Подготовка сегментированных микротрубочек исследовать движение приводится в действие разборки микротрубочек Ends

Summary

Микротрубочки нестабильны полимеры и их переключение между ростом и сокращением является стохастической и трудно контролировать. Здесь мы опишем протокола с сегментированные микротрубочки с photoablatable стабилизирующих колпачками. Деполимеризация сегментированных микротрубочек могут быть вызваны с высоким временным и пространственным разрешением, тем самым способствуя анализ движений с разборки концах микротрубочек.

Abstract

Микротрубочек деполимеризации может обеспечить силу для перевозки различных белковых комплексов и белковые покрытием бусы в пробирке. Основные механизмы, как полагают, играют жизненно важную роль в микротрубочки зависит движений хромосом во время деления клеток, но соответствующие белки и их точные роли плохо определены. Таким образом, существует растущая потребность в разработке анализов, с которой для изучения такой моторику в пробирке с использованием очищенных компонентов и определенный биохимический среду. Микротрубочки, однако, по сути своей нестабильными полимеры; их переключение между ростом и сокращением является стохастической и трудно контролировать. Протоколы мы описываем здесь воспользоваться сегментированных микротрубочек, которые сделаны с photoablatable стабилизации шапки. Деполимеризация таких сегментированных микротрубочек могут быть вызваны с высоким временным и пространственным разрешением, тем самым способствуя исследования моторики на разборки концах микротрубочек. Этот метод может быть использован до примерноRRY количественный анализ числа молекул в флуоресцентно меченных белковых комплексов, которые движутся поступательно с динамическим микротрубочек заканчивается. Для оптимизации отношения сигнал-шум в этом и других количественных флуоресцентный виды анализа, покровные должны рассматриваться, чтобы уменьшить неспецифическую поглощение растворимых дневно-меченых белков. Подробные протоколы предоставляются учитывать неравномерность флуоресцентного освещения, и определить интенсивность одной флуорофором использованием эквидистантный Gaussian нужным. Наконец, мы опишем использование сегментированных микротрубочек учиться микротрубочек в зависимости от движений микросфер белковых покрытием, обеспечивая полное представление о способности различных моторных и nonmotor белков в пары микротрубочек деполимеризации к поступательного движения грузов.

Introduction

Микротрубочки высоко консервативны цитоскелета структур, которые важны для клеточного архитектуры, подвижности клеток, клеточного деления, и внутриклеточного транспорта ^1. Эти динамические полимеры собрать из тубулина в присутствии ГТФ, и они спонтанно переключения между ростом и сокращения ^2. Микротрубочки являются очень тонкими (всего 25 нм в диаметре), следовательно, специальные оптические методы для повышения контрастности должен быть использован для наблюдения микротрубочки с помощью оптического микроскопа. Предыдущая работа с этих полимеров рассмотрены их динамическое поведение с использованием дифференциальной помехи контраст (DIC) ^3. Этот и подобные исследования в пробирке показали, что в типичных условиях эксперимента, микротрубочки пройти катастрофу и перейти к деполимеризации редко, раз в 5-15 мин (эта частота для 7-15 мм растворимого концентрации тубулина рассматриваемой при 28-32 ° С ) ^4. Различные методы, таким образом, было предложено индукэ микротрубочек деполимеризации в управляемом режиме. Микротрубочек сокращение может быть вызвано смывая растворимый тубулина ^5,6, резка микротрубочки с помощью лазерного луча ^7, или с использованием сегментированного микротрубочек ^8, как описано здесь. Предыдущие работы с использованием сегментированные микротрубочки, а также стохастически переключения полимеры, было установлено, что небольшие внутриклеточные грузы, такие как хромосом, везикулы и белковых покрытием шариков, можно переместить на концах укорочение микротрубочек ^9-13. Это явление, как полагают, прямое влияние на хромосомных движений в митотических клетках, и основные механизмы находятся в стадии активного расследования ^14-16.

Недавно люминесцентные основе методики, в том числе полного внутреннего отражения флуоресценции (TIRF) микроскопии, были использованы для изучения моторики с динамическим микротрубочки заканчивается ^17-24. Преимущество этого подхода состоит в том, что она позволяет исследование взаимодействияс между микротрубочек и микротрубочек-связывающих белков в режиме реального времени с использованием белков, меченных разными флуорофорами. Несколько белковые комплексы были найдены двигаться поступательно с удлинения и / или сокращения микротрубочек концы. Они включают в себя микротрубочек связанных белков Dam1 ^10,12,18, Ska1 ^19, и XMAP215 ^20, а также кинезин двигатели Kif18A ^21,22, MCAK ²³ и CENP-E ^24. Эти белки обладают поступательного наводку отслеживание, которое принципиально отличается от классических наконечника отслеживания белков, как EB1 ^25. Хотя EB1 молекулы и связанные с ними партнеры по-видимому, остаются стабильно связан с динамическим микротрубочек заканчивается, отдельные молекулы остаются связанными с наконечником микротрубочек только ~ 0,8 сек, быстро обмена с растворимым бассейне ^26. В противоположность этому, поступательного наконечник-трекеры, как Dam1, путешествовать с микротрубочек заканчивается для многих микрон, и их связь с советами микротрубочек может длиться млюбые секунд. Кончик время ассоциация, а также в результате скорость отслеживания, сильно зависит от числа молекул, которые формируют наконечник отслеживания комплекс ^27. Большие ансамбли белка, как правило, гораздо лучше наконечник-трекеры. Например, такие сложные агрегаты как изолированных дрожжей кинетохорах может оставаться в сочетании с микротрубочки заканчивается в течение нескольких часов ^28. Некоторые микротрубочки-связывающие белки, например кинетохор белкового комплекса Ndc80, как было установлено, не сможет отслеживать с микротрубочки заканчивается на уровне одной молекулы, но Ndc80 очень эффективно в соединительном движение шарика груза ^19,29-31. Таким образом, чтобы понять механизм наконечника слежения различными белковыми комплексами, а также их биологических функций, важно изучить наконечник отслеживания в зависимости от числа молекул в наконечнике отслеживания комплекса, а также для определения Способность этих комплексов проявляют коллективную подвижность на поверхности шарика груза.

<p class="jove_content"> Ниже мы приводим подробные протоколы для подготовки и проведения экспериментов с сегментированных микротрубочек (рис. 1А). Во-первых, коммерчески доступные предметные стекла были изменены, чтобы прикрепить короткую трубку из полиэтилена (Протокол 1). Многоразовые камеры микроскопии поток затем собирают из такого слайда и химически или плазменный очищены и Силанизированные покровное (протокол 2) ^32-34. В результате объем камеры составляет всего 20-25 мкл (или как малые, как 15 мкл, см. примечание 3 в Протоколе 1), в том числе объем впускной трубки. Коммерчески доступные камеры потока также могут быть использованы, но их объем, как правило, больше, что приводит к ненужному белков. Если увеличение размера камера используется, объем всех решений в поле ниже протоколов должны быть расширены пропорционально. Семена микротрубочек затем получают, например, с помощью медленно гидролизуемую аналога ГТФ, GMPCPP (Гуанозин-5'-[(α, β)-methyleno] трифосфат) (протокол 3, см. также Хайман <EM> и др.. ^35). Семена иммобилизуют на очищенную покровное и поверхность впоследствии заблокирован, чтобы предотвратить неспецифическую абсорбцию других белков ³² (протокол 4 описывает семена иммобилизацию с помощью дигоксигенин). Сегментированного микротрубочки могут быть получены с использованием протокола 5. Основным обоснованием для такого подхода является то, что динамические полимеры микротрубочки, образующие в присутствии ГТФ, можно стабилизировать временно, добавив короткие "шапки" стабильных сегментов тубулина, которые содержат GMPCPP. Эти шапки также содержат Родамин-меченого тубулина, таким образом, они могут быть удалены, просто освещая поле зрения с помощью лазера на 530-550 нм или дуговой ртутной лампы (протокол 6) ^36. Интенсивность флуоресценции сигнала наконечник отслеживания затем могут быть использованы для оценки количества молекул, которые путешествуют с разборки концах микротрубочек, принимая во внимание неравномерность освещения поля микроскоп (протокол 7). Аналогичный подход может быть использованизучить взаимодействие между деполимеризации микротрубочек и белка покрытием шариков, полученный, как описано в ⁽²⁷ протокола 8). Некоторые белки будут легко связываются с стенок сегментированных микротрубочек, но лазерные пинцеты также может быть использован для хранения шарик около микротрубочек стене, тем самым способствуя его связывания.

Protocol

Необходимое оборудование: Эксперименты, описанные ниже, требуют светового микроскопа оборудованная для ДВС и флуоресцентной томографии (табл. 1). Яркий поле светодиодная подсветка может быть использована, чтобы значительно улучшить обнаружение покровное подключени…

Representative Results

Белки слежения с деполимеризующим микротрубочек заканчивается. Дрожжи кинетохор компонент Dam1 на сегодняшний день лучший совет-трекер из деполимеризующих микротрубочки заканчивается 14. Этот 10-субъединица комплекс помечены GFP может быть легко выражено и очищают от бакт…

Discussion

Многие одинокие анализы молекул в настоящее время обычно используют специально обработанные покровные резко снизить неспецифическую налипание белка. Процедура мы описываем здесь является модификацией оригинального протокола, разработанного в лаборатории Ховард ^32, и мы наход?…

Materials

			Table 1: Microscopy and other equipment.
Microscope	Zeiss Nikon	Axio Imager 2 Eclipse Ti	other microscope models capable of DIC and epi-fluorescence-imaging can be used
Objective	Zeiss Nikon	420490-9900-000 CFI Apo 100x Oil 1.49	100X, DIC, 1.3-1.49 NA
Objective heater	Bioptechs	150803, 150819-19
Fluorescent filter cube	Chroma	49004 or 49008 41017 or 49020	optimized for Rhodamine fluorescence  optimized for GFP fluorescence
Acquisition software	freeware MicroManager Molecular Devices	not applicable MetaMorph 7.5	http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/ other software can be used to acquire images and for a particle tracking
EMCCD camera	Andor	iXon3, DU-897E-cs0-#BV	Highly sensitive EMCCD camera
Trapping laser	IPG Photonics	YLR-10-1064-LP	1064 nm laser, 10 W
Fluorescence excitation lasers	Coherent, Inc. Coherent, Inc.	Sapphire 488 LP Sapphire 552 LP	excitation of green fluorophores excitation of red fluorophores
Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC-001
Commercial flow chambers	Warner Instruments	RC-20 or RC-30
Perfusion pump	Cole Palmer Harvard Apparatus	Masterflex 77120-52 Pico Plus	Both pumps provide the required rate of liquid flow but a peristaltic pump may pulse at very slow speed. The flow with a syringe pump is more consistent for a wide range of rates but this pump has inertia.

			Table 2: Microscopy chamber preparation.
Modified microscope slides for reusable chambers	Precision Glassblowing of Colorado	Custom order www.precisionglassblowing.com	Sonic slots in slides using schematics in Figure 1
Polyethylene tubing	Intramedic	427410	I.D. 0.58 mm, O.D. 0.965 mm; use these tubes to connect assembled chamber to the pump and waste container
Polyethylene tubing	Intramedic	427400	I.D. 0.28 mm, O.D. 0.61 mm; use these tubes to make the reusable chamber
Regular microscope slides	VWR	48312-003	Other similar slides can be used
Coverslips	VWR	48393-150, 48366-067	Other similar coverslips can be used
Silicon sealant	World Precision Instruments	KIT, SILICON SEALANT 5 MIN CURE
Epoxy glue	Loctite	83082
Cyanoacrylate adhesive	Scotch 3M	AD114	Or cyanoacrylate adhesive from other manufacturers

			Table 3: Coverslips cleaning and coating.
Molecular Sieves, Grade 564	Macron	4490-04
Coverglass Staining Jar	Ted Pella, Inc.	21036
Coverslip Ceramic Holder	Thomas Scientific	8542e40
PlusOne Repel Silane	GE Healthcare Biosciences	17-1332-01
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Anti-digoxigenin AB	Roche applied science	11093274910

			Table 4: Preparation of seeds and segmented microtubules.
Tubulin	purified from cow brains Cytoskeleton, Inc	T238P	For purification protocols see 49–51 Unlabeled porcine tubulin
Labeled tubulin	Cytoskeleton, Inc Invitrogen Invitrogen	TL590M C1171 (Rhodamine) A-2952 (Digoxigenin)	Rhodamine-labeled porcine tubulin Tubulin can be labeled with any amine-reactive dye as in reference52.
GMPCPP	Jena Biosciences	NU-405	Aliquot and store at -70 °C
VALAP	vaseline, lanolin, and paraffin at 1:1:2 by mass		see ref. 9