के विच्छेदन<em> Xenopus laevis</em> तंत्रिका शिखा के लिए<em> इन विट्रो</em> Explant संस्कृति या<em> में विवो</em> ट्रांसप्लांटेशन
Summary
इस प्रोटोकॉल Xenopus laevis neurulas से premigratory कपाल तंत्रिका शिखा (नेकां) काटना कैसे करें. ये explants फ़ाइब्रोनेक्टिन और इन विट्रो में सुसंस्कृत पर चढ़ाया, या वापस मेजबान भ्रूण में grafted किया जा सकता है. इस तकनीक नेकां उपकला करने वाली mesenchyme संक्रमण, प्रवास, और भेदभाव के तंत्र के अध्ययन की अनुमति देता है.
Abstract
तंत्रिका शिखा (नेकां) neurulation के अंत में एक उपकला करने वाली mesenchyme संक्रमण (EMT) से होकर गुजरती है कि एक क्षणिक पृष्ठीय न्यूरल ट्यूब सेल की आबादी है, जो विभिन्न अंगों की दिशा में बड़े पैमाने पर प्रवास करती है, और डेरिवेटिव के कई प्रकार के (न्यूरॉन्स, glia में differentiates उपास्थि और हड्डी, रंजित और अंत: स्रावी कोशिकाओं). इस प्रोटोकॉल में, हम vivo में इन विट्रो में नेकां विकास का अध्ययन करने के क्रम में, Xenopus laevis भ्रूण से premigratory कपाल नेकां काटना क्या करते हैं. मेंढक मॉडल जल्दी विकास का अध्ययन करने के लिए कई लाभ प्रदान करता है, प्रचुर मात्रा में बैचों भ्रूण में विवो लाभ और समारोह रणनीतियों के नुकसान से पहले दाता और / या मेजबान भ्रूण में नेकां विच्छेदन के लिए जीन अभिव्यक्ति के हेरफेर की अनुमति, तेजी से विकसित, उपलब्ध हैं. नेकां explants फ़ाइब्रोनेक्टिन पर चढ़ाया और इन विट्रो अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वे एक सीरम मुक्त परिभाषित मध्यम में कई दिनों के लिए संवर्धित किया जा सकता है. हम भी नेकां explants वापस भ्रष्टाचार के लिए कैसे का वर्णनविवो में नेकां प्रवास और भेदभाव के अध्ययन के लिए मेजबान भ्रूण में.
Introduction
तंत्रिका शिखा (नेकां) हड्डीवाला भ्रूण में neurulation के अंत में न्यूरल ट्यूब से उभर कि एक क्षणिक भ्रूण सेल की आबादी है. नेकां विनिर्देश है कि नियंत्रण संकेतन और आनुवंशिक घटनाओं के रूप में जल्दी gastrulation के रूप में शुरू करते हैं. नेकां आसपास के पृष्ठीय ऊतकों से संकेत द्वारा तंत्रिका और गैर तंत्रिका बाहरी झिल्ली के बीच सीमा पर निर्दिष्ट किया जाता है. Neurulation के अंत में, नेकां कोशिकाओं को एक उपकला करने वाली mesenchyme संक्रमण (EMT) से गुजरना और मार्गदर्शक cues के आसपास का जवाब देने से टकसाली मार्गों के बाद भ्रूण में बड़े पैमाने पर पलायन. वे अपने अंतिम गंतव्य तक पहुँच चुके हैं, वे डेरिवेटिव, जैसे न्यूरॉन्स, glia, हड्डी, कार्टिलेज, और pigmented कोशिकाओं 1-5 की एक विशाल सरणी में अंतर. क्योंकि कई प्रकार की कोशिकाओं और भ्रूण के ऊतकों, नेकां कोशिकाओं के विकास के किसी भी कदम पर दोष, प्रेरण से अंतिम भेदभाव करने के लिए उनके योगदान की, neurocristopathies 6 नामित जन्मजात सिंड्रोम हो सकता है. एविनिर्देश, EMT, प्रवास, और भेदभाव – – अलग चरणों में विकसित करने नेकां के xperimental हेरफेर neurocristopathies के बारे में हमारी समझ को बेहतर बनाने और संभावित चिकित्सीय रणनीतियों की डिजाइन की अनुमति देगा.
Xenopus laevis भ्रूण नेकां विकास का अध्ययन करने के लिए पसंद का एक मॉडल है. भ्रूण की बड़ी संख्या प्राप्त करने के लिए आसान कर रहे हैं, और बाह्य निषेचन विकास के बहुत पहले कदम के लिए पहुँच देता है. कई उपकरण प्रयोगात्मक एक्स हेरफेर करने के लिए उपलब्ध हैं भ्रूण विकास laevis. लाभ के समारोह और पछाड़ना जीन जल्दी blastulas के व्यक्ति की कोशिकाओं microinjecting द्वारा प्रदर्शन करने के लिए आसान कर रहे हैं. भ्रूण के ऊतकों में इन विट्रो reassociation 7-11 या वापस ग्राफ्टिंग assays 12,13 के लिए काटा जा सकता है.
इस प्रोटोकॉल में, हम एक्स में premigratory कपाल नेकां बाहर काटना वर्णन कैसे पिछले प्रवास को देर neurulas, laevis. ये explants फ़ाइब्रोनेक्टिन-coate पर संवर्धित किया जा सकता हैमें प्रवास और भेदभाव का अध्ययन करने के लिए डी प्लेटें विट्रो प्रयोगात्मक शर्तों में नियंत्रित. नेकां explants भी vivo में उनके प्रवास और भेदभाव का अध्ययन करने के लिए सामान्य या चालाकी से मेजबान भ्रूण में grafted किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल एक्स laevis भ्रूण में premigratory कपाल नेकां explant के लिए एक आसान तकनीक का वर्णन है. इस तरह के प्रयोगों के लिए इस्तेमाल भ्रूण मजबूत हो और अच्छी तरह से ठीक करने की जरूरत है. अस्वस्थ भ्रूण के किसी भी बैच ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों उपयोगी विचार विमर्श और Institut क्यूरी के जानवरों की सुविधा के लिए फ़ाइब्रोनेक्टिन, एरिक Theveneau पर explant के चित्रों के लिए Adeline डॉली धन्यवाद. मुख्यमंत्री क्षेत्र Ile डी फ्रांस (Domaine D'Interet Majeur ध्रुव स्टेम), Université पेरिस सूद (अताशे Temporaire डी 'Enseignement एट डे Recherche), और Agence Nationale डे ला Recherche की एक postdoctoral साथी है. इस काम Université पेरिस सूद (Attractivite 2011), केंद्र में राष्ट्रीय डी ला Recherche Scientifique (लड़ाई Thematique एट Incitative सुर कार्यक्रम), एसोसिएशन डालना ला Recherche contre Le कैंसर अनुदान SFI20101201882, लीग contre Le कैंसर, और Agence Nationale डे ला द्वारा वित्त पोषित किया गया अति सूक्ष्म (एजेंस Nationale डे ला Recherche कार्यक्रम ब्लैंक).
Materials
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F4759-1MG | |
| Bovine Serum Albumine. Fraction V | Euromedex | 04-100-811-C | Lower quality grade may be suitable for this application |
| Stainless Steel Insect Pins. Size 000 | FST | 26001 | |
| Dumont #5 forceps 0.05 mm x 0.02 mm | FST | 11252-20 |
References
- Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (7), 557-568 (2008).
- Theveneau, E., Mayor, R. Neural crest delamination and migration: from epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration. Dev. Biol. 366 (1), 34-54 (2012).
- Stuhlmiller, T. J., García-Castro, M. I. Current perspectives of the signaling pathways directing neural crest induction. Cell. Mol. Life Sci. 69 (22), 3715-3737 (2012).
- Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Neural crest induction at the neural plate border in vertebrates. Dev. Biol. 366 (1), 22-33 (2012).
- Pegoraro, C., Monsoro-Burq, A. H. Signaling and transcriptional regulation in neural crest specification and migration: lessons from Xenopus embryos. Dev. Biol. 2 (2), 247-259 (2013).
- Etchevers, H. C., Amiel, J., Lyonnet, S. Molecular Bases of Human Neurocristopathies. Neural Crest Induct. Different. 589, 213-234 (2005).
- Nieuwkoop, P. D., et al. Activation and organization of the central nervous system in amphibians. Part II. Differentiation and organization. J. Exp. Zool. 120 (1), 33-81 (1952).
- Nieuwkoop, P. D., et al. Activation and organization of the central nervous system in amphibians Part I. Induction and activation. J. Exp. Zool. 120 (1), 1-31 (1952).
- Sharpe, C. R., Fritz, A., De Robertis, E. M., Gurdon, J. B. A homeobox-containing marker of posterior neural differentiation shows the importance of predetermination in neural induction. Cell. 50 (5), 749-758 (1987).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , (2000).
- Monsoro-Burq, A. -. H., Fletcher, R. B., Harland, R. M. Neural crest induction by paraxial mesoderm in Xenopus embryos requires FGF signals. Development. 130 (14), 3111-3124 (2003).
- Milet, C., Maczkowiak, F., Roche, D. D., Monsoro-Burq, A. H. Pax3 and Zic1 drive induction and differentiation of multipotent, migratory, and functional neural crest in Xenopus embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (14), 5528-5533 (2013).
- Sadaghiani, B., Thiébaud, C. H. Neural crest development in the Xenopus laevis embryo, studied by interspecific transplantation and scanning electron microscopy. Dev. Biol. 124 (1), 91-110 (1987).
- Theveneau, E., et al. Collective chemotaxis requires contact-dependent cell polarity. Dev. Cell. 19 (1), 39-53 (2010).
- Slack, J. M., Forman, D. An interaction between dorsal and ventral regions of the marginal zone in early amphibian embryos. J. Embryol. Exp. Morphol. 56, 283-299 (1980).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH Protoc. , (2007).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1994).
- Theveneau, E., Mayor, R. Beads on the run: beads as alternative tools for chemotaxis assays. Methods Mol. Biol. 769, 449-460 (2011).
- Bronner, M. E., LeDouarin, N. M. Development and evolution of the neural crest: An overview. Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).
- Alfandari, D., Cousin, H., Gaultier, A., Hoffstrom, B. G., DeSimone, D. W. Integrin α5β1 supports the migration of Xenopus cranial neural crest on fibronectin. Dev. Biol. 260 (2), 449-464 (2003).
- Fort, P., et al. Activity of the RhoU/Wrch1 GTPase is critical for cranial neural crest cell migration. Dev. Biol. 350 (2), 451-463 (2011).
- Matthews, H. K., et al. Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA. Development. 135 (10), 1771-1780 (2008).
- Kashef, J., Köhler, A., Kuriyama, S., Alfandari, D., Mayor, R., Wedlich, D. Cadherin-11 regulates protrusive activity in Xenopus cranial neural crest cells upstream of Trio and the small GTPases. Genes Dev. 23 (12), 1393-1398 (2009).
- Hwang, Y. -. S., Luo, T., Xu, Y., Sargent, T. D. Myosin-X is required for cranial neural crest cell migration in Xenopus laevis. Dev. Dyn. 238 (10), 2522-2529 (2009).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
- Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling Neural Crest Induction, Melanocyte Specification, and Disease-Related Pigmentation Defects in hESCs and Patient-Specific iPSCs.. Cell Reports. 3 (4), 1140-1152 (2013).
- Shnitsar, I., Borchers, A. PTK7 recruits dsh to regulate neural crest migration. Development. 135 (24), 4015-4024 (2008).
- Matthews, H. K., et al. Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA. Development. 135 (10), 1771-1780 (2008).
- Matthews, H. K., Broders-Bondon, F., Thiery, J. P., Mayor, R. Wnt11r is required for cranial neural crest migration. Dev. Dyn. 237 (11), 3404-3409 (2008).
- Carmona-Fontaine, C., et al. Contact inhibition of locomotion in vivo controls neural crest directional migration. Nature. 456 (7224), 957-961 (2008).
- Guiral, E. C., Faas, L., Pownall, M. E. Neural crest migration requires the activity of the extracellular sulphatases XtSulf1 and XtSulf2. Dev. Biol. 341 (2), 375-388 (2010).
- Cousin, H., Abbruzzese, G., Kerdavid, E., Gaultier, A., Alfandari, D. Translocation of the Cytoplasmic Domain of ADAM13 to the Nucleus Is Essential for Calpain8-a Expression and Cranial Neural Crest Cell Migration. Dev. Cell. 20 (2), 256-263 (2011).
- Borchers, A., David, R., Wedlich, D. Xenopus cadherin-11 restrains cranial neural crest migration and influences neural crest specification. Development. 128 (16), 3049-3060 (2001).
- Borchers, A., Epperlein, H. -. H., Wedlich, D. An assay system to study migratory behavior of cranial neural crest cells in Xenopus. Dev. Genes Evol. 210 (4), 217-222 (2000).
- Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. Runx2 is essential for larval hyobranchial cartilage formation in Xenopus laevis. Dev. Dyn. 236 (6), 1650-1662 (2007).
- Yan, C. Y. I., Skourides, P., Chang, C., Samba Brivanlou, A. a Xenopus hnRNP expressed in neural and neural crest tissues. Dev. Dyn. 238 (1), 204-209 (2009).
- Acloque, H., Adams, M. S., Fishwick, K., Bronner-Fraser, M., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions: the importance of changing cell state in development and disease. J. Clin. Invest. 119 (6), 1438-1449 (2009).
