Detta protokoll beskriver hur man dissekera premigratory cranial neural crest (NC) från Xenopus laevis neurulas. Dessa explants kan pläterade på fibronektin-och odlas in vitro, eller ympas tillbaka in embryon värd. Denna teknik gör det möjligt att studera mekanismerna för NC epitel-till-mesenkym övergång, migration och differentiering.
Neurallisten (NC) är en övergående rygg neuralrörsdefekter cellpopulation som genomgår en epitel-till-mesenkym övergång (EMT) i slutet av neurulation, vandrar i stor utsträckning mot olika organ, och skiljer i många typer av derivat (nervceller, glia, brosk och ben, pigmenterade och endokrina celler). I detta protokoll, beskriver vi hur man dissekera premigratory cranial NC från Xenopus laevis embryon, för att studera NC utveckling in vivo och in vitro. Grodan modellen erbjuder många fördelar för att studera tidiga utveckling, rikliga satser finns tillgängliga, embryon utvecklas snabbt, in vivo-vinst och förlust av funktionsstrategier tillåter manipulering av genuttryck före NC dissektion i donator och / eller embryon värd. NC explants kan pläterade på fibronektin och som används för in vitro-studier. De kan odlas i flera dagar i ett serumfritt definierat medium. Vi beskriver också hur man ympa NC explants tillbakai värd embryon för att studera NC migration och differentiering in vivo.
Neurallisten (NC) är en övergående embryonal cellpopulation som framträder i neuralröret i slutet av neurulation i ryggradsdjur embryon. Signalering och genetiska händelser som styr NC specifikation börja så tidigt som gastrulation. NC specificeras vid gränsen mellan neurala och icke-neural ektoderm av signaler från omgivande rygg vävnader. Vid slutet av neurulation, NC celler genomgår ett epitel till mesenkym övergång (EMT) och migrera i stor utsträckning i embryot följande stereotypa rutter genom att svara på omgivande vägledande cues. När de har nått sin slutdestination, de differentieras till ett brett spektrum av derivat, t.ex. nervceller, glia, ben, brosk och pigmenterade celler 1-5. På grund av deras bidrag till många celltyper och embryonala vävnader, defekter vid varje steg av NC-celler utveckling, från induktion till slutlig differentiering, kan orsaka medfödda syndrom heter neurocristopathies 6. Experimental manipulation av utvecklings NC i olika skeden – specifikationer, EMT, migration och differentiering – kommer att öka vår förståelse av neurocristopathies och möjliggöra utformning av potentiella terapeutiska strategier.
Xenopus laevis embryot är en modell av val att studera NC-utveckling. Ett stort antal embryon är lätt att få, och yttre befruktning ger tillgång till de allra första stegen i utvecklingen. Många verktyg finns tillgängliga för att experimentellt manipulera X. laevis embryonala utvecklingen. Gene vinst-av-funktion och knockdown är lätta att utföra genom microinjecting enskilda celler i tidiga blastulas. Embryonala vävnader kan klippas för in vitro-återförening 7-11 eller back-ympning analyser 12,13.
I detta protokoll, beskriver vi hur man dissekera ut premigratory cranial NC i X. laevis sena neurulas, före migreringen. Dessa explantat kan odlas på fibronektin-coated plattor för att studera migration och differentiering i kontrollerad in vitro experimentella förhållanden. NC explants kan även ympas in i normala eller manipulerade värd embryon för att studera deras migration och differentiering in vivo.
Detta protokoll beskriver en enkel teknik för att explantera premigratory cranial NC i X. laevis embryon. De embryon som används för sådana experiment måste vara robust och läker bra. Kassera parti ohälsosamma embryon. Dessutom växer embryon vid olika temperaturer (från 12 till 18 till 20 ° C), i syfte att skära ut neurallisten vid steget 17 och inte senare. Efter etapp 17, kan neurallist blandas med KRANIE mesoderm och kan inte tas bort helt och hållet. Xenopus vävnader läker snabbt och …
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Adeline Dolly för bilderna av Explantation på fibronektin, Eric Theveneau för hjälp diskussioner och Animal Facility av Institut Curie. CM är en forskarassistent i regionen Ile de France (Domaine d'Interet Majeur Stem Pole), Université Paris Sud (Attache Temporaire d'Enseignement et de Recherche), och Agence Nationale de la Recherche. Detta arbete har finansierats av Université Paris Sud (Attractivite 2011), Centre National de la Recherche Scientifique (Action Thematique et Incitative sur Programme), Association pour la Recherche contre le Cancer Grant SFI20101201882, Ligue contre le Cancer, och Agence Nationale de la Recherche (Agence Nationale de la Recherche Programme Blanc).
Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F4759-1MG | |
Bovine Serum Albumine. Fraction V | Euromedex | 04-100-811-C | Lower quality grade may be suitable for this application |
Stainless Steel Insect Pins. Size 000 | FST | 26001 | |
Dumont #5 forceps 0.05 mm x 0.02 mm | FST | 11252-20 |