Dissectie van<em> Xenopus laevis</em> Neurale lijst voor<em> In vitro</em> Explantaatkweek of<em> In vivo</em> Transplantatie
Summary
Dit protocol beschrijft hoe premigratory craniale neurale lijst (NC) ontleden van Xenopus laevis neurulas. Deze explanten worden uitgeplaat op fibronectine en gekweekt in vitro of terug in gastheercellen embryo geënt. Deze techniek maakt het bestuderen van de mechanismen van NC epitheel naar mesenchym overgang, migratie en differentiatie.
Abstract
De neurale (NC) is een voorbijgaande dorsale neurale buis populatie cellen een epitheel naar mesenchym transitie (EMT) eind neurulatie ondergaat, migreert uitgebreid naar verschillende organen en differentieert in vele soorten derivaten (neuronen, glia, kraakbeen en bot, gepigmenteerde en endocriene cellen). In dit protocol beschrijven we hoe te ontleden de premigratory craniale NC van Xenopus laevis embryo's, met het oog op NC ontwikkeling te bestuderen in vivo en in vitro. De kikker model biedt vele voordelen voor de vroege ontwikkeling te bestuderen; overvloedige partijen beschikbaar zijn, embryo's ontwikkelen zich snel, in vivo winst en verlies van functie strategieën mogelijk manipulatie van genexpressie voorafgaand aan NC dissectie in donor en / of gastheer embryo's. De NC explanten kan worden uitgeplaat op fibronectine en gebruikt voor in vitro studies. Ze kunnen worden gekweekt gedurende enkele dagen een serumvrij gedefinieerd medium. We beschrijven ook hoe NC explants terug te entenin gastheercellen embryo voor het bestuderen NC migratie en differentiatie in vivo.
Introduction
De neurale (NC) is een voorbijgaande embryonale celpopulatie dat uit de neurale buis eind neurulatie in gewervelde embryo. De signalering en genetische gebeurtenissen die NC specificatie controle zo vroeg gastrulation. De NC wordt gespecificeerd bij de grens tussen de neurale en niet-neurale ectoderm door signalen van omringende dorsale weefsel. Eind neurulatie, NC cellen een epitheel naar mesenchym transitie (EMT) ondergaan en migreren uitgebreid in het embryo volgende stereotype routes door te reageren op omgeving leidende signalen. Zodra ze hun eindbestemming hebben bereikt, ze differentiëren tot een breed scala van derivaten, bijvoorbeeld neuronen, glia, bot, kraakbeen, en gepigmenteerde cellen 1-5. Door hun bijdrage aan vele soorten cellen en embryonale weefsels, gebreken bij elke schakel van NC cellen ontwikkeling, van inductie tot de uiteindelijke differentiatie, kan aangeboren syndromen genoemd neurocristopathies 6 veroorzaken. EXperimental manipulatie van de ontwikkeling van NC in verschillende stadia – specificatie, EMT, migratie en differentiatie – zal ons begrip van neurocristopathies verbeteren en laat het ontwerp van potentiële therapeutische strategieën.
De Xenopus laevis embryo is een model van de keuze om NC ontwikkeling te bestuderen. Grote aantallen embryo's zijn eenvoudig te verkrijgen en externe bemesting geeft toegang tot de eerste stappen van de ontwikkeling. Veel tools zijn beschikbaar om experimenteel te manipuleren X. laevis embryonale ontwikkeling. Gene gain-of-functie en knockdown zijn eenvoudig uit te voeren door microinjecting individuele cellen van de vroege blastulas. Embryonale weefsels kunnen voor in vitro reassociatie 7-11 of back-enten assays 12,13 worden gesneden.
In dit protocol beschrijven we hoe te ontleden premigratory craniale NC in X. laevis laat neurulas, voorafgaand aan de migratie. Deze explantaten kunnen worden gekweekt op fibronectine bekld platen migratie en differentiatie bestuderen gecontroleerde in vitro experimentele omstandigheden. NC explanten kan ook worden geënt op normale of gemanipuleerd gastheer embryo's om hun migratie en differentiatie te bestuderen in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft een eenvoudige techniek om premigratory craniale NC explanteren in X. laevis embryo's. De embryo's die voor dergelijke experimenten moeten robuust te zijn en goed te genezen. Gooi alle partij van ongezonde embryo's. Bovendien groeien embryo bij verschillende temperaturen (van 12 tot 18-20 ° C), om neurale accijns in stap 17 en uiterlijk. Na stap 17, kunnen neurale worden gemengd met cephalic mesoderm en kan niet volledig worden verwijderd. Xenopus weefsels snel gene…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken Adeline Dolly voor de foto's van explantatie op fibronectine, Eric Theveneau voor nuttige discussies en de Animal Facility van het Institut Curie. CM is een postdoc van de regio Ile de France (Domaine d'Interet Majeur Stem Pole), Universite Paris Sud (Attache Temporaire d'Enseignement et de Recherche) en Agence Nationale de la Recherche. Dit werk werd gefinancierd door de Universite Paris Sud (Attractivite 2011), het Centre National de la Recherche Scientifique (Actie Thematique et stimulerend van aard sur-programma), Association pour la Recherche contre le Cancer Grant SFI20101201882, Ligue contre le Cancer, en Agence Nationale de la Recherche (Agence Nationale de la Recherche programma Blanc).
Materials
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F4759-1MG | |
| Bovine Serum Albumine. Fraction V | Euromedex | 04-100-811-C | Lower quality grade may be suitable for this application |
| Stainless Steel Insect Pins. Size 000 | FST | 26001 | |
| Dumont #5 forceps 0.05 mm x 0.02 mm | FST | 11252-20 |
References
- Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (7), 557-568 (2008).
- Theveneau, E., Mayor, R. Neural crest delamination and migration: from epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration. Dev. Biol. 366 (1), 34-54 (2012).
- Stuhlmiller, T. J., García-Castro, M. I. Current perspectives of the signaling pathways directing neural crest induction. Cell. Mol. Life Sci. 69 (22), 3715-3737 (2012).
- Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Neural crest induction at the neural plate border in vertebrates. Dev. Biol. 366 (1), 22-33 (2012).
- Pegoraro, C., Monsoro-Burq, A. H. Signaling and transcriptional regulation in neural crest specification and migration: lessons from Xenopus embryos. Dev. Biol. 2 (2), 247-259 (2013).
- Etchevers, H. C., Amiel, J., Lyonnet, S. Molecular Bases of Human Neurocristopathies. Neural Crest Induct. Different. 589, 213-234 (2005).
- Nieuwkoop, P. D., et al. Activation and organization of the central nervous system in amphibians. Part II. Differentiation and organization. J. Exp. Zool. 120 (1), 33-81 (1952).
- Nieuwkoop, P. D., et al. Activation and organization of the central nervous system in amphibians Part I. Induction and activation. J. Exp. Zool. 120 (1), 1-31 (1952).
- Sharpe, C. R., Fritz, A., De Robertis, E. M., Gurdon, J. B. A homeobox-containing marker of posterior neural differentiation shows the importance of predetermination in neural induction. Cell. 50 (5), 749-758 (1987).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , (2000).
- Monsoro-Burq, A. -. H., Fletcher, R. B., Harland, R. M. Neural crest induction by paraxial mesoderm in Xenopus embryos requires FGF signals. Development. 130 (14), 3111-3124 (2003).
- Milet, C., Maczkowiak, F., Roche, D. D., Monsoro-Burq, A. H. Pax3 and Zic1 drive induction and differentiation of multipotent, migratory, and functional neural crest in Xenopus embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (14), 5528-5533 (2013).
- Sadaghiani, B., Thiébaud, C. H. Neural crest development in the Xenopus laevis embryo, studied by interspecific transplantation and scanning electron microscopy. Dev. Biol. 124 (1), 91-110 (1987).
- Theveneau, E., et al. Collective chemotaxis requires contact-dependent cell polarity. Dev. Cell. 19 (1), 39-53 (2010).
- Slack, J. M., Forman, D. An interaction between dorsal and ventral regions of the marginal zone in early amphibian embryos. J. Embryol. Exp. Morphol. 56, 283-299 (1980).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH Protoc. , (2007).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1994).
- Theveneau, E., Mayor, R. Beads on the run: beads as alternative tools for chemotaxis assays. Methods Mol. Biol. 769, 449-460 (2011).
- Bronner, M. E., LeDouarin, N. M. Development and evolution of the neural crest: An overview. Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).
- Alfandari, D., Cousin, H., Gaultier, A., Hoffstrom, B. G., DeSimone, D. W. Integrin α5β1 supports the migration of Xenopus cranial neural crest on fibronectin. Dev. Biol. 260 (2), 449-464 (2003).
- Fort, P., et al. Activity of the RhoU/Wrch1 GTPase is critical for cranial neural crest cell migration. Dev. Biol. 350 (2), 451-463 (2011).
- Matthews, H. K., et al. Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA. Development. 135 (10), 1771-1780 (2008).
- Kashef, J., Köhler, A., Kuriyama, S., Alfandari, D., Mayor, R., Wedlich, D. Cadherin-11 regulates protrusive activity in Xenopus cranial neural crest cells upstream of Trio and the small GTPases. Genes Dev. 23 (12), 1393-1398 (2009).
- Hwang, Y. -. S., Luo, T., Xu, Y., Sargent, T. D. Myosin-X is required for cranial neural crest cell migration in Xenopus laevis. Dev. Dyn. 238 (10), 2522-2529 (2009).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
- Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling Neural Crest Induction, Melanocyte Specification, and Disease-Related Pigmentation Defects in hESCs and Patient-Specific iPSCs.. Cell Reports. 3 (4), 1140-1152 (2013).
- Shnitsar, I., Borchers, A. PTK7 recruits dsh to regulate neural crest migration. Development. 135 (24), 4015-4024 (2008).
- Matthews, H. K., et al. Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA. Development. 135 (10), 1771-1780 (2008).
- Matthews, H. K., Broders-Bondon, F., Thiery, J. P., Mayor, R. Wnt11r is required for cranial neural crest migration. Dev. Dyn. 237 (11), 3404-3409 (2008).
- Carmona-Fontaine, C., et al. Contact inhibition of locomotion in vivo controls neural crest directional migration. Nature. 456 (7224), 957-961 (2008).
- Guiral, E. C., Faas, L., Pownall, M. E. Neural crest migration requires the activity of the extracellular sulphatases XtSulf1 and XtSulf2. Dev. Biol. 341 (2), 375-388 (2010).
- Cousin, H., Abbruzzese, G., Kerdavid, E., Gaultier, A., Alfandari, D. Translocation of the Cytoplasmic Domain of ADAM13 to the Nucleus Is Essential for Calpain8-a Expression and Cranial Neural Crest Cell Migration. Dev. Cell. 20 (2), 256-263 (2011).
- Borchers, A., David, R., Wedlich, D. Xenopus cadherin-11 restrains cranial neural crest migration and influences neural crest specification. Development. 128 (16), 3049-3060 (2001).
- Borchers, A., Epperlein, H. -. H., Wedlich, D. An assay system to study migratory behavior of cranial neural crest cells in Xenopus. Dev. Genes Evol. 210 (4), 217-222 (2000).
- Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. Runx2 is essential for larval hyobranchial cartilage formation in Xenopus laevis. Dev. Dyn. 236 (6), 1650-1662 (2007).
- Yan, C. Y. I., Skourides, P., Chang, C., Samba Brivanlou, A. a Xenopus hnRNP expressed in neural and neural crest tissues. Dev. Dyn. 238 (1), 204-209 (2009).
- Acloque, H., Adams, M. S., Fishwick, K., Bronner-Fraser, M., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions: the importance of changing cell state in development and disease. J. Clin. Invest. 119 (6), 1438-1449 (2009).
