Vorbereitung der segmentierte Mikrotubuli auf Anträge von der Demontage Microtubule Ends Driven Studieren
Summary
Mikrotubuli sind Polymere von Natur aus instabil, und deren Umschaltung zwischen Wachstum und Verkürzung stochastisch und schwierig zu steuern. Hier beschreiben wir Protokolle mit segmentierten Mikrotubuli mit photoablatable stabilisierende Kappen. Depolymerisation von Mikrotubuli segmentiert mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung ausgelöst werden, wodurch die Unterstützung Analyse der Bewegungen mit den Mikrotubuli-Enden der Demontage.
Abstract
Mikrotubuli-Depolymerisation Kraft zu liefern, um verschiedene Proteinkomplexe und Perlen-Protein-beschichteten in vitro zu transportieren. Die zugrunde liegenden Mechanismen sind vermutlich eine wichtige Rolle bei der Mikrotubuli-abhängige Chromosomenbewegungen während der Zellteilung spielen, aber die entsprechenden Proteine und ihre genauen Aufgaben sind schlecht definiert. Somit gibt es einen wachsenden Bedarf an Assays, mit denen eine solche Beweglichkeit in vitro-Studie unter Verwendung von gereinigten Komponenten und definierten biochemischen Milieu entwickeln. Mikrotubuli sind jedoch inhärent instabil Polymere, ihre Umschaltung zwischen Wachstum und Verkürzung stochastisch und schwierig zu steuern. Die Protokolle beschreiben wir hier die Vorteile der segmentierten Mikrotubuli, die mit der Stabilisierung photoablatable Kappen hergestellt werden. Depolymerisation von solchen segmentierten Mikrotubuli mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung ausgelöst werden, wodurch die Unterstützung der Motilität Studien an den Mikrotubuli-Enden der Demontage. Diese Technik kann verwendet werden, um ca.RRY eine quantitative Analyse der Anzahl der Moleküle in der fluoreszenzmarkierte Proteinkomplexe, die mit dynamischen Mikrotubuli prozessiv Enden zu bewegen. Ein Signal-zu-Rausch-Verhältnis in diesem und anderen quantitativen Fluoreszenz-Assays zu optimieren, sollte Deck behandelt, um unspezifische Absorption von löslichen fluoreszierend markierten Proteinen zu reduzieren. Detaillierte Protokolle vorgesehen sind, um der Unebenheit der Fluoreszenzbeleuchtung zu nehmen und zu bestimmen, die die Intensität eines einzelnen Fluorophors mit äquidistanten Gauß Form. Schließlich beschreiben wir die Verwendung von segmentierten Mikrotubuli Mikrotubuli-abhängigen Bewegungen der Protein-beschichteten Mikroperlen zu untersuchen, die einen Einblick in die Fähigkeit der verschiedenen Motor-und nichtmotorisiertem Proteine zu koppeln Mikrotubuli-Depolymerisation prozessive Fracht Bewegung.
Introduction
Mikrotubuli sind hoch konserviert Strukturen des Zytoskeletts, die wichtig für die zelluläre Architektur, Zellbewegung, Zellteilung und intrazellulären Transport 1 sind. Diese dynamischen Polymeren zusammen von Tubulin in Gegenwart von GTP und spontan zwischen Wachstum und Verkürzung 2 wechseln. Mikrotubuli sind sehr dünn (nur 25 nm Durchmesser) daher besondere optische Techniken, um Kontrast verbessern sollte verwendet werden, um Mikrotubuli mit einem Lichtmikroskop zu beobachten. Frühere Arbeiten mit diesen Polymeren untersucht ihr dynamisches Verhalten mit Differentialinterferenzkontrast (DIC) 3. Diese und ähnliche Studien in vitro gezeigt, dass unter typischen experimentellen Bedingungen, die Mikrotubuli unterziehen Katastrophe und Schalter auf der Depolymerisation nur selten, einmal alle 5-15 Minuten (diese Frequenz für 7-15 mM bei 28 bis 32 ° C untersucht löslich Tubulin-Konzentration ) 4. Verschiedene Techniken wurden so Induktions vorgeschlagene Depolymerisation von Mikrotubuli in einer kontrollierten Weise. Mikrotubuli Verkürzung kann durch Waschen entfernt lösliche 5,6 Tubulin, Mikrotubuli Schneiden mit einem Laserstrahl 7 oder 8 unter Verwendung von segmentierten Mikrotubuli, wie hier beschrieben, ausgelöst werden. Frühere Arbeiten mit segmentierten Mikrotubuli sowie stochastisch Schalt Polymere, hat festgestellt, dass die kleinen intrazellulären Ladungen, wie Chromosomen, Vesikel und Perlen-Protein-beschichtet ist, kann an den Enden der Mikrotubuli Verkürzung 9-13 bewegen. Dieses Phänomen wird gedacht, um eine direkte Auswirkungen auf Chromosom Bewegungen in mitotischen Zellen zu haben, und die zugrunde liegenden Mechanismen sind derzeit aktiv untersucht 14-16.
Kürzlich, fluoreszenzbasierten Techniken, einschließlich der vollständigen internen Reflexion (TIRF) Mikroskopie, wurden eingesetzt, um die Motilität mit dynamischen Mikrotubuli untersuchen endet 17-24. Der Vorteil dieses Ansatzes ist, dass es ermöglicht die Untersuchung der Wechselwirkungs zwischen Mikrotubuli und Mikrotubuli-bindende Proteine in Echtzeit unter Verwendung von Proteinen mit verschiedenen Fluorophoren markiert sind. Mehrere Protein-Komplexe wurden gefunden, um prozessiv mit Verlängerung und / oder Verkürzung der Mikrotubuli-Enden zu bewegen. Sie umfassen die Mikrotubuli-assoziierten Proteinen Dam1 10,12,18, SKA1 19 und 20 XMAP215 sowie Kinesin-Motoren Kif18A 21,22, MCAK 23 und CENP-E 24. Diese Proteine zeigen prozessive tip-Tracking, die sich grundlegend von der der klassischen Spitze-Tracking-Proteine wie EB1 25 ist. Obwohl EB1-Moleküle und die assoziierten Partner erscheinen stabil mit dynamischen Mikrotubuli-Enden, die einzelnen Moleküle bleiben an der Spitze der Mikrotubuli für nur ~ 0,8 s gebunden ist, schnell den Austausch mit dem löslichen Pool 26 zugeordnet bleiben. Im Gegensatz dazu prozessive Spitze-trackers, wie Dam1, reisen mit Mikrotubuli-Enden für viele Mikrometer und ihre Assoziation mit Mikrotubuli-Tipps können für m dauernkeine Sekunden. Die Spitze Assoziation Zeit sowie die resultierende Geschwindigkeit der Verfolgung, hängt stark von der Anzahl der Moleküle, die die Spitze-Tracking-Komplex 27 zu bilden. Größere Protein-Ensembles sind in der Regel viel besser Spitze-trackers. Zum Beispiel können solche komplexen Baugruppen der isolierten Hefe Kinetochore Mikrotubuli gekoppelt bleiben Enden für 28 Stunden. Einige Mikrotubuli-bindende Proteine, wie zB Ndc80 Kinetochorenprotein Komplex gefunden werden nicht mit Mikrotubuli Bahnenden an einer Einzelmolekülebene, noch Ndc80 ist sehr effizient bei der Kopplung der Bewegung der Wulst Ladung 19,29-31. So, um den Mechanismus der Spitze-Tracking von verschiedenen Protein-Komplexe, sowie deren biologische Funktionen zu verstehen, ist es wichtig, Spitze-Tracking in Abhängigkeit von der Anzahl der Moleküle in der Spitze-Tracking-Komplex zu untersuchen, sowie um zu bestimmen, die Fähigkeit dieser Komplexe Tarif Motilität auf der Oberfläche der Perle Ladung aufweisen.
<p class="jove_content"> Im Folgenden geben wir ausführliche Protokolle mit segmentierten Mikrotubuli (1A) vorzubereiten und durchzuführen Experimenten. Zunächst werden die im Handel erhältlichen Glasobjektträger modifiziert, um kurze Polyethylenschlauch (Protokoll 1) befestigen. Die wiederverwendbare Mikroskopie Flusskammer wird dann aus wie eine Folie die chemisch oder Plasma-gereinigt und silanisierten Deckglas (Protokoll 2) 32-34 montiert und. Die daraus resultierende Raumvolumen ist nur 20-25 ul (oder so klein wie 15 ul, siehe Anmerkung 3 in Protokoll Nr. 1), einschließlich des Volumens der Einlassschlauch. Kommerziell erhältlich Strömungskammern können auch verwendet werden, aber ihr Volumen ist in der Regel größer, was zu einer unnötigen Verschwendung von Proteinen. Wenn eine größere Kammer verwendet wird, sollte das Volumen aller Lösungen in folgenden Protokolle proportional skaliert werden. Mikrotubuli Samen werden dann mit langsam hydrolysierbaren GTP-Analog, GMPCPP (Guanosin-5'-[(α, β)-methyleno] Triphosphat) (Protokoll 3 hergestellt, zum Beispiel, siehe auch Hyman <em> et al. 35). Die Samen werden auf einem gereinigten Deck immobilisiert und die Oberfläche wird anschließend blockiert, um die unspezifische Absorption von anderen Proteinen verhindern, 32 (Protokoll 4 beschreibt Samen Immobilisierung mit Digoxigenin). Die segmentierten Mikrotubuli können dann mit Protokoll Nr. 5 hergestellt werden. Der Hauptgrund für diesen Ansatz ist, dass dynamische Mikrotubuli-Polymere, die in Gegenwart von GTP zu bilden, kann vorübergehend durch Addieren der kurzen "Kappen" von stabilen Tubulin-Segmente, die GMPCPP enthalten stabilisiert werden. Diese Kappen enthalten Rhodamin-markierten Tubulin, so können sie einfach mit einem 530-550 nm-Laser-oder Quecksilberbogenlampe (Protokoll Nr. 6) 36 Beleuchten des Sichtfeldes entfernt werden. Die Fluoreszenzintensität der Spitze-Tracking-Signal kann dann verwendet werden, um die Anzahl der Moleküle, die mit der Demontage der Mikrotubuli-Enden reisen zu schätzen, unter Berücksichtigung der Unebenheiten des Mikroskops Feldbeleuchtung (Protokoll 7) werden. Ein ähnlicher Ansatz kann verwendet werden,Wechselwirkungen zwischen Depolymerisation von Mikrotubuli und Perlen-Protein-beschichteten, hergestellt wie in 27 (Protokoll 8) beschrieben zu studieren. Einige Proteine werden leicht an den Wänden des segmentierten Mikrotubuli binden, aber Laserpinzette können auch verwendet werden, um den Wulst in der Nähe der Mikrotubuli Wand halten, wodurch die Förderung ihrer verbindlich.Protocol
Representative Results
Discussion
Viele Einzelmolekül-Assays heutzutage routinemäßig speziell behandelt, um unspezifische Proteindeckknack drastisch zu reduzieren. Das Verfahren, das wir hier beschreiben, ist eine Modifikation der in Howard Labor 32 Original-Protokoll entwickelt, und wir finden, dass die Deckgläser Silanisierung ist die Mühe wert, auch mit DIC-basierte Assays Perle, die nicht mit Fluoreszenz. Kammern mit solchen Deckgebaut zeigen viel sauberer Oberflächen, und die in Gegenwart von löslichen Mikrotubuli-Bindungsprotein …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten FI Ataullakhanov für die Hilfe, für die Bereitstellung von Bildern für Zahlen, N. und P. Gudimchuk Zakharov für die Entwicklung eines Protokolls und die Bereitstellung Reagenzien zu entwickeln und herzustellen wiederverwendbare Strömungskammern, N. Dashkevich, N. und A. Gudimchuk Korbalev danke vorzubereiten Digoxigenin-markierten Mikrotubuli-Samen, A. Potapenko für die Hilfe bei Textbearbeitung und andere Mitglieder der Grishchuk Labor für Tipps und Diskussionen. Diese Arbeit wurde zum Teil unterstützt durch NIH gewähren GM R01-098389 und ein Pilot Zuschuss von Pennsylvania Muscle Institute ELG, der ein Kimmel Scholar ist, durch RFBR gewährt 12-04-00111-eine 13-04-40190-H und 13 -04-40188-H, Russische Akademie der Wissenschaften Präsidium Grants (Mechanismen des Molecular Systems Integration und Molekulare Zellbiologie und Molekulare Programme) zu FI Ataullakhanov, NIH gewähren GM R01 GM033787 JR McIntosh, und Dmitry Zimin Dynastie Stiftung Postdoc-Stipendium an VAV
Materials
| Table 1: Microscopy and other equipment. | |||
| Microscope | Zeiss Nikon |
Axio Imager 2 Eclipse Ti |
other microscope models capable of DIC and epi-fluorescence-imaging can be used |
| Objective | Zeiss Nikon |
420490-9900-000 CFI Apo 100x Oil 1.49 |
100X, DIC, 1.3-1.49 NA |
| Objective heater | Bioptechs | 150803, 150819-19 | |
| Fluorescent filter cube | Chroma | 49004 or 49008 41017 or 49020 |
optimized for Rhodamine fluorescence optimized for GFP fluorescence |
| Acquisition software | freeware MicroManager Molecular Devices |
not applicable MetaMorph 7.5 |
http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/ other software can be used to acquire images and for a particle tracking |
| EMCCD camera | Andor | iXon3, DU-897E-cs0-#BV | Highly sensitive EMCCD camera |
| Trapping laser | IPG Photonics | YLR-10-1064-LP | 1064 nm laser, 10 W |
| Fluorescence excitation lasers | Coherent, Inc. Coherent, Inc. |
Sapphire 488 LP Sapphire 552 LP |
excitation of green fluorophores excitation of red fluorophores |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Commercial flow chambers | Warner Instruments | RC-20 or RC-30 | |
| Perfusion pump | Cole Palmer Harvard Apparatus |
Masterflex 77120-52 Pico Plus |
Both pumps provide the required rate of liquid flow but a peristaltic pump may pulse at very slow speed. The flow with a syringe pump is more consistent for a wide range of rates but this pump has inertia. |
| Table 2: Microscopy chamber preparation. | |||
| Modified microscope slides for reusable chambers | Precision Glassblowing of Colorado | Custom order www.precisionglassblowing.com | Sonic slots in slides using schematics in Figure 1 |
| Polyethylene tubing | Intramedic | 427410 | I.D. 0.58 mm, O.D. 0.965 mm; use these tubes to connect assembled chamber to the pump and waste container |
| Polyethylene tubing | Intramedic | 427400 | I.D. 0.28 mm, O.D. 0.61 mm; use these tubes to make the reusable chamber |
| Regular microscope slides | VWR | 48312-003 | Other similar slides can be used |
| Coverslips | VWR | 48393-150, 48366-067 | Other similar coverslips can be used |
| Silicon sealant | World Precision Instruments | KIT, SILICON SEALANT 5 MIN CURE | |
| Epoxy glue | Loctite | 83082 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Scotch 3M | AD114 | Or cyanoacrylate adhesive from other manufacturers |
| Table 3: Coverslips cleaning and coating. | |||
| Molecular Sieves, Grade 564 | Macron | 4490-04 | |
| Coverglass Staining Jar | Ted Pella, Inc. | 21036 | |
| Coverslip Ceramic Holder | Thomas Scientific | 8542e40 | |
| PlusOne Repel Silane | GE Healthcare Biosciences | 17-1332-01 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Anti-digoxigenin AB | Roche applied science | 11093274910 |
| Table 4: Preparation of seeds and segmented microtubules. | |||
| Tubulin | purified from cow brains Cytoskeleton, Inc |
T238P |
For purification protocols see 49–51 Unlabeled porcine tubulin |
| Labeled tubulin | Cytoskeleton, Inc Invitrogen Invitrogen |
TL590M C1171 (Rhodamine) A-2952 (Digoxigenin) |
Rhodamine-labeled porcine tubulin Tubulin can be labeled with any amine-reactive dye as in reference52. |
| GMPCPP | Jena Biosciences | NU-405 | Aliquot and store at -70 °C |
| VALAP | vaseline, lanolin, and paraffin at 1:1:2 by mass | see ref. 9 |
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