Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تشريح Published: March 4, 2014 doi: 10.3791/51118
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,3,4
1Institut Curie, Centre Universitaire, 2Université Paris Sud, Centre Universitaire, 3CNRS UMR 3347, Centre Universitaire, 4INSERM U1021, Centre Universitaire

Summary

يصف هذا البروتوكول كيفية تشريح premigratory قمة العصبية القحفية (NC) من القيطم neurulas المورق. هذه إإكسبلنتس يمكن مطلي على فبرونيكتين وتربيتها في المختبر، أو المطعمة مرة أخرى إلى الأجنة المضيفة. هذه التقنية تسمح بدراسة آليات NC ظهارة إلى اللحمة المتوسطة التي تمر بمرحلة انتقالية، والهجرة، والتمايز.

Abstract

قمة العصبية (NC) هو السكان الخلية الظهرية الأنبوب العصبي عابرة أن يخضع لظهارة الانتقالية إلى اللحمة المتوسطة (EMT) في نهاية تكون العصيبة، على نطاق واسع يهاجر نحو مختلف الأجهزة، ويميز في العديد من أنواع المشتقات (الخلايا العصبية، الدبقية، الغضاريف والعظام، والخلايا الصباغية والغدد الصماء). في هذا البروتوكول، ونحن تصف كيفية تشريح الجمجمة NC premigratory من الأجنة القيطم المورق، من أجل دراسة تطوير NC في الجسم الحي في المختبر. نموذج الضفدع توفر العديد من المزايا لدراسة التطور المبكر؛ هي دفعات وفيرة والأجنة تتطور بسرعة، في الجسم الحي الربح والخسارة من وظيفة تسمح استراتيجيات التلاعب في التعبير الجيني قبل NC في تشريح المانحة و / أو الأجنة المضيفة. لل explants NC يمكن مطلي على فبرونيكتين وتستخدم لفي الدراسات المختبرية. أنها يمكن تربيتها لعدة أيام في وسط المصل خالية محددة. نحن أيضا تصف كيفية الكسب غير المشروع إإكسبلنتس NC العودةفي الأجنة المضيفة لدراسة الهجرة NC والتمايز في الجسم الحي.

Introduction

قمة العصبية (NC) هي الخلايا الجنينية عابرة السكان أن يخرج من الأنبوب العصبي في نهاية تكون العصيبة في أجنة الفقاريات. الأحداث إشارات والوراثية التي تتحكم في مواصفات NC تبدأ في وقت مبكر تكون المعيدة. يتم تحديد NC على الحدود بين العصبية والأديم الظاهر غير العصبية التي كتبها إشارات من الأنسجة المحيطة الظهرية. في نهاية تكون العصيبة، والخلايا NC الخضوع لظهارة الانتقال إلى اللحمة المتوسطة (EMT) والهجرة على نطاق واسع في الجنين التالية الطرق النمطية من خلال الاستجابة لتوجيه العظة المحيطة. بمجرد أن وصلت إلى وجهتها النهائية، فإنها تفرق في مجموعة واسعة من المشتقات، مثل الخلايا العصبية، الدبقية والعظام والغضاريف، والخلايا الصباغية 1-5. بسبب مساهمتها في العديد من أنواع الخلايا والأنسجة الجنينية، والعيوب في أي خطوة من تطوير خلايا NC، من الحث على التمايز النهائي، يمكن أن يسبب أعراض الخلقية اسمه neurocristopathies 6. Eالتلاعب xperimental من NC النامية في مراحل مختلفة - مواصفات، EMT، والهجرة، والتمايز - من شأنها تحسين فهمنا للneurocristopathies والسماح تصميم الاستراتيجيات العلاجية المحتملة.

والمورق القيطم الجنين هو نموذج من خيار لدراسة تطوير NC. أعداد كبيرة من الأجنة من السهل الحصول عليها، والإخصاب الخارجي يتيح الوصول إلى الخطوات الأولى من التنمية. العديد من الأدوات المتاحة لمعالجة تجريبيا اكس. المورق التطور الجنيني. مكسب من وظيفة وضربة قاضية الجينات هي سهلة لأداء microinjecting بواسطة الخلايا الفردية من blastulas في وقت مبكر. ويمكن خفض الأنسجة الجنينية في المختبر لإعادة الترابط 7-11 أو ترقيع العودة المقايسات 12،13.

في هذا البروتوكول، ونحن تصف كيفية تشريح خارج premigratory NC في الجمجمة X. المورق neurulas في وقت متأخر، قبل الهجرة. يمكن تربيتها هذه إإكسبلنتس على فبرونيكتين-coateلوحات د لدراسة الهجرة وتمايز في التحكم في ظروف تجريبية المختبر. ويمكن أيضا أن المطعمة إإكسبلنتس NC في الأجنة المضيفة العادي أو التلاعب بها لدراسة هجرتها والتمايز في الجسم الحي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تجارب الامتثال التنظيم الوطنية والأوروبية لحماية الحيوانات المستخدمة لأغراض علمية ومع المبادئ المعمول بها دوليا من استبدال، والحد من والصقل.

1. إعداد أطباق فبرونيكتين المغلفة-14

  1. ماصة 500 مل من 10 ملغ / مل ثقافة الصف فبرونيكتين المخفف في 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في طبق بتري البلاستيكية القياسية (Ø 40 × 11 مم). احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. ملاحظة: في حالة استخدام الأطباق الزجاجية أو coverslips الزجاج للتصوير لاحقة، واستخدام 100 ملغ / مل حل فبرونيكتين.
  2. شطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X.
  3. استبدال برنامج تلفزيوني مع 500 مل من 1X PBS/0.1٪ الأبقار مصل الزلال (BSA). احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  4. شطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X.
  5. ملء مع برنامج تلفزيوني 1X والحفاظ على 4 درجات مئوية حتى استخدام (عادة لمدة 24-48 ساعة).

2. تشريح إإكسبلنتس NC

<رأ>
  • إعداد 3/4 عادي البرمائيات متوسطة (NAM) (110 ملي مول كلوريد الصوديوم، 2 مم بوكل، 1 ملي كا (NO 3) 2، 1 ملم MgSO 4، 0.1 ملي EDTA، 1 مم 3 NaHCO، 0.2x برنامج تلفزيوني، 50 ملغ / مل جنتاميسين 10،15). لا تبقي أكثر من 1 في الاسبوع للتشريح، المحل في 4 درجات مئوية. أقدم حركة عدم الانحياز يمكن أن تستخدم لإعداد أطباق تشريح المغلفة الاغاروز (أدناه).
  • إعداد 60 ملم أطباق بتري لتشريح، المغلفة مع 10 مل من 2٪ الاغاروز في 3/4 حركة عدم الانحياز.
  • جمع أدوات تشريح: ماصات باستور البلاستيك، شنت أرقى دبوس الحشرات على حامل دبوس (انظر الجدول مواد للمرجعية)، وهي "سكين الحاجب" (المصنوع من شعر الحاجب جزءا لا يتجزأ من البارافين في غيض من ماصة باستير الزجاج 16)، واثنين من الغرامة ملقط تشريح، ماصة P1000 ونصائح، المجسام مجهر مع التكبير 40X-8 إلى 50، مصدر الضوء الساطع مع أدلة الألياف البصرية. يجب أن تبقى جميع الأدوات تشريح نظيفة، وبعد كل تجربة، وشطف لهم مرتين مع الماء المقطر، مرة واحدة وايال 100٪ من الإيثانول واسمحوا الجافة. تخزين بعيدا عن الغبار.
  • ملء طبق تشريح مع حركة عدم الانحياز جديدة تقريبا إلى الأعلى.
  • الحصول على X. المورق الأجنة وفقا للاجراءات المتبعة 10 والسن منهم حتى بلوغهم المرحلة العصيبة 16 (وفقا لNieuwkoop وفابر الجدول التنموية 17).
  • وضع المرحلة 16 الأجنة في طبق تشريح باستخدام البلاستيك ماصة باستير.
  • تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة ضمن نطاق مجهر. إزالة الغشاء المحي مع اثنين من أزواج من ملقط. يجب الحرص على عدم تلف جزء الظهري للأجنة.
  • انتظر حتى وصلت إلى مرحلة الأجنة 17 لبدء تشريح. المرحلة 17 من المناسب منذ تم تعيين بوضوح قمة العصبية وبصرف النظر عن الأنبوب العصبي، وعلى النقيض من المراحل السابقة. بعد المرحلة 17، NC يبدأ الهجرة والاختلاط مع اللحمة المتوسطة المحيطة بها.
  • حفر حفرة صغيرة في الاغاروز مع ملقط لجعل مكانة لأجنة من أجل الحفاظ علىلهم أثناء تشريح. مكان واحد الجنين حتى الجانب الظهري. ملاحظة: الصلصال يمكن استخدامها للحفاظ على الأجنة بدلا حفر حفرة في الاغاروز.
  • إجراء شق في الجزء الجانبي من حظيرة العصبية الأمامي مع سكين الحاجب ودبوس الحشرات. الحرص على عدم ذهاب عميق جدا في الجنين: تهدف إلى خفض خلال 2-3 طبقات الخلية (لم تصل عميقة كما في المعى البدائي!) أثناء عملية تشريح كاملة، أبدا السماح للأنسجة تشريح للدخول في اتصال مع واجهة الهواء السائل منذ X. والأنسجة الجنينية هي lysed المورق كتبها التوتر السطحي.
  • جعل شق مواز الثاني في أكثر الظهرية جزء من العصبية أضعاف باستخدام نفس الأدوات.
  • إذا لزم الأمر، وتحويل طبق حوالي 90 درجة. جعل شق عمودي الثالث مع سكين الحاجب ودبوس الحشرات، في الجانب الخلفي من شقوق الأولين. وNC هو كتلة سميكة من الخلايا تحت الطبقة الخارجية من الأديم الظاهر المصطبغة، الوحشيإلى الأنبوب العصبي.
  • استخدام غيض من سكين الحاجب لفصل طبقة الأديم الظاهر المصطبغة من NC الأساسية، بدءا من حافة شق ثالث.
  • استخدام جانب سكين الحاجب لفصل الأنسجة NC بدءا من شق ثالث. الأنسجة NC هو رمادي بدلا من ذلك، في حين أن الأديم المتوسط ​​رأسي الأساسي هو الأبيض. فصل بعناية NC من الأديم المتوسط.
  • فصل الأنسجة NC الأمامية من الحويصلة البصرية، وقطع على هذا المستوى لتحرير ازدراع. كعنصر تحكم عن التجارب الأولى، والتحقق من التعبير snail2 (أ NC علامة الكنسي) في بعض إإكسبلنتس بواسطة التهجين في الموقع ويوصى.

    • 3. طلي إإكسبلنتس على فيبرونكتين]

    1. تعبئة في طبق المغلفة فبرونيكتين مع التعديل Danilchick متوسطة (MDM، كلوريد الصوديوم 53 ملي، Na2CO 3 5 ملم، K غلوكونات 4.5 ملم، 32 ملم غلوكونات الصوديوم، MgSO 4 1 ملم، و CaCl 2 1 ملم، 0.1٪ BSA، وضبط درجة الحموضة إلى 8.3 مع 1 M Bicine
    2. نقل لل explants في طبق المغلفة فبرونيكتين باستخدام ماصة P1000. لم تسمح لل explants للمس واجهة الهواء السائل. الأولى، ماصة بعض السائل إلى الحافة، ثم لل explants، ثم بعض السائل مرة أخرى. لا تسمح لأي طرف في الهواء أثناء نقل لل explants في طبق المغلفة فبرونيكتين. مرة واحدة غيض داخل السائل من صحن المغلفة فبرونيكتين، والسماح لل explants يذهب ببطء عن طريق الجاذبية، أو دفع بلطف شديد. تجنب إخراج لل explants سريع جدا.
    3. وضع 10-30 إإكسبلنتس في الطبق باستخدام سكين الحاجب. تجنب جوانب الطبق، والتي هي غير كافية للتصوير اللاحقة.
    4. ليس محاولة لتحريك الطبق حتى تعلق لل explants على فبرونيكتين (يستغرق حوالي 15-30 دقيقة). إذا لزم الأمر، قم بتحريك الطبق بعناية فائقة.
    5. وضع الطبق في الحاضنة المبردة (بين 15-20 درجة مئوية، ودرجة الحرارة الرسم البياني لنرى 17). عندما وضعت في 15 درجة مئوية، وخلايا عه عادة المهاجرة بكفاءة ونثر بعد 6 ساعة من الحضانة (قد تختلف هذا التوقيت بين التجارب).

    4. تطعيم إإكسبلنتس في الأجنة المضيف

    1. قطع ساترة الزجاج غرامة الى قطع صغيرة جدا باستخدام ملقط الخشنة. حجم القطع يجب أن يكون ما يقرب من 1.5 مم 2. تزج القطع في طبق بتري تحتوي على 3/4 حركة عدم الانحياز أو برنامج تلفزيوني باستخدام ملقط.
    2. إعداد الجنين المضيف: تشريح خارج NC المضيفة في 3/4 كما هو موضح في حركة عدم الانحياز 3) مع عناية خاصة لا تضر الجنين المضيف أثناء إزالة الغشاء المحي وتشريح NC. التوتر الأنسجة يميل إلى زيادة حجم الاجتثاث: لندع الجنين المضيف شفاء جزئيا في حين تشريح الجنين المانحة.
    3. في طبق المغلفة الاغاروز آخر أو في جزء آخر من نفس الطبق، تشريح خارج يزدرع NC من الجنين المانحة كما هو موضح في البروتوكول 3. نقل الكسب غير المشروع NC في طبق يحتوي على المضيف مع الرعاية، كما هو موضح فيبروتوكول 3.
    4. وضع على الفور يزدرع NC على منطقة ذاب المضيف باستخدام ملقط. ازدراع يجب إرفاق جزئيا. وضع قطعة من الزجاج ساترة على الجنين المطعمة للحفاظ على الكسب غير المشروع في المكان. اختيار قطعة من الزجاج أكبر من الجنين لتجنب الإضرار بها. فإن الجنين يكون قليلا بالارض.
    5. الانتظار لمدة 15-20 دقيقة على الأقل، ثم إزالة بلطف ساترة. دعونا الجنين استرداد لمدة 10 دقيقة أخرى وماصة بعناية في طبق نظيف مليئة 3/4 حركة عدم الانحياز، وذلك باستخدام البلاستيك ماصة باستير.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    عندما مطلي على فبرونيكتين، لل explants قمة العصبية إرفاق بسرعة (15-30 دقيقة) وازدراع ينتشر داخل شقة 2 ساعة (الشكل 1A). بعد 3-6 ساعة تبدأ في الخلايا مبعثر. في 24 ساعة عند 15 درجة مئوية، وقد بدأت العديد من الخلايا لتهاجر بعيدا عن ازدراع (الأرقام 1B و 1C). صفار يجعل الخلايا مشرق جدا تحت النقيض من المرحلة (الشكل 1B). نتوءات الخلية (filopodes وlamellipodes) واضحة للعيان بعد تلطيخ phalloidin من الهيكل الخلوي الأكتين (الشكل 1C).

    للتجربة تطعيم مثلي، تم حقن الأجنة المانحة مع GFP مرنا من أجل متابعة الخلايا المطعمة في الجنين المضيف غير المسماة. وقد ذاب في الجمجمة NC على جانب واحد من المضيف؛ 30-60 دقيقة بعد عملية جراحية تعافى الكسب غير المشروع، لتحل محل المضيف ذاب الجمجمة NC (الشكل 1D، 2 ساعة بعد التطعيم). وبعد بضع ساعات، هاجروا الخلايا GFP إيجابيةالخروج من ازدراع واتبعت طرق الهجرة النمطية للخلايا NC نحو مواقع القحفي بطني (الشكل 1E). في الضفادع الصغيرة، وضعت هياكل القحفي NC-مشتقة (الشكل 1G). عندما ذاب الجمجمة NC، وهذه الهياكل في عداد المفقودين، مما أدى إلى تقصير وجه مع العين المجاورة للغدة الاسمنت (الشكل 1H، السهام الحمراء). في الضفادع الصغيرة المطعمة، ساهمت خلايا NC المانحة إلى هياكل القحف الوجهي، مما أدى إلى وجهه مورفولوجيا العادي (أرقام 1F و1I، الأسهم الخضراء).

    الشكل 1
    الشكل 1. في المختبر والمجراة في السلوك من explanted NC الجمجمة. AC)   وكان تشريح Premigratory NCالخروج من مرحلة الجنين 17 العصيبة ومطلي على طبق المغلفة فبرونيكتين. A) 2 ساعة بعد الطلاء، وتولى ازدراع وانتشارها. B) 24 ساعة بعد الطلاء، وخلايا هاجروا بكفاءة على فبرونيكتين. C) أقدام صفاحية وأرجل كاذبة خيطية وينظر بشكل واضح في الخلايا المهاجرة NC المسمى مع phalloidin (الأخضر) المرحلة DI) العصيبة 17 GFP + المسمى اتخذ premigratory NC من الجنين حقن GFP والمطعمة مرة أخرى إلى الجنين المضيف، الذي تم ذاب الجمجمة NC في مرحلة 17 - 18. D) بعد ساعتين من التطعيم، وقد شفى ازدراع. هاجروا الخلايا EF) المطعمة NC بنشاط وتعبئة تيار الفك السفلي كما هو مبين في مرحلة الشرغوف 31 و 41. المرحلة G) مراقبة 41 الشرغوف. H) الذوبان في نورث كارولاينا و أدى إلى الفشل الكبير في الوجه والعين التنمية (H: نلاحظ أن GLAN الأسمنتد تطور المجاورة للعين، وذلك بسبب عدم وجود خلايا NC ملء المناطق الفك، السهام الحمراء. . مقارنة للسيطرة الشرغوف في G) F، I) وفي المقابل، واستعادة الخلايا المطعمة NC العين والتنمية هياكل القحفي (F، I، الأسهم الخضراء) AC، أشرطة النطاق = 100 مم؛ DI، مقياس بار = 1 ملم دال، عرض الظهرية. EI وجهات نظر الجانب. تم تعديل هذا الرقم من Milet وآخرون 12 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    يصف هذا البروتوكول تقنية سهلة لازدراع premigratory الجمجمة NC في اكس الأجنة المورق. الأجنة المستخدمة في مثل هذه التجارب تحتاج إلى أن تكون قوية وتلتئم بشكل جيد. تجاهل أي دفعة من الأجنة غير صحية. بالإضافة إلى ذلك، تنمو الأجنة في درجات حرارة مختلفة (من 12 إلى 18-20 درجة مئوية)، من أجل استئصال قمة العصبية في المرحلة 17 وليس في وقت لاحق. بعد المرحلة 17، قد تكون مختلطة مع قمة العصبية الأديم المتوسط ​​رأسي ولا يمكن إزالتها تماما. الأنسجة القيطم تلتئم بسرعة ومن ثم تفقد التصاق بهم إلى الأنسجة الأخرى. من المهم أن تعمل بسرعة ووضع إإكسبلنتس قمة العصبية في المضيف بمجرد أن يتم رفعه فإنه من الجهة المانحة.

    فيما يتعلق في تجارب المختبر، ويمكن الحصول على أطباق الثقافة فبرونيكتين الملوثة بالبكتيريا أو الفطريات بعد بضعة أيام. استخدام المواد والحلول المضادات الحيوية ونظيفة أو معقمة كلما كان ذلك ممكنا.

    هو الأمثل هذا الإجراء وأو قمة العصبية في الجمجمة. في الواقع، هذه الفئة من السكان الخلية ويعرف جيدا والمترجمة في المرحلة 17 الأجنة القيطم. للأسف، وهذا النموذج ليس مناسبا لإجراء مثل هذه التجارب على الجذع NC. أجنة الطيور هي أكثر مناسبة لأولئك الذين يرغبون في التلاعب مثل جذع السكان الخلية NC.

    لل explants الموصوفة في هذا البروتوكول يمكن استخدامها لدراسة جوانب مختلفة من السلوك NC، سواء في الجسم الحي في المختبر. يتم حفظها البرنامج التنموي الجزيئي NC إلى حد كبير في الفقاريات 19. التنمية الضفدع هو نموذج قوي لدراسة الفقاريات NC EMT، والهجرة والتمايز. X. الخلايا الجنينية المورق تحتوي على صفار بما يكفي للسماح بقائهم على قيد الحياة في المختبر لعدة أيام دون إضافة أي المغذيات الخارجية. وبالتالي، يمكن أن الدراسات في المختبر اختبار تأثير عوامل النمو المختلفة أو المركبات الكيميائية، في مستنبت بسيطة وتسيطر عليها بالكامل. وكانت مثل هذه التجاربتهدف إلى تحليل EMT والهجرة، بما في ذلك دراسة آثار الكيماوي جاذبة أو الكيماوي طارد، تفعيل أو عرقلة مسارات الإشارات، الخ 14،20-24 يمكن أيضا أن هذا النهج أن تستخدم لتحسين تصميم بروتوكولات التمايز الموجهة NC. في سياق وضع بروتوكولات للطب التجديدي، والحصول على أنواع الخلايا المشتقة من NC المتنوعة في المختبر يمكن أن تستخدم في فحص المخدرات لفهم وعلاج neurocristopathies 25،26.

    ودبرت التنمية NC بواسطة تفاعل معقد بين الخلايا وائح الحكم الذاتي وإشارات من الأنسجة المحيطة بها. التلاعب التجريبية في التعبير الجيني، سواء في NC المانحة أو في الجنين المضيف، والسماح الخلية التمييز الحكم الذاتي من جوانب الحكم الذاتي noncell التنمية NC. الجمع بين المكسب من وظيفة وتدق إلى أسفل النهج لهذا البروتوكول للثقافة في المختبر والمجراة في تطعيم تم استخدام بنجاحد 14،21،23،27-36.

    هذه التقنية يمكن تكييفها لتطعيم الأنسجة الأخرى في الأجنة المضيفة واختبار للهجرة والتمايز إمكاناتها. على سبيل المثال، استخدمنا المحفزة الأديم الظاهر سقف blastocoel (في "الغطاء الحيواني") للبحث عن مفتاح النسخي الحد الأدنى من أجل التنمية NC. درسنا تأثير اثنين من عوامل النسخ، pax3 وzic1، على التزام NC والتطور اللاحق. كانت مطلية القبعات الحيوان مع pax3 وzic1 مكاسب من وظيفة على فبرونيكتين في المختبر أو backgrafted في الأجنة المضيفة. وجدنا أن الخلايا Pax3/Zic1-induced تهاجر والتفريق مثل حسن النية الخلايا NC على حد سواء في التجارب المختبرية والأجنة المضيفة 12.

    وتشارك العديد من الآليات الجزيئية التي تتحكم NC EMT والهجرة أيضا في نشر المنتشر في سرطان 37. ويهدف هذا البروتوكول إلى توفير بسيطة ورخيصة وefficiأداة الأنف والحنجرة لعلماء البيولوجيا التطورية وغيرهم من الباحثين في استكشاف الآليات الأساسية لهذه السلوكيات الخلية الرئيسية.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

    Acknowledgments

    المؤلفين أشكر أدلين دوللي للصور من يزدرع على فبرونيكتين، اريك Theveneau لإجراء مناقشات مفيدة ومرفق الحيوان من معهد كوري. CM هو زميل ما بعد الدكتوراه لمنطقة إيل دي فرانس (دومين من أجل المصلحة فيل الجذعية القطب)، جامعة باري سود (الملحق Temporaire كوت ENSEIGNEMENT آخرون للبحوث)، والوكالة الوطنية للبحوث لا. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل جامعة باري سود (Attractivite 2011)، والمركز الوطني للبحوث العلميه (برنامج العمل Thematique آخرون Incitative سور)، والرابطة من أجل لا مناهضة بحوث السرطان جنيه منحة SFI20101201882، الدوري الفرنسي الدرجة مناهضة جنيه للسرطان، والوكالة الوطنية دي لا بحوث (الوكالة الوطنية للبحوث برنامج لا بلان).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Fibronectin from bovine plasma Sigma F4759-1MG
    Bovine Serum Albumin, Fraction V Euromedex 04-100-811-C Lower quality grade may  be suitable for this application
    Stainless Steel Insect Pins, Size 000 FST 26001
    Dumont #5 forceps 0.05 mm x 0.02 mm FST 11252-20

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (7), 557-568 (2008).
    2. Theveneau, E., Mayor, R. Neural crest delamination and migration: from epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration. Dev. Biol. 366 (1), 34-54 (2012).
    3. Stuhlmiller, T. J., García-Castro, M. I. Current perspectives of the signaling pathways directing neural crest induction. Cell. Mol. Life Sci. 69 (22), 3715-3737 (2012).
    4. Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Neural crest induction at the neural plate border in vertebrates. Dev. Biol. 366 (1), 22-33 (2012).
    5. Pegoraro, C., Monsoro-Burq, A. H. Signaling and transcriptional regulation in neural crest specification and migration: lessons from Xenopus embryos. Dev. Biol. 2 (2), 247-259 (2013).
    6. Etchevers, H. C., Amiel, J., Lyonnet, S. Molecular Bases of Human Neurocristopathies. Neural Crest Induct. Different. 589, 213-234 (2005).
    7. Nieuwkoop, P. D., et al. Activation and organization of the central nervous system in amphibians. Part II. Differentiation and organization. J. Exp. Zool. 120 (1), 33-81 (1952).
    8. Nieuwkoop, P. D., et al. Activation and organization of the central nervous system in amphibians Part I. Induction and activation. J. Exp. Zool. 120 (1), 1-31 (1952).
    9. Sharpe, C. R., Fritz, A., De Robertis, E. M., Gurdon, J. B. A homeobox-containing marker of posterior neural differentiation shows the importance of predetermination in neural induction. Cell. 50 (5), 749-758 (1987).
    10. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2000).
    11. Monsoro-Burq, A. -H., Fletcher, R. B., Harland, R. M. Neural crest induction by paraxial mesoderm in Xenopus embryos requires FGF signals. Development. 130 (14), 3111-3124 (2003).
    12. Milet, C., Maczkowiak, F., Roche, D. D., Monsoro-Burq, A. H. Pax3 and Zic1 drive induction and differentiation of multipotent, migratory, and functional neural crest in Xenopus embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (14), 5528-5533 (2013).
    13. Sadaghiani, B., Thiébaud, C. H. Neural crest development in the Xenopus laevis embryo, studied by interspecific transplantation and scanning electron microscopy. Dev. Biol. 124 (1), 91-110 (1987).
    14. Theveneau, E., et al. Collective chemotaxis requires contact-dependent cell polarity. Dev. Cell. 19 (1), 39-53 (2010).
    15. Slack, J. M., Forman, D. An interaction between dorsal and ventral regions of the marginal zone in early amphibian embryos. J. Embryol. Exp. Morphol. 56, 283-299 (1980).
    16. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH Protoc. , (2007).
    17. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , Garland Pub. New York. (1994).
    18. Theveneau, E., Mayor, R. Beads on the run: beads as alternative tools for chemotaxis assays. Methods Mol. Biol. 769, 449-460 (2011).
    19. Bronner, M. E., LeDouarin, N. M. Development and evolution of the neural crest: An overview. Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).
    20. Alfandari, D., Cousin, H., Gaultier, A., Hoffstrom, B. G., DeSimone, D. W. Integrin α5β1 supports the migration of Xenopus cranial neural crest on fibronectin. Dev. Biol. 260 (2), 449-464 (2003).
    21. Fort, P., et al. Activity of the RhoU/Wrch1 GTPase is critical for cranial neural crest cell migration. Dev. Biol. 350 (2), 451-463 (2011).
    22. Matthews, H. K., et al. Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA. Development. 135 (10), 1771-1780 (2008).
    23. Kashef, J., Köhler, A., Kuriyama, S., Alfandari, D., Mayor, R., Wedlich, D. Cadherin-11 regulates protrusive activity in Xenopus cranial neural crest cells upstream of Trio and the small GTPases. Genes Dev. 23 (12), 1393-1398 (2009).
    24. Hwang, Y. -S., Luo, T., Xu, Y., Sargent, T. D. Myosin-X is required for cranial neural crest cell migration in Xenopus laevis. Dev. Dyn. 238 (10), 2522-2529 (2009).
    25. Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
    26. Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling Neural Crest Induction, Melanocyte Specification, and Disease-Related Pigmentation Defects in hESCs and Patient-Specific iPSCs. Cell Reports. 3 (4), 1140-1152 (2013).
    27. Shnitsar, I., Borchers, A. PTK7 recruits dsh to regulate neural crest migration. Development. 135 (24), 4015-4024 (2008).
    28. Matthews, H. K., et al. Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA. Development. 135 (10), 1771-1780 (2008).
    29. Matthews, H. K., Broders-Bondon, F., Thiery, J. P., Mayor, R. Wnt11r is required for cranial neural crest migration. Dev. Dyn. 237 (11), 3404-3409 (2008).
    30. Carmona-Fontaine, C., et al. Contact inhibition of locomotion in vivo controls neural crest directional migration. Nature. 456 (7224), 957-961 (2008).
    31. Guiral, E. C., Faas, L., Pownall, M. E. Neural crest migration requires the activity of the extracellular sulphatases XtSulf1 and XtSulf2. Dev. Biol. 341 (2), 375-388 (2010).
    32. Cousin, H., Abbruzzese, G., Kerdavid, E., Gaultier, A., Alfandari, D. Translocation of the Cytoplasmic Domain of ADAM13 to the Nucleus Is Essential for Calpain8-a Expression and Cranial Neural Crest Cell Migration. Dev. Cell. 20 (2), 256-263 (2011).
    33. Borchers, A., David, R., Wedlich, D. Xenopus cadherin-11 restrains cranial neural crest migration and influences neural crest specification. Development. 128 (16), 3049-3060 (2001).
    34. Borchers, A., Epperlein, H. -H., Wedlich, D. An assay system to study migratory behavior of cranial neural crest cells in Xenopus. Dev. Genes Evol. 210 (4), 217-222 (2000).
    35. Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. Runx2 is essential for larval hyobranchial cartilage formation in Xenopus laevis. Dev. Dyn. 236 (6), 1650-1662 (2007).
    36. Yan, C. Y. I., Skourides, P., Chang, C., Samba Brivanlou, A. a Xenopus hnRNP expressed in neural and neural crest tissues. Dev. Dyn. 238 (1), 204-209 (2009).
    37. Acloque, H., Adams, M. S., Fishwick, K., Bronner-Fraser, M., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions: the importance of changing cell state in development and disease. J. Clin. Invest. 119 (6), 1438-1449 (2009).

    Tags

    علم الأحياء التنموي، العدد 85، العصبية قمة،
    تشريح<em&gt; القيطم المورق</em&gt; العصبية كريست ل<em&gt; في المختبر</em&gt; يزدرع الثقافة أو<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; زرع
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Milet, C., Monsoro-Burq, A. H.… More

    Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation. J. Vis. Exp. (85), e51118, doi:10.3791/51118 (2014).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter