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Biology

La disección de Published: March 4, 2014 doi: 10.3791/51118
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,3,4
1Institut Curie, Centre Universitaire, 2Université Paris Sud, Centre Universitaire, 3CNRS UMR 3347, Centre Universitaire, 4INSERM U1021, Centre Universitaire

Summary

Este protocolo describe cómo diseccionar la cresta neural craneal premigratorio (NC) de neurulas Xenopus laevis. Estos explantes se pueden sembrar en fibronectina y cultivadas in vitro, o injertados en embriones de acogida. Esta técnica permite el estudio de los mecanismos de la NC transición epitelio-mesénquima, la migración y la diferenciación.

Abstract

La cresta neural (NC) es una población de células dorsal del tubo neural transitoria que sufre una transición epitelio-mesénquima (EMT) al final de la neurulación, migra ampliamente hacia diversos órganos, y se diferencia en muchos tipos de derivados (neuronas, neuroglia, cartílago y hueso, células pigmentadas y endocrinos). En este protocolo, se describe la forma de diseccionar la premigratorio craneal NC a partir de embriones de Xenopus laevis, con el fin de estudiar el desarrollo de NC in vivo e in vitro. El modelo de la rana ofrece muchas ventajas para estudiar el desarrollo temprano; abundantes lotes están disponibles, los embriones se desarrollan rápidamente, ganancia in vivo y la pérdida de las estrategias de función permiten la manipulación de la expresión génica antes de la disección NC en donante y / o embriones de acogida. Los explantes de NC se pueden sembrar en fibronectina y utilizados para estudios in vitro. Ellos pueden cultivarse durante varios días en un medio definido libre de suero. También describe cómo injertar explantes NC espaldaen embriones de acogida para el estudio de NC migración y diferenciación in vivo.

Introduction

La cresta neural (NC) es una población de células embrionarias transitoria que emerge del tubo neural en el extremo del tubo neural en embriones de vertebrados. Los eventos de señalización y genéticos que controlan la especificación NC comenzar tan pronto como la gastrulación. La NC se especifica en la frontera entre el ectodermo neural y no neural por las señales de los tejidos que rodean dorsales. Al final de la neurulación, NC células se someten a una transición epitelio-mesénquima (EMT) y migran extensamente en el embrión siguientes rutas estereotipadas de responder a las señales de guía circundante. Una vez que han llegado a su destino final, se diferencian en una amplia gama de derivados, por ejemplo, neuronas, células gliales, huesos, cartílagos y células pigmentadas 1-5. Debido a su contribución a muchos tipos de células y tejidos embrionarios, defectos en cualquier trámite del desarrollo de células NC, desde la inducción de la diferenciación final, puede causar síndromes congénitos con nombre neurocristopathies 6. Emanipulación Xperimental del NC en desarrollo en diferentes etapas - de especificación, EMT, migración y diferenciación - mejorará nuestra comprensión de neurocristopathies y permitir el diseño de estrategias terapéuticas potenciales.

El embrión de Xenopus laevis es un modelo de elección para estudiar el desarrollo de NC. Un gran número de embriones son fáciles de obtener, y la fertilización externa da acceso a las primeras etapas de desarrollo. Muchas herramientas están disponibles para manipular experimentalmente X. laevis desarrollo embrionario. Ganancia de función y derribo Gene son fáciles de realizar mediante la microinyección de células individuales de primeros blástulas. Tejidos embrionarios pueden ser cortados para la reasociación in vitro o ensayos de 7-11 back-injerto 12,13.

En este protocolo, se describe cómo diseccionar premigratorio NC craneal en X. laevis neurulas tarde, antes de la migración. Estos explantes se pueden cultivar en fibronectina-Coated placas para estudiar la migración y la diferenciación en controladas en condiciones experimentales in vitro. Explantes NC también se pueden injertar en embriones normales o manipuladas de acogida para estudiar su migración y diferenciación in vivo.

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Protocol

Los experimentos cumplen con la reglamentación nacional y europea relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos y con los principios establecidos a nivel internacional de sustitución, reducción y refinamiento.

1. Preparación de platos recubiertos con fibronectina 14

  1. Pipetear 500 ml de 10 mg / ml de fibronectina de grado cultivo diluido en 1x tampón fosfato salino (PBS) en una placa de Petri estándar de plástico (Ø 40 x 11 mm). Incubar a 37 ° C durante 1 hora. Nota: si usa platos de cristal o cubreobjetos de vidrio para la imagen posterior, utilice una solución de fibronectina 100 mg / ml.
  2. Enjuague tres veces con PBS 1x.
  3. Reemplazar PBS con 500 ml de 1x PBS/0.1% albúmina de suero bovino (BSA). Incubar a 37 ° C durante 30 min.
  4. Enjuague tres veces con PBS 1x.
  5. Llenar con 1x PBS y se mantenga a 4 ° C hasta su uso (por lo general de 24 a 48 h).

2. La disección de los explantes NC

<ol>
  • Preparar 3/4 normal Anfibio Medio (NAM) (NaCl 110 mM, 2 mM de KCl, 1 mM de Ca (NO3) 2, 1 mM de MgSO4, 0,1 mM EDTA, 1 mM de NaHCO3, 0,2 x PBS, 50 mg / ml gentamicina 10,15). No guardar más de 1 semana para la disección, se almacenan a 4 ° C. NAM Mayor se puede utilizar para la preparación de platos de disección de agarosa recubiertas con (abajo).
  • Preparar 60 mm placas de Petri para la disección, recubiertas con 10 ml de agarosa al 2% en 3/4 de NAM.
  • Recoger herramientas de disección: pipetas Pasteur de plástico, una mejor pasador de insecto montado sobre soporte de pasador (ver tabla materiales para la referencia), un "cuchillo de la ceja" (hecho con pelo de las cejas incrustado en parafina en la punta de una pipeta Pasteur de vidrio 16), dos fina pinza de disección, pipeta P1000 y consejos, un estereoscopio binocular con aumento de 8-40X y 50, una fuente de luz brillante con fibras ópticas guías. Todas las herramientas de disección deben mantenerse limpios, después de cada experimento, enjuagarlos dos veces con agua destilada, una vez with etanol al 100% y dejar secar. Almacene lejos del polvo.
  • Llene el plato de disección con NAM fresca casi hasta la cima.
  • Obtener X. laevis embriones de acuerdo con los procedimientos estándar 10 y ellos envejecer hasta que alcanzan Néurula etapa 16 (de acuerdo con Nieuwkoop y Faber mesa de desarrollo 17).
  • Coloque etapa 16 embriones en el plato de disección utilizando la pipeta Pasteur de plástico.
  • Llevar a cabo todos los pasos subsiguientes en el marco del alcance binocular. Retire la membrana vitelina con dos pares de pinzas. Tenga cuidado de no dañar la parte dorsal de los embriones.
  • Espere hasta que los embriones han llegado a la etapa 17 para iniciar la disección. Etapa 17 es apropiado, ya que la cresta neural está claramente separado del tubo neural, en contraste con las etapas anteriores. Después de la etapa 17, se inicia la migración de Carolina del Norte y mezclándose con el mesénquima circundante.
  • Cavar un agujero pequeño en la agarosa con pinzas para hacer un hueco para los embriones con el fin de mantenerdurante la disección. Coloque un embrión dorsal hacia arriba. Nota: el modelado de la arcilla puede ser usado para mantener los embriones en lugar de excavación de un agujero en la agarosa.
  • Hacer una incisión en la parte lateral del pliegue neural anterior con el cuchillo de la ceja y el pasador de insectos. Tenga cuidado de no ir demasiado profundo en el embrión: tratar de cortar a través de 2-3 capas de células (nunca llegar tan profundo como el archenteron!). Durante todo el proceso de disección, nunca permitir que los tejidos disecados para entrar en contacto con la interfaz aire-líquido desde X. tejidos embrionarios laevis se lisan por la tensión superficial.
  • Haga una segunda incisión paralela en la parte más dorsal del pliegue neural utilizando los mismos instrumentos.
  • Si es necesario, gire el plato alrededor de 90 °. Hacer tercera incisión perpendicular con el cuchillo de la ceja y la clavija de insecto, en el lado posterior de las dos primera incisiones. La NC es una gruesa masa de células por debajo de la capa externa pigmentada del ectodermo, lateralpara el tubo neural.
  • Utilice la punta de la cuchilla de cejas para separar la capa de ectodermo pigmentada de la NC subyacente, a partir de la tercera borde de la incisión.
  • Utilice el lado de la cuchilla de cejas para separar el tejido NC a partir de la tercera incisión. El tejido NC es más bien gris, mientras que el mesodermo cefálico subyacente es blanco. Separe con cuidado la Carolina del Norte a partir del mesodermo.
  • Separe el tejido NC anterior de la vesícula óptica, y cortar en este nivel para liberar el explante. Como control para la primera experimentos, comprobando la expresión Snail2 (un marcador canónica Carolina del Norte) en algunos explantes por hibridación in situ se recomienda.

    • 3. Plating explantes de fibronectina

    1. Rellena el plato fibronectina recubierto con Modificada Danilchick Medio (MDM, NaCl 53 mM, Na2CO 3 5 mM, K Gluconato 4,5 mM, Na Gluconato 32 mM, MgSO4 1 mM, CaCl2 1 mM, BSA al 0,1%, se ajusta el pH a 8.3 con 1 M Bicina
    2. La transferencia de los explantes en el plato fibronectina recubierto con una pipeta P1000. Nunca permita que los explantes para tocar la interfase aire-líquido. En primer lugar, la pipeta un poco de líquido en la punta, a continuación, los explantes, a continuación, algunos de nuevo líquido. No permita que el aire en la punta durante la transferencia de los explantes en el plato recubiertos de fibronectina. Una vez que la punta está dentro del líquido del plato fibronectina recubiertos, dejar que los explantes lentamente bajan por gravedad, o empujar con mucha suavidad. Evitar la expulsión de los explantes demasiado rápido.
    3. Coloque 10-30 explantes en el plato con el cuchillo de la ceja. Evitar los lados del plato, que no son adecuados para la formación de imágenes posterior.
    4. Trate de no mover el plato hasta que los explantes se han unido a la fibronectina (se tarda unos 15-30 minutos). Si es necesario, mueva el plato con mucho cuidado.
    5. Coloque el plato en un incubador refrigerado (entre 15-20 º C, para la tabla de temperaturas ver 17). Cuando se coloca a 15 ° C, las células are suele migrar de manera eficiente y dispersando después de 6 horas de incubación (el tiempo puede variar entre los experimentos).

    4. Injerto explantes en embriones de acogida

    1. Cortar un cubreobjetos de vidrio fina en piezas muy pequeñas utilizando fórceps gruesas. El tamaño de las piezas debe ser de aproximadamente 1,5 mm 2. Sumergir los trozos en una placa de Petri que contiene de 3/4 NAM o PBS usando fórceps.
    2. Preparación del embrión de acogida: diseccionar la NC anfitrión en 3/4 NAM como se describe en 3) con especial cuidado de no dañar el embrión de acogida mientras se quita la membrana vitelina y la disección de la NC. La tensión del tejido tiende a aumentar el tamaño de la ablación: dejar que el embrión de acogida curar parcialmente, mientras que la disección de la embrión donante.
    3. En otro plato de agarosa recubiertas con o en otra parte del mismo plato, diseccionar el explante NC del embrión donante como se describe en el Protocolo 3. Transferir el injerto de Carolina del Norte en el plato que contiene el host con cuidado, como se describe enProtocolo 3.
    4. Colocar inmediatamente el explante NC a la zona de ablación host utilizando fórceps. El explante debe adjuntar parcialmente. Ponga un pedazo de cubreobjetos de vidrio sobre el embrión injertado para mantener el injerto en su lugar. Elige un pedazo de vidrio más grande que el embrión para evitar dañarla. El embrión será un poco aplanada.
    5. Espere por lo menos 15 a 20 minutos, luego retire suavemente el cubreobjetos. Deje que el embrión se recuperan durante otros 10 minutos y la pipeta con cuidado en un plato limpio lleno de 3/4 NAM, utilizando la pipeta Pasteur de plástico.

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    Representative Results

    Cuando chapada en fibronectina, los explantes de la cresta neural se adhieren rápidamente (15-30 min) y el explante se extiende plana dentro de 2 horas (Figura 1A). Después de 3-6 células hr comienzan a dispersarse. En 24 horas a 15 ° C, muchas células han comenzado a migrar fuera del explante (figuras 1B y 1C). Yema hace que las células muy brillante bajo contraste de fase (Figura 1B). Protuberancias celulares (filopodes y lamellipodes) son claramente visibles después de phalloidin tinción del citoesqueleto de actina (Figura 1C).

    Para el experimento de injerto ortotópico, los embriones donantes fueron inyectados con ARNm de GFP con el fin de seguir las células injertadas en el embrión de acogida no marcado. La craneal NC se realizó ablación en un lado de la máquina; 30-60 min después de la cirugía del injerto se ha curado, la sustitución de la ablación de acogida craneal NC (Figura 1D, 2 horas después del injerto). Unas horas más tarde, las células GFP-positivas han emigradofuera del explante y siguió las rutas de migración de las células NC estereotipadas hacia lugares craneofaciales ventral (Figura 1E). En los renacuajos, las estructuras craneofaciales NC-derivados han desarrollado (Figura 1G). Cuando craneal NC se realizó ablación, estas estructuras habían desaparecido, dando como resultado una cara más corta con el ojo adyacente a la glándula de cemento (Figura 1H, flechas rojas). En renacuajos injertados, las células NC donantes han aportado a las estructuras craneofaciales, lo que resulta en una cara morfología normal (Figuras 1F y 1I, flechas verdes).

    Figura 1
    Figura 1. In vitro y el comportamiento in vivo de explantado NC craneal. CA)   Premigratorio NC se disecóa partir de un embrión neurula etapa 17 y se colocaron en una placa de fibronectina recubierto. A) 2 h después de la siembra, el explante se adjunta y se propague. B) 24 horas después de la siembra, las células han emigrado de manera eficiente en la fibronectina. C) lamellipodia y filopodios se ve claramente en la migración de las células NC marcadas con phalloidin (verde) etapa DI) neurula 17 GFP + etiquetada premigratorio NC fue tomado de un embrión de GFP-inyectado y back-injertado en un embrión de acogida, de la que craneal NC, se obtuvo en la etapa 17. - 18. D) Dos horas después del injerto, el explante se haya curado. células EF) Grafted NC han emigrado activamente y poblada de la corriente de la mandíbula, como se muestra en la etapa de renacuajo 31 y 41. etapa G) Control de 41 de renacuajo. H) ablación de la NC ha dado lugar a un dramático fracaso de la cara y el desarrollo del ojo (H: tenga en cuenta que el glan cementod desarrolla adyacente a la vista, debido a la falta de células NC pueblan las áreas de la mandíbula, flechas rojas. . Comparar controlar renacuajo en G) F, I) En contraste, las células injertadas NC han restaurado los ojos y el desarrollo de estructuras craneofaciales (F, I, flechas verdes) de CA, barras de escala = 100 mm;. DI, Barra de escala = 1 mm . D, vista dorsal. EI, vistas laterales. Esta cifra ha sido modificado de Milet et al. 12 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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    Discussion

    Este protocolo describe una técnica fácil de explante premigratorio craneal NC en embriones de X. laevis. Los embriones utilizados para dichos experimentos deben ser robustos y sanar bien. Deseche cualquier lote de embriones saludables. Además, crecer los embriones a diferentes temperaturas (de 12 a 18-20 ° C), con el fin de escindir la cresta neural en la etapa 17 y no más tarde. Después de la etapa 17, la cresta neural se puede mezclar con mesodermo cefálico y no se puede eliminar completamente. Tejidos de Xenopus se curan rápidamente y luego pierden su adhesión a otros tejidos. Es importante trabajar rápidamente y colocar los explantes de la cresta neural en el huésped tan pronto como se escindió del donante.

    En cuanto a los experimentos in vitro, placas de cultivo fibronectina pueden contaminarse con bacterias u hongos después de un par de días. Utilice materiales y soluciones de antibióticos y limpio o estéril tan a menudo como sea posible.

    Este procedimiento se optimiza fo de la cresta neural craneal. De hecho, esta población celular está bien definido y localizado en la etapa 17 embriones de Xenopus. Desafortunadamente, este modelo no es adecuado para llevar a cabo tales experimentos en el tronco NC. Embriones de aves son más adecuados para aquellos que estén interesados ​​en la manipulación de dicha población de células tronco NC.

    Los explantes se describen en este protocolo se puede utilizar para estudiar diversos aspectos del comportamiento NC, tanto in vivo como in vitro. El programa de desarrollo molecular NC se conserva en gran medida en los vertebrados 19. El desarrollo de la rana es un poderoso modelo para estudiar los vertebrados NC EMT, la migración y la diferenciación. X. células embrionarias laevis contienen suficiente yema para permitir su supervivencia in vitro durante varios días sin la adición de cualquier nutriente externa. Por lo tanto, los estudios in vitro pueden probar los efectos de varios factores de crecimiento o compuestos químicos, en un medio de cultivo simple y totalmente controlada. Tales experimentos han sidodiseñado para analizar EMT y la migración, incluyendo el estudio de los efectos de la quimio-atrayentes o repelentes de quimio-, de la activación o el bloqueo de las vías de señalización, etc 14,20-24 Este enfoque también se puede utilizar para diseñar protocolos de diferenciación NC dirigidas mejoradas. En el contexto de la elaboración de protocolos para la medicina regenerativa, la obtención de diversos tipos de células derivadas NC in vitro podrían ser utilizados en la detección de drogas para la comprensión y el tratamiento de neurocristopathies 25,26.

    Desarrollo NC está orquestada por una compleja interacción entre las normas y señales autónomas de células de los tejidos circundantes. Manipulaciones experimentales de la expresión génica, ya sea en el donante Carolina del Norte o en el embrión huésped, permiten discriminar células autónoma de aspectos autónomas noncell de desarrollo Carolina del Norte. La combinación de ganancia de función y knock-down se acerca a este protocolo para el cultivo in vitro e in vivo el injerto ha sido utilizar con éxitod 14,21,23,27-36.

    Esta técnica se puede adaptar para injertar otros tejidos en embriones de acogida y probar por sus potenciales de migración y diferenciación. Por ejemplo, se ha utilizado el ectodermo del techo blastocele pluripotentes (el "casquillo animal") para buscar un interruptor transcripcional mínimas para el desarrollo de NC. Se ha estudiado el efecto de dos factores de transcripción, PAX3 y zic1, sobre el compromiso NC y el desarrollo posterior. Tapas en animales con PAX3 y zic1 ganancia de función se sembraron en fibronectina in vitro o backgrafted en embriones de acogida. Encontramos que las células Pax3/Zic1-induced migran y se diferencian como bona fide NC células tanto in vitro como en embriones de acogida 12.

    Numerosos mecanismos moleculares que rigen NC EMT y la migración también están involucrados en la diseminación metastásica en el cáncer 37. Este protocolo tiene como objetivo proporcionar un simple, barato y efficiherramienta ent para los biólogos del desarrollo y otros investigadores para explorar los mecanismos fundamentales de estos comportamientos celulares clave.

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    Disclosures

    Los autores no tienen nada que revelar.

    Acknowledgments

    Los autores agradecen a Adeline Dolly por las fotos de explante de fibronectina, Eric Theveneau útil para los debates y el Fondo para los Animales del Instituto Curie. CM es un becario postdoctoral de la Región Ile de France (Domaine d'Interet Majeur vástago Pole), Université Paris Sud (Attache Temporaire d'Enseignement et de Recherche) y la Agence Nationale de la Recherche. Este trabajo fue financiado por la Universite Paris Sud (Attractivite 2011), el Centre National de la Recherche Scientifique (Programa de Acción Thematique et incitativo sur), la Asociación pour la Recherche contre le cáncer de Grant SFI20101201882, Ligue contre le Cáncer, y la Agence Nationale de la Recherche (Agence Nationale de la Recherche Programa Blanc).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Fibronectin from bovine plasma Sigma F4759-1MG
    Bovine Serum Albumin, Fraction V Euromedex 04-100-811-C Lower quality grade may  be suitable for this application
    Stainless Steel Insect Pins, Size 000 FST 26001
    Dumont #5 forceps 0.05 mm x 0.02 mm FST 11252-20

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    References

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    Biología del Desarrollo número 85 de la cresta neural, Embrión la disección de injerto fibronectina
    La disección de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Neural Crest para<em&gt; In vitro</em&gt; Explante cultura o<em&gt; In vivo</em&gt; Trasplante
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    Milet, C., Monsoro-Burq, A. H.… More

    Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation. J. Vis. Exp. (85), e51118, doi:10.3791/51118 (2014).

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