 101 (1), 15-19 (1992).
- Icaza, E. E., et al. Isoflurane-Induced Changes in Righting Response and Breathing are Modulated by RGS Proteins. Anesth. Analg. 109 (5), 1500-1505 (2009).
- Drexler, B., Antkowiak, B., Engin, E., Rudolph, U. Identification and characterization of anesthetic targets by mouse molecular genetics approaches. Can. 2 (2), 178-190 (2011).
- Wafford, K. A., et al. Differentiating the role of gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptor subtypes. Biochem. 32 (Pt3), 553-556 (2004).
- Lakhlani, P. P., et al. Substitution of a mutant α2a-adrenergic receptor via "hit and run" gene targeting reveals the role of this subtype in sedative, analgesic, and anesthetic-sparing responses in. Proc. Natl. Acad. Sci. 94 (18), 9950-9955 (1997).
- Sonner, J. M., Gong, D., Eger, E. I. Naturally Occurring Variability in Anesthetic Potency Among Inbred Mouse Strains. Anesth. 91 (3), 720-726 (2000).
- Sun, Y., et al. High throughput modular chambers for rapid evaluation of anesthetic sensitivity. BMC Anesthesiol. 6 (1), 13 (2006).
- Hu, F. Y., et al. Hypnotic Hypersensitivity to Volatile Anesthetics and Dexmedetomidine in Dopamine β-Hydroxylase Knockout Mice. Anesthesiology. , (2012).
- Kelz, M. B., et al. An essential role for orexins in emergence from general anesthesia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (4), 1309-1314 (2008).
- Moore, J. T., et al. Direct Activation of Sleep-Promoting VLPO Neurons by Volatile Anesthetics Contributes to Anesthetic Hypnosis. Curr. 22 (21), 2008-2016 (2012).
- Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat. J. Vis. Exp. (65), e4079 (2012).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. J. Vis. Exp. (67), e2771 (2012).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N.
- Szymusiak, R., Alam, N., Steininger, T. L., McGinty, D. Sleep-waking discharge patterns of ventrolateral preoptic/anterior hypothalamic neurons in rats. Brain Res. (1-2), 178-188 (1998).
- Nelson, L. E., et al. The sedative component of anesthesia is mediated by GABAA receptors in an endogenous sleep pathway. Nat. Neurosci. 5 (10), 979-984 (2002).
- Li, K. Y., Guan, Y., Krnjević, K., Ye, J. H. Propofol Facilitates Glutamatergic Transmission to Neurons of the Ventrolateral Preoptic Nucleus. Anesthesiology. 111 (6), 1271-1278 (2009).
- Friedman, E. B., et al. A Conserved Behavioral State Barrier Impedes Transitions between Anesthetic-Induced Unconsciousness and Wakefulness: Evidence for Neural Inertia. PLoS ONE. 5 (7), e11903 (2010).
- Lu, J., Greco, M. A., Shiromani, P., Saper, C. B. Effect of lesions of the ventrolateral preoptic nucleus on NREM and REM sleep. J. Neurosci. 20 (10), 3830-3842 (2000).
- Sun, X., Whitefield, S., Rusak, B., Semba, K. Electrophysiological analysis of suprachiasmatic nucleus projections to the ventrolateral preoptic area in the rat. Eur. J. Neurosci. 14 (8), 1257-1274 (2001).
- Ma, J., Shen, B., Stewart, L. S., Herrick, I. A., Leung, L. S. The septohippocampal system participates in general anesthesia. J. Neurosci. 22 (2), RC200 (2002).
- Leung, L. S., Ma, J., Shen, B., Nachim, I., Luo, T. Medial septal lesion enhances general anesthesia response. Exp. Neurol. , (2013).
- Solt, K., et al. Methylphenidate Actively Induces Emergence from General Anesthesia. Anesthesiology. 115 (4), 791-803 (2011).
