Summary

Voorbereiding van Segmented Microtubules om Motions Gedreven door het demonteren uiteinden van microtubuli Studie

Published: March 15, 2014
doi:

Summary

Microtubules zijn inherent instabiel polymeren en hun schakelen tussen groei en bakvet stochastische en moeilijk te controleren. Hier beschrijven we protocollen gebruiken gesegmenteerde microtubuli met photoablatable stabiliserende caps. Depolymerisatie van gesegmenteerde microtubuli kan worden geactiveerd met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie, waardoor het bijstaan ​​van de analyse van bewegingen met de demontage uiteinden van microtubuli.

Abstract

Depolymerisatie van microtubuli kan werking bieden aan verschillende eiwitcomplexen en met eiwit beklede korrels transporteren in vitro. De onderliggende mechanismen worden verondersteld om een ​​belangrijke rol spelen in het microtubuli-afhankelijke chromosoom bewegingen tijdens de celdeling, maar de betrokken eiwitten en hun exacte rollen zijn slecht gedefinieerd. Er is dus een groeiende behoefte aan assays waarmee dergelijke motiliteit in vitro bestuderen met gezuiverde componenten en gedefinieerde biochemische milieu te ontwikkelen. Microtubules zijn echter inherent instabiel polymeren, alsmede schakelen tussen groei en bakvet stochastische en moeilijk te controleren. De protocollen beschrijven we hier gebruik maken van de gesegmenteerde microtubuli die zijn gemaakt met de photoablatable stabiliserende caps. Depolymerisatie van dergelijke gesegmenteerde microtubuli kan worden geactiveerd met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie, waardoor het bijstaan ​​van studies van de beweeglijkheid bij de demontage uiteinden van microtubuli. Deze techniek kan worden gebruikt om caRRY een kwantitatieve analyse van het aantal moleculen in het fluorescentie-gemerkte eiwitcomplexen die processively met microtubulus uiteinden bewegen. Een signaal-ruisverhouding in deze en andere kwantitatieve fluorescentie assays optimaliseren, moet dekglaasjes worden behandeld om niet-specifieke absorptie van oplosbare fluorescent gelabelde eiwitten te verminderen. Gedetailleerde protocollen worden voorzien om rekening te houden met de ongelijkheid van fluorescentieverlichting, en bepalen de intensiteit van een enkele fluorofoor met equidistante Gaussische fit. Tenslotte beschrijven we het gebruik van gesegmenteerde microtubuli microtubuli-afhankelijke bewegingen van de met eiwit beklede microkorrels bestuderen, die inzicht in het vermogen van verschillende motorische en niet-motorische eiwitten te koppelen microtubule depolymerisatie te processive lading beweging.

Introduction

Microtubuli sterk geconserveerd cytoskelet structuren die belangrijk zijn voor de cellulaire architectuur, celbeweeglijkheid, celdeling, en intracellulair transport 1 zijn. Deze dynamische polymeren samenstellen uit tubuline in de aanwezigheid van GTP en schakelen ze spontaan tussen groei en verkorting 2. Microtubules zijn zeer dun (slechts 25 nm in diameter) derhalve speciale optische technieken om het contrast moet worden gebruikt om microtubuli waarnemen met een lichtmicroscoop. Eerdere werk met deze polymeren onderzocht hun dynamisch gedrag met behulp van differentieel interferentie contrast (DIC) 3. Deze en soortgelijke studies in vitro aangetoond dat onder normale experimentele omstandigheden, de microtubuli catastrofe en schakelaar om de depolymerisatie ondergaan slechts zelden, eens in de 5-15 min (deze frequentie is voor 7-15 mM oplosbaar tubuline concentratie bij 28-32 ° C onderzocht ) 4. Verschillende technieken zijn dus voorgesteld induce microtubule depolymerisatie op een gecontroleerde manier. Microtubuli verkorting kan worden geactiveerd door wegwassen oplosbare tubuline 5,6, snijden microtubuli met een laserbundel 7, of met gesegmenteerde microtubules 8, zoals hier beschreven. Contract met gesegmenteerde microtubules, evenals stochastisch schakelen polymeren, heeft gevonden dat kleine intracellulaire ladingen, zoals chromosomen, blaasjes en met eiwit beklede korrels, aan de uiteinden van de verkorting microtubuli 9-13 bewegen. Dit fenomeen wordt gedacht aan een rechtstreekse gevolgen voor chromosoom bewegingen in mitotische cellen hebben, en de onderliggende mechanismen worden momenteel actief onderzoek 14-16.

Onlangs hebben-tl-gebaseerde technieken, met inbegrip van de totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie, zijn gebruikt om de beweeglijkheid te studeren met dynamische microtubuli eindigt 17-24. Het voordeel van deze benadering is dat het onderzoek van interacties tussen microtubuli en microtubuli bindende eiwitten in real time via eiwitten gelabeld met verschillende fluoroforen. Verschillende eiwitcomplexen bleken processively bewegen verlengen en / of verkorten uiteinden van microtubuli. Zij omvatten het met microtubuli geassocieerde eiwitten Dam1 10,12,18, Ska1 19 en XMAP215 20, alsmede kinesine motor Kif18A 21,22, MCAK 23 en CENP-E 24. Deze eiwitten vertonen processive tip-tracking, die fundamenteel verschilt van die van de klassieke-tip bijhouden eiwitten zoals EB1 25. Hoewel EB1 moleculen en de geassocieerde partners lijken te blijven stabiel geassocieerd met dynamische uiteinden van microtubuli, de individuele moleculen blijven gebonden aan de microtubuli tip voor slechts ~ 0,8 sec, snel uit te wisselen met de oplosbare zwembad 26. In tegenstelling processieve tip-trackers, zoals Dam1, reizen met microtubuli eindigt voor veel micron, en hun associatie met microtubuli tips kan duren voor menige seconden. De tip vereniging tijd, en de resulterende snelheid tracking, hangt sterk af van het aantal moleculen die de tip bijhouden complex 27 gevormd. Groter eiwit ensembles zijn meestal veel betere tip-trackers. Zo kunnen dergelijke complexe samenstellingen de geïsoleerde gist kinetochores gekoppeld blijven microtubuli uiteinden voor 28 uur. Sommige microtubule-bindende eiwitten, bijv. Ndc80 kinetochore eiwitcomplex, bleken niet te volgen met microtubuli te eindigt bij een enkel molecuul, maar Ndc80 zeer efficiënt koppelen van de beweging van de kraal lading 19,29-31. Dus, om het mechanisme van tip-volgen door verschillende eiwitcomplexen, evenals hun biologische rollen begrijpen, is het belangrijk tip tracking onderzocht als functie van het aantal moleculen in de tip bijhouden complex, en bepalen het vermogen van deze complexen collectieve motiliteit vertonen op het oppervlak van de kraal lading.

<p class="jove_content"> Hieronder vindt u gedetailleerde protocollen om experimenten voor te bereiden en uit te voeren met gesegmenteerde microtubuli (Figuur 1A). Eerst worden de handel verkrijgbare objectglaasjes gemodificeerd korte polyethyleen buis (Protocol 1) bevestigen. De herbruikbare microscopie stroom kamer wordt vervolgens geassembleerd uit zo'n glijbaan en het chemisch of plasma gereinigd en gesilaniseerd dekglaasje (protocol 2) 32-34. Het resulterende volume kamer is slechts 20-25 pi (of zo klein als 15 pl, zie opmerking 3 in Protocol nr. 1), met inbegrip van het volume van de inlaat slang. Commercieel verkrijgbare stroomkamers kan worden gebruikt, maar hun omvang gewoonlijk groter, waardoor onnodige verspilling van eiwitten. Indien een grotere kamer wordt toegepast, moet het volume van alle oplossingen in onderstaande protocollen evenredig geschaald. Microtubuli zaden worden vervolgens bereid, bijvoorbeeld met langzaam hydrolyseerbare GTP analoog, GMPCPP (guanosine-5'-[(α, β)-methyleno] trifosfaat) (protocol 3, zie ook Hyman <em> e.a.. 35). De zaden worden geïmmobiliseerd op een schoon dekglaasje en het oppervlak wordt vervolgens geblokkeerd om niet-specifieke absorptie van andere eiwitten voorkomen 32 (protocol 4 beschrijft zaden immobilisatie met behulp van digoxigenine). De gesegmenteerde microtubuli kan dan worden voorbereid met behulp van Protocol 5. De belangrijkste reden voor deze benadering is dat de microtubulus polymeren, die in aanwezigheid van GTP vormen, tijdelijk worden door toevoeging van de korte "caps" stabiele tubuline segmenten die GMPCPP bevatten gestabiliseerd. Deze kappen bevatten ook Rhodamine-gelabeld tubuline, zodat ze kunnen eenvoudig worden verwijderd door het verlichten van het gezichtsveld met een 530-550 nm laser of kwik booglamp (Protocol 6) 36. Fluorescentie-intensiteit van de punt-spoorvolgsignaal kan dan worden gebruikt voor het schatten van het aantal moleculen die reizen met de demontage microtubuli uiteinden, gezien de ongelijkheid van de microscoop field verlichting (Protocol 7). Een soortgelijke aanpak kan worden gebruiktinteracties tussen microtubuli depolymeriseren en eiwit beklede parels, bereid zoals beschreven in 27 (protocol 8) te bestuderen. Sommige eiwitten zullen binden gemakkelijk aan de wanden van gesegmenteerde microtubuli, maar laserpincet kan ook worden gebruikt om de hiel bij de microtubule muur houden, waardoor de binding bevorderen.

Protocol

Benodigde apparatuur: De hieronder beschreven experimenten vereisen een lichtmicroscoop uitgerust voor DIC en fluorescentie beeldvorming (tabel 1). Helderveld LED verlichting kan worden gebruikt om aanzienlijke verbetering van de detectie van het dekglaasje bijgevoegde microtubuli zaden 37, die moeilijk waar te nemen met een gewone halogeenlamp zijn. Om vloeistofstroom in de microscopie kamers regelen, moet de oplossing worden uitgewisseld met een peristaltische pomp kan stro…

Representative Results

Eiwit tracking met depolymeriseren microtubuli eindigt. Gist kinetochoor component Dam1 is veruit de beste tip-tracker van de depolymeriseren microtubuli eindigt 14. Deze 10-subunit complex gelabeld met GFP kan gemakkelijk worden uitgedrukt en gezuiverd van bacteriële cellen 18,38, dus we raden het gebruik ervan als een positieve controle voor de tip volgen assay. Een fluorescerend eiwit dat meeloopt met het depolymeriseren na een microtubule wordt gezien als een heldere fluoresce…

Discussion

Veel single molecule assays tegenwoordig routinematig gebruik speciaal behandeld dekglaasjes om aspecifieke eiwit plakken drastisch te verminderen. De procedure die we hier beschrijven is een wijziging van het oorspronkelijke protocol ontwikkeld in Howard lab 32, en we vinden dat silaniseren de dekglaasjes is de moeite waard, zelfs met DIC-gebaseerde kraal assays, die geen gebruik maken van fluorescentie. Chambers geassembleerd dergelijke dekglaasjes tonen veel schoner oppervlak en de verkregen in de aanwezig…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen graag FI Ataullakhanov bedanken voor het helpen bij het ontwerpen en vervaardigen herbruikbare stromingskamers, N. Dashkevich, N. Gudimchuk en A. Korbalev voor het verstrekken van afbeeldingen voor figuren, N. Gudimchuk en P. Zakharov voor het ontwikkelen van een protocol en het verstrekken van reagentia bereiden digoxigenine-gelabelde microtubuli zaden, A. Potapenko voor hulp bij het bewerken van tekst en andere leden van Grishchuk lab voor tips en discussies. Dit werk werd mede ondersteund door NIH te verlenen GM R01-098389 en een pilot subsidie ​​van Pennsylvania Muscle Instituut voor ELG, die een Kimmel Scholar, door RFBR verleent 12-04-00111-a, 13-04-40190-H en 13 -04-40188-H, de Russische Academie van Wetenschappen presidium Subsidies (Mechanismen van de Molecular Systems Integration en Moleculaire en Moleculaire Celbiologie programma's) naar FI Ataullakhanov, NIH verlenen GM R01 GM033787 JR McIntosh, en een Dmitry Zimin Dynasty Stichting postdoctoraal fellowship aan VAV

Materials

Table 1: Microscopy and other equipment.
Microscope Zeiss
Nikon
Axio Imager 2
Eclipse Ti
other microscope models capable of DIC and epi-fluorescence-imaging can be used
Objective Zeiss
Nikon
420490-9900-000
CFI Apo 100x Oil 1.49
100X, DIC, 1.3-1.49 NA
Objective heater Bioptechs 150803, 150819-19
Fluorescent filter cube Chroma 49004 or 49008
41017 or 49020
optimized for Rhodamine fluorescence 
optimized for GFP fluorescence
Acquisition software freeware MicroManager
Molecular Devices
not applicable
MetaMorph 7.5
http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/
other software can be used to acquire images and for a particle tracking
EMCCD camera Andor iXon3, DU-897E-cs0-#BV Highly sensitive EMCCD camera
Trapping laser IPG Photonics YLR-10-1064-LP 1064 nm laser, 10 W
Fluorescence excitation lasers Coherent, Inc.
Coherent, Inc.
Sapphire 488 LP
Sapphire 552 LP
excitation of green fluorophores
excitation of red fluorophores
Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-001
Commercial flow chambers Warner Instruments RC-20 or RC-30
Perfusion pump Cole Palmer
Harvard Apparatus
Masterflex 77120-52
Pico Plus
Both pumps provide the required rate of liquid flow but a peristaltic pump may pulse at very slow speed. The flow with a syringe pump is more consistent for a wide range of rates but this pump has inertia. 
Table 2: Microscopy chamber preparation.
Modified microscope slides for reusable chambers Precision Glassblowing of Colorado Custom order www.precisionglassblowing.com Sonic slots in slides using schematics in Figure 1
Polyethylene tubing Intramedic 427410 I.D. 0.58 mm, O.D. 0.965 mm; use these tubes to connect assembled chamber to the pump and waste container
Polyethylene tubing Intramedic 427400 I.D. 0.28 mm, O.D. 0.61 mm; use these tubes to make the reusable chamber
Regular microscope slides VWR 48312-003 Other similar slides can be used
Coverslips VWR 48393-150, 48366-067 Other similar coverslips can be used
Silicon sealant World Precision Instruments KIT, SILICON SEALANT 5 MIN CURE
Epoxy glue Loctite 83082
Cyanoacrylate adhesive Scotch 3M AD114 Or cyanoacrylate adhesive from other manufacturers
Table 3: Coverslips cleaning and coating.
Molecular Sieves, Grade 564 Macron 4490-04
Coverglass Staining Jar Ted Pella, Inc. 21036
Coverslip Ceramic Holder Thomas Scientific 8542e40
PlusOne Repel Silane GE Healthcare Biosciences 17-1332-01
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443
Anti-digoxigenin AB Roche applied science 11093274910
Table 4: Preparation of seeds and segmented microtubules.
Tubulin purified from cow brains
Cytoskeleton, Inc
 
T238P
For purification protocols see 49–51
Unlabeled porcine tubulin
Labeled tubulin Cytoskeleton, Inc
Invitrogen
Invitrogen
TL590M
C1171 (Rhodamine)
A-2952 (Digoxigenin)
Rhodamine-labeled porcine tubulin
Tubulin can be labeled with any amine-reactive dye as in reference52.
GMPCPP Jena Biosciences NU-405 Aliquot and store at -70 °C
VALAP vaseline, lanolin, and paraffin at 1:1:2 by mass see ref. 9

References

  1. Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 13, 83-117 (1997).
  2. Mitchison, T. M., Kirschner, M. W. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (15), 237-242 (1984).
  3. Walker, R. A., Brien, O., et al. Dynamic Instability of Individual Microtubules Analyzed by Video Light Microscopy: Rate Constants and Transition Frequencies. J. Cell Biol. 107, 1437-1448 (1988).
  4. Gardner, M. K., Zanic, M., Gell, C., Bormuth, V., Howard, J. Depolymerizing Kinesins Kip3 and MCAK Shape Cellular Microtubule Architecture by Differential Control of Catastrophe. Cell. 147 (5), 1092-1103 (2011).
  5. Lombillo, V. A., Stewart, R. J., McIntosh, J. R. Minus-end-directed motion of kinesin-coated microspheres driven by microtubule depolymerization. Nature. 373, 161-164 (1995).
  6. Franck, A. D., Powers, A. F., Gestaut, D. R., Gonen, T., Davis, T. N., Asbury, C. L. Tension applied through the Dam1 complex promotes microtubule elongation providing a direct mechanism for length control in mitosis. Nat. Cell Biol. 9 (7), 832-837 (2007).
  7. Tran, P. T., Walker, R. A., Salmon, E. D. A metastable intermediate state of microtubule dynamic instability that differs significantly between plus and minus ends. J. Cell Biol. 138 (1), 105-117 (1997).
  8. Grishchuk, E. L., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R. Force production by disassembling microtubules. Nature. 438, 384-388 .
  9. Coue, M., Lombillo, A., Richard, J. Microtubule Depolymerization Promotes Particle and Chromosome Movement In Vitro. J. Cell Biol. 112 (6), 1165-1175 (1991).
  10. Grishchuk, E. L., Spiridonov, I. S., et al. Different assemblies of the DAM1 complex follow shortening microtubules by distinct mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (19), 6918-6923 (2008).
  11. Asbury, C. L., Gestaut, D. R., Powers, A. F., Franck, A. D., Davis, T. N. The Dam1 kinetochore complex harnesses microtubule dynamics to produce force and movement. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (26), 9873-9878 (2006).
  12. Westermann, S., Wang, H. -. W., Avila-Sakar, A., Drubin, D. G., Nogales, E., Barnes, G. The Dam1 kinetochore ring complex moves processively on depolymerizing microtubule ends. Nature. 440 (7083), 565-569 (2006).
  13. Grissom, P. M., Fiedler, T., Grishchuk, E. L., Nicastro, D., West, R. R., Mcintosh, J. R. Kinesin-8 from Fission Yeast A Heterodimeric , Plus-End – directed Motor that Can Couple Microtubule Depolymerization to Cargo Movement. Mol. Biol. Cell. 20, 963-972 (2009).
  14. McIntosh, J. R., Volkov, V., Ataullakhanov, F. I., Grishchuk, E. L. Tubulin depolymerization may be an ancient biological motor. J. Sci. 123, 3425-3434 (2010).
  15. Grishchuk, E. L., McIntosh, J. R., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I. Force generation by dynamic microtubule polymers. Compr. Biophys. 4, 93-117 (2012).
  16. Asbury, C. L., Tien, J. F., Davis, T. N. Kinetochores’ gripping feat: conformational wave or biased diffusion. Trends Cell Biol. (1), 38-46 (2011).
  17. Tien, J. F., Umbreit, N. T., et al. Cooperation of the Dam1 and Ndc80 kinetochore complexes enhances microtubule coupling and is regulated by aurora B. Cell Biol. 189 (4), 713-723 (2010).
  18. Gestaut, D. R., Graczyk, B., et al. Phosphoregulation and depolymerization-driven movement of the Dam1 complex do not require ring formation. Nat. Biol. 10 (4), 407-414 (2008).
  19. Schmidt, J. C., Arthanari, H., et al. The Kinetochore-Bound Ska1 Complex Tracks Depolymerizing Microtubules and Binds to Curved Protofilaments. Dev. Cell. 23 (5), 968-980 (2012).
  20. Brouhard, G. J., Stear, J. H., et al. XMAP215 is a processive microtubule polymerase. Cell. 132 (1), 79-88 (2008).
  21. Stumpff, J., Du, Y., et al. A Tethering Mechanism Controls the Processivity and Kinetochore-Microtubule Plus-End Enrichment of the Kinesin-8 Kif18A. Mol. Cell. 43 (5), 764-775 (2011).
  22. Su, X., Qui, W., Gupta, M., Pereira-Leal, J., Reck-Peterson, S. L., Pellman, D. Mechanisms underlying the dual-mode regulation of microtubule dynamics by Kip3/kinesin-8. Mol. Cell. 43 (5), 751-763 (2011).
  23. Helenius, J., Brouhard, G., Kalaidzidis, Y., Diez, S., Howard, J. The depolymerizing kinesin MCAK uses lattice diffusion to rapidly target microtubule ends. Nature. 441 (7089), 115-119 (2006).
  24. Gudimchuk, N., Vitre, B., et al. Kinetochore kinesin CENP-E is a processive bi-directional tracker of dynamic microtubule tips. Nat. Cell Biol. 15 (9), 1079-1088 (2013).
  25. Akhmanova, A., Steinmetz, M. Microtubule +TIPs at a glance. J. Sci. 20 (Pt 20), 3415-3419 (2010).
  26. Dixit, R., Barnett, B., Lazarus, J., Tokito, M., Goldman, Y., Holzbaur, E. Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (2), 492-497 (2009).
  27. Grishchuk, E. L., Efremov, A. K., et al. The Dam1 ring binds microtubules strongly enough to be a processive as well as energy-efficient coupler for chromosome motion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (40), 15423-15428 (2008).
  28. Akiyoshi, B., Sarangapani, K. K., et al. Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments. Nature. 468 (7323), 576-579 (2010).
  29. McIntosh, J. R., Grishchuk, E. L., et al. Fibrils Connect Microtubule Tips with Kinetochores A Mechanism to Couple Tubulin Dynamics to Chromosome Motion. Cell. 135 (2), 322-333 (2008).
  30. Powers, A. F., Franck, A. D., et al. The Ndc80 kinetochore complex forms load-bearing attachments to dynamic microtubule tips via biased diffusion. Cell. 136 (5), 865-875 (2009).
  31. Umbreit, N. T., Gestaut, D. R., et al. The Ndc80 kinetochore complex directly modulates microtubule dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (40), 16113-16118 (2012).
  32. Gell, C., Bormuth, V., et al. Microtubule Dynamics Reconstituted In Vitro and Imaged by Single-Molecule Fluorescence Microscopy. Methods Biol. 95, 221-245 (2010).
  33. Dixit, R., Ross, J. L. Studying Plus-End Tracking at Single Molecule Resolution Using TIRF Microscopy. Methods Cell Biol. 95, 543-554 (2010).
  34. Beausang, F. J., Sun, Y., Quinlan, E. M., Forkey, N. J., Goldman, Y. Construction of Flow Chambers for Polarized Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (polTIRFM). Cold Spring Harbour Protoc. 6, 712-715 (2012).
  35. Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D. N., Unwin, N., Mitchison, T. J. Role of GTP Hydrolysis in Microtubule Dynamics: Information from a Slowly Hydrolyzable Analogue, GMPCPP. Mol. Biol. Cell. 3, 1155-1167 (1992).
  36. Grishchuk, E. L., Ataullakhanov, F. I. In Vitro Assays to Study the Tracking of Shortening Microtubule Ends and to Measure Associated Forces. Methods Cell Biol. 95, 657-676 (2010).
  37. Gutiérrez-Medina, B., Block, S. M. Visualizing individual microtubules by bright field microscopy. Am. J. Phys. 78 (11), 1152-1159 (2010).
  38. Volkov, V. A., Zaytsev, A. V., et al. Long tethers provide high-force coupling of the Dam1 ring to shortening microtubules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (19), 7708-7713 (2013).
  39. Laan, L., Pavin, N., et al. Cortical dynein controls microtubule dynamics to generate pulling forces that position microtubule asters. Cell. 148 (3), 502-514 (2012).
  40. Myster, S. H., Knott, J. A., O’Toole, E., Porter, M. E. The Chlamydomonas Dhc1 gene encodes a dynein heavy chain subunit required for assembly of the I1 inner arm complex. Mol. Biol. Cell. 8, 607-620 (1997).
  41. Lombillo, V. A., Coue, M., McIntosh, J. R. In vitro motility assays using microtubules tethered to Tetrahymena pellicles. Methods Cell Biol. 39, 149-165 (1993).
  42. Hyman, A., Chrétien, D., Arnal, I., Wade, R. Structural changes accompanying GTP hydrolysis in microtubules: information from a slowly hydrolyzable analogue guanylyl-(alpha,beta)-methylene-diphosphonate. J. Cell Biol. 128 (1-2), 117-125 (1995).
  43. Park, M., Kim, H., Kim, D., Song, N. W. Counting the Number of Fluorophores Labeled in Biomolecules by Observing the Fluorescence-Intensity Transient of a Single Molecule. Bull. Chem. Soc. Jap. 78, 1612-1618 (2005).
  44. Welburn, J. P. I., Grishchuk, E. L., Backer, C. B., Wilson-Kubalek, E. M., Yates, J. R., Cheeseman, I. M. The human kinetochore Ska1 complex facilitates microtubule depolymerization-coupled motility. Dev. Cell. 16 (3), 374-385 (2009).
  45. Efremov, A., Grishchuk, E. L., Mcintosh, J. R., Ataullakhanov, F. I. In search of an optimal ring to couple microtubule depolymerization to processive chromosome motions. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (48), 19017-19022 (2007).
  46. Itoh, T., Hisanaga, S., Hosoi, T., Kishimoto, T., Hotani, H. Phosphorylation states of microtubule-associated protein 2 (MAP2) determine the regulatory role of MAP2 in microtubule dynamics. Biochemistry. 36 (41), 12574-12582 (1997).
  47. Oguchi, Y., Uchimura, S., Ohki, T., Mikhailenko, S. V., Ishiwata, S. The bidirectional depolymerizer MCAK generates force by disassembling both microtubule ends. Nat. Biol. (6), 1-8 (2011).
  48. Kishino, A., Yanagida, T. Force measurements by micromanipulation of a single actin filament by glass needles. Nature. 334, 74-76 (1988).
  49. Borisy, G. G., Marcum, J. M., Olmsted, J. B., Murphy, D. B., Johnson, K. A. Purification of tubulin and associated high molecular weight proteins from porcine brain and characterization of microtubule assembly in vitro. Ann. NY Acad. Sci. 253, 107-132 (1975).
  50. Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S., Kirschner, M. W. A Protein Factor Essential for Microtubule Assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72 (5), 1858-1862 (1975).
  51. Widlund, P. O., Podolski, M., et al. One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources. Mol. Biol. Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).
  52. Hyman, A., Drechsel, D., et al. Preparation of Modified Tubulins. Methods Enzymol. 196, 478-485 (1991).

Play Video

Cite This Article
Volkov, V. A., Zaytsev, A. V., Grishchuk, E. L. Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends. J. Vis. Exp. (85), e51150, doi:10.3791/51150 (2014).

View Video