Préparation des microtubules sectoriels pour étudier les motions Poussé par le démontage microtubules Ends

Summary

Les microtubules sont des polymères intrinsèquement instables, et leur commutation entre la croissance et de raccourcissement est stochastique et difficile à contrôler. Nous décrivons ici les protocoles à l'aide de microtubules segmentés avec des bouchons de stabilisation photoablatable. Dépolymérisation des microtubules segmentées peut être déclenchée avec une résolution temporelle et spatiale, aidant ainsi l'analyse de mouvements avec les extrémités des microtubules démontage.

Abstract

Dépolymérisation des microtubules peut fournir une force pour le transport de différents complexes de protéines et de perles revêtus de protéine in vitro. Les mécanismes sous-jacents sont supposés jouer un rôle essentiel dans les mouvements des chromosomes microtubules dépend cours de la division cellulaire, mais les protéines concernées et leurs rôles exacts sont mal définis. Ainsi, il ya un besoin croissant de développer des tests qui permettent d'examiner cette motilité in vitro en utilisant des composants purifiés et milieu biochimique défini. Les microtubules, cependant, sont par nature instables des polymères; leur commutation entre la croissance et le raccourcissement est stochastique et difficile à contrôler. Les protocoles que nous décrivons ici profiter des microtubules segmentées qui sont faites avec le photoablatable stabilisation bouchons. La dépolymérisation des microtubules tels segmentées peut être déclenchée avec une résolution spatiale et temporelle élevée, aidant de ce fait les études de motilité au niveau des extrémités de désassemblage des microtubules. Cette technique peut être utilisée pour carry à une analyse quantitative du nombre de molécules dans les complexes de protéines marquées par fluorescence, qui se déplacent avec processively dynamique des microtubules se termine. Afin d'optimiser un rapport signal sur bruit dans cet et d'autres dosages quantitatifs fluorescentes, des lamelles doivent être traités pour réduire l'absorption non spécifique de protéines solubles marqués par fluorescence. Des protocoles détaillés sont prévus pour prendre en compte les irrégularités de l'illumination fluorescente, et déterminer l'intensité d'un fluorophore unique en utilisant l'ajustement gaussien équidistants. Enfin, nous décrivons l'utilisation des microtubules segmentés pour étudier les mouvements des microtubules dépendant des microbilles de revêtus de protéine, apportant des éclairages sur la capacité des différentes protéines motrices et non motrices à deux dépolymérisation des microtubules au mouvement de la cargaison processive.

Introduction

Les microtubules sont des structures hautement conservées du cytosquelette qui sont importants pour l'architecture cellulaire, la motilité cellulaire, la division cellulaire, le transport intracellulaire et ^1. Ces polymères dynamiques assembler à partir de tubuline en présence de GTP, et ils commutent spontanément entre la croissance et le raccourcissement ^2. Les microtubules sont très mince (seulement 25 nm de diamètre) donc des techniques optiques spéciales pour renforcer le contraste doit être utilisé pour observer les microtubules avec un microscope optique. Les travaux antérieurs de ces polymères a examiné leur comportement dynamique utilisant contraste interférentiel différentiel (DIC) ^3. Et d'autres semblables études in vitro ont montré que dans des conditions expérimentales typiques, les microtubules subissent catastrophe et passer à la dépolymérisation que rarement, une fois tous les 5-15 min (cette fréquence est de 7-15 mM concentration de tubuline soluble examiné à 28-32 ° C ) ^4. Différentes techniques ont ainsi été proposés à inductione dépolymérisation des microtubules d'une manière contrôlée. Raccourcissement des microtubules peut être déclenché par élimination par lavage de la tubuline soluble ^5,6, coupant microtubules avec un faisceau laser à ^7, ou en utilisant des microtubules segmentées ^8, comme décrit ici. Des travaux antérieurs utilisant microtubules segmentés, ainsi que les polymères de commutation stochastique, a trouvé que les petites cargaisons intracellulaires, comme les chromosomes, vésicules, et perles de revêtus de protéine, peuvent se déplacer à l'extrémité des microtubules de raccourcissement ^9-13. Ce phénomène est supposé avoir une incidence directe sur les mouvements des chromosomes dans les cellules en mitose, et les mécanismes sous-jacents sont actuellement sous enquête ^14-16.

Récemment, des techniques fluorescentes base, y compris la fluorescence totale interne de réflexion (FRBR) microscopie, ont été utilisées pour étudier la motilité de microtubules dynamique extrémités ^17-24. L'avantage de cette approche est qu'elle permet l'examen de l'interactions entre les microtubules et les protéines des microtubules contraignant en temps réel à l'aide de protéines marquées avec des fluorophores différents. Plusieurs complexes de protéines ont été trouvés pour déplacer processively avec allongement et / ou raccourcissement des extrémités des microtubules. Ils comprennent les protéines associées aux microtubules Dam1 ^10,12,18, SKA1 ^19, et XMAP215 ^20, ainsi que les moteurs de kinésine Kif18A ^21,22, MCAK ²³ et CENP-E ^24. Ces protéines présentent pointe de suivi processive, qui est fondamentalement différente de celle des protéines de pointe de suivi classiques comme EB1 ^25. Bien que les molécules EB1 et les partenaires associés semblent rester stable associée à des microtubules dynamique se termine, les molécules individuelles restent liés à la pointe des microtubules pour seulement ~ 0,8 sec, échanger rapidement avec la piscine soluble ^26. En revanche, la pointe des trackers processives, comme Dam1, voyagent avec des microtubules se termine pour beaucoup de microns, et leur association avec des conseils de microtubules peuvent durer mdes secondes. La pointe de temps de l'association, ainsi que le taux de suivi résultant, dépend fortement du nombre de molécules qui forment la pointe de suivi complexe ^27. Plus grands ensembles de protéines sont généralement beaucoup mieux la pointe des trackers. Par exemple, ces ensembles complexes que les kinétochores de levure isolées peuvent rester couplé à des microtubules extrémités pour heures ^28. Certaines protéines de microtubules liaison, par exemple Ndc80 complexe protéique kinétochore, ont été trouvés dans l'impossibilité de suivre avec microtubules se termine à un niveau de la molécule unique, encore Ndc80 est très efficace dans le couplage de la motion de perle cargaison ^19,29-31. Ainsi, afin de comprendre le mécanisme de la pointe de poursuite par différents complexes protéiques, ainsi que leurs rôles biologiques, il est important d'examiner la pointe de suivi en fonction du nombre de molécules dans le complexe de la pointe de poursuite, ainsi que pour déterminer la capacité de ces complexes à exposer la motilité collective sur la surface de chargement des billes.

<p class="jove_content"> Ci-dessous nous fournissons des protocoles détaillés de préparer et de mener des expériences avec les microtubules segmentés (figure 1A). Tout d'abord, les lames de verre sont disponibles dans le commerce modifiés pour attacher court tube en polyéthylène (protocole 1). La chambre d'écoulement de microscopie réutilisable est ensuite assemblée à partir d'un tel coulisseau et le plasma nettoyé et traité au silane lamelle (protocole 2) ^{32 à 34} chimiquement ou. Le volume de la chambre résultant est seulement 20-25 pi (ou aussi petite que 15 pi, voir la note 3 dans le Protocole 1), y compris le volume de la tubulure d'admission. Disponibles dans le commerce chambres d'écoulement peuvent également être utilisés, mais leur volume est généralement plus grande, ce qui conduit à la perte inutile de protéines. Si une chambre plus grande est utilisé, le volume de toutes les solutions dans les protocoles ci-dessous doit être réduite proportionnellement. graines de microtubules sont ensuite préparées, par exemple en utilisant lentement hydrolysable du GTP analogique, GMPCPP (guanosine-5'-[(α, β)-methyleno] triphosphate) (protocole 3, voir aussi Hyman <em> et al. ^35). Les graines sont immobilisés sur une lamelle couvre-objet et la surface nettoyée est ensuite bloquée pour empêcher l'absorption non spécifique d'autres protéines ³² (protocole 4 décrit l'immobilisation de graines à l'aide de la digoxigénine). Les microtubules segmentés peuvent être préparés en utilisant le protocole 5. La raison principale de cette approche est que les polymères de microtubules dynamiques, qui se forment dans la présence de GTP, peuvent être temporairement stabilisée par l'ajout des «caps» de courtes segments de tubuline stables, qui contiennent GMPCPP. Ces capsules contiennent également de la tubuline marqué à la rhodamine, de sorte qu'ils peuvent être éliminés simplement en illuminant le champ de vision avec un laser de 530 à 550 nm ou une lampe à arc au mercure (Protocole 6) ^36. L'intensité de fluorescence du signal de suivi de pointe peut alors être utilisée pour estimer le nombre de molécules qui se déplacent avec les extrémités de désassemblage des microtubules, en tenant compte de l'irrégularité de l'éclairement de champ de microscope (Protocole 7). Une approche similaire peut être utiliséepour étudier les interactions entre les microtubules de dépolymérisation et de perles de protéine revêtu, préparé comme décrit dans ²⁷ (protocole n ° 8). Certaines protéines se lient facilement aux parois des microtubules segmentées, mais pinces laser peuvent également être utilisés pour la tenue du bourrelet à proximité de la paroi des microtubules, ce qui favorise sa fixation.

Protocol

Équipement requis: Les expériences décrites ci-dessous requièrent un microscope optique équipé pour DIC et l'imagerie de fluorescence (tableau 1). Champ lumineux éclairage LED peut être utilisé pour améliorer de façon significative la détection des graines des microtubules lamelle-joint 37, qui sont difficiles à observer avec une lampe halogène régulière. Pour contrôler l'écoulement du liquide dans les chambres de microscopie, les solutions doivent ?…

Representative Results

Suivi de la dépolymérisation des microtubules protéines se termine. Levure kinetochore composant Dam1 est de loin le meilleur conseil-tracker de la dépolymérisation des microtubules se termine 14. Ce complexe de 10 sous-unité marquée par la GFP peut être facilement exprimée et purifiée à partir de cellules bactériennes 18,38, nous vous recommandons donc l'utiliser comme un contrôle positif pour le dosage de la pointe de suivi. Une protéine fluorescente qui permet …

Discussion

De nombreux essais de molécules simples de nos jours utilisent couramment des lamelles spécialement traitées pour réduire considérablement non spécifique de protéines de collage. La procédure que nous décrivons ici est une modification du protocole original développé en laboratoire Howard ^32, et nous constatons que silaniser les lamelles vaut bien l'effort même avec les dosages de perles à base de DIC, qui n'utilisent pas de fluorescence. Chambers assemblés avec ces lamelles présentent …

Materials

			Table 1: Microscopy and other equipment.
Microscope	Zeiss Nikon	Axio Imager 2 Eclipse Ti	other microscope models capable of DIC and epi-fluorescence-imaging can be used
Objective	Zeiss Nikon	420490-9900-000 CFI Apo 100x Oil 1.49	100X, DIC, 1.3-1.49 NA
Objective heater	Bioptechs	150803, 150819-19
Fluorescent filter cube	Chroma	49004 or 49008 41017 or 49020	optimized for Rhodamine fluorescence  optimized for GFP fluorescence
Acquisition software	freeware MicroManager Molecular Devices	not applicable MetaMorph 7.5	http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/ other software can be used to acquire images and for a particle tracking
EMCCD camera	Andor	iXon3, DU-897E-cs0-#BV	Highly sensitive EMCCD camera
Trapping laser	IPG Photonics	YLR-10-1064-LP	1064 nm laser, 10 W
Fluorescence excitation lasers	Coherent, Inc. Coherent, Inc.	Sapphire 488 LP Sapphire 552 LP	excitation of green fluorophores excitation of red fluorophores
Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC-001
Commercial flow chambers	Warner Instruments	RC-20 or RC-30
Perfusion pump	Cole Palmer Harvard Apparatus	Masterflex 77120-52 Pico Plus	Both pumps provide the required rate of liquid flow but a peristaltic pump may pulse at very slow speed. The flow with a syringe pump is more consistent for a wide range of rates but this pump has inertia.

			Table 2: Microscopy chamber preparation.
Modified microscope slides for reusable chambers	Precision Glassblowing of Colorado	Custom order www.precisionglassblowing.com	Sonic slots in slides using schematics in Figure 1
Polyethylene tubing	Intramedic	427410	I.D. 0.58 mm, O.D. 0.965 mm; use these tubes to connect assembled chamber to the pump and waste container
Polyethylene tubing	Intramedic	427400	I.D. 0.28 mm, O.D. 0.61 mm; use these tubes to make the reusable chamber
Regular microscope slides	VWR	48312-003	Other similar slides can be used
Coverslips	VWR	48393-150, 48366-067	Other similar coverslips can be used
Silicon sealant	World Precision Instruments	KIT, SILICON SEALANT 5 MIN CURE
Epoxy glue	Loctite	83082
Cyanoacrylate adhesive	Scotch 3M	AD114	Or cyanoacrylate adhesive from other manufacturers

			Table 3: Coverslips cleaning and coating.
Molecular Sieves, Grade 564	Macron	4490-04
Coverglass Staining Jar	Ted Pella, Inc.	21036
Coverslip Ceramic Holder	Thomas Scientific	8542e40
PlusOne Repel Silane	GE Healthcare Biosciences	17-1332-01
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Anti-digoxigenin AB	Roche applied science	11093274910

			Table 4: Preparation of seeds and segmented microtubules.
Tubulin	purified from cow brains Cytoskeleton, Inc	T238P	For purification protocols see 49–51 Unlabeled porcine tubulin
Labeled tubulin	Cytoskeleton, Inc Invitrogen Invitrogen	TL590M C1171 (Rhodamine) A-2952 (Digoxigenin)	Rhodamine-labeled porcine tubulin Tubulin can be labeled with any amine-reactive dye as in reference52.
GMPCPP	Jena Biosciences	NU-405	Aliquot and store at -70 °C
VALAP	vaseline, lanolin, and paraffin at 1:1:2 by mass		see ref. 9