Summary

Inyección sistémica de Neuronales células madre / progenitoras en ratones con EAE crónica

Published: April 15, 2014
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Summary

El trasplante de células madre / progenitoras neuronales (CPN) tiene grandes promesas en neurología regenerativa. La administración sistémica de NPC se ha convertido en el protocolo eficaz, de bajo invasiva, y terapéuticamente muy eficaz para entregar las células madre en el cerebro y la médula espinal de roedores y primates no humanos afectados por daño experimental inflamatoria crónica del sistema nervioso central.

Abstract

Células madre / precursoras neuronales (CPN) son una fuente prometedora de células madre para trasplante enfoques destinados a la reparación del cerebro o la restauración de la neurología regenerativa. Esta directiva ha surgido a partir de la amplia evidencia de que la reparación del cerebro se logra después focal o sistémica trasplante de NPC en varios modelos preclínicos de enfermedades neurológicas.

Estos datos experimentales han identificado la ruta de suministro de células como uno de los principales obstáculos de terapias con células madre de restauración para enfermedades cerebrales que requiere una evaluación urgente. Intraparenquimatosa injerto de células madre representa un enfoque lógico para aquellas patologías que se caracterizan por lesiones cerebrales aisladas y accesibles, tales como lesiones de la médula espinal y la enfermedad de Parkinson. Desafortunadamente, este principio es muy poco aplicable a condiciones caracterizadas por una naturaleza multifocal, inflamatoria y diseminada (tanto en tiempo y espacio), incluyendo la esclerosis múltiple (EM). Como tal, el cerebro dirigido por el sistla entrega de la APN emic se ha convertido en un protocolo invasiva y terapéuticamente eficaz bajo para entregar las células al cerebro y la médula espinal de roedores y primates no humanos afectados por experimental de daño inflamatorio crónico del sistema nervioso central (SNC).

Este método alternativo de suministro de células se basa en la pathotropism APN, específicamente su capacidad innata para (i) detectar el medio ambiente a través de las moléculas de adhesión de células funcionales y los receptores de citoquinas y quimioquinas inflamatorias; (Ii) cruzar las barreras anatómicas fugas después por vía intravenosa (iv). O inyección intracerebroventricular (icv); (Iii) acumular en el nivel de sitio múltiple perivascular (s) del daño cerebral y la médula espinal inflamatoria; y (iv) ejercer trófico tejido notable y efectos reguladores inmunes en diferentes células diana huésped in vivo.

Aquí se describen los métodos que hemos desarrollado para el iv. y <em> entrega icv de NPC singénicos en ratones con encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), como modelo de desmielinización inflamatoria crónica del SNC, y prever la entrega sistémica de células madre como una técnica valiosa para la dirección selectiva del cerebro inflamado en neurología regenerativa.

Introduction

Fuerte evidencia ha surgido a partir de los estudios in vivo que prueben la eficacia terapéutica del trasplante de células somáticas neurales madre / precursoras (NPCs) en modelos animales de trastornos del SNC 1-8. Sin embargo, una serie de cuestiones relativas a la entrega de las células madre en el huésped requiere una cuidadosa consideración antes de que estos resultados experimentales se pueden traducir en aplicaciones clínicas. Un obstáculo particularmente importante para el desarrollo de (hematopoyéticas) restaurativos terapias con células madre para enfermedades cerebrales, inflamatorias crónicas multifocales es la identificación de la ruta ideal de la inyección de la APN. Un firme entendimiento de la fisiopatología de la enfermedad específica (focal o multifocal; degenerativa inflamatoria o primaria primaria), y un análisis cauteloso de las cuestiones de viabilidad y de riesgo asociados con las técnicas de entrega son para identificar el protocolo óptimo para la entrega de células madre.

Mientras que el centro de coordinación ( <em> Por ejemplo. en el parénquima del sistema nervioso) trasplante de células madre es un enfoque lógico para el tratamiento de enfermedades del SNC caracterizados por áreas espacialmente confinados de daño (por ejemplo, el Parkinson y la enfermedad de Huntington, del cerebro y la médula espinal lesiones traumáticas, y accidente cerebrovascular), el mismo enfoque puede resultar a ser prácticamente no es factible en condiciones tales como MS, donde un daño en el SNC multifocal, crónica, y espacialmente diseminada acumula con el tiempo. En este último caso, apuntando a las inyecciones de células de coordinación para las lesiones individuales también se ve obstaculizada por la limitada capacidad de los NPCs trasplantadas a migrar a través de largas distancias dentro del parénquima del SNC, lo cual incitará a la identificación de métodos alternativos y más adecuados de focalización del SNC con los trasplantes de NPC menos invasivos .

Gran promesa surgió de las observaciones que se dirigen a los NPCs un tumor intracraneal (p. ej. Glioma) en ratones cuando se inyecta por vía intravascular fuera del CNS9. Después de esta seminalen evidencia in vivo de la pathotrophism de células madre 10, los datos extensos se han acumulado correspondiente a la viabilidad y la eficacia terapéutica de la trasplante sistémica de NPC en animales de laboratorio con encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), como un modelo de daño inflamatorio del SNC, ya sea a través de vía intravenosa (iv) o intracerebroventricular (icv). NPC inyección 1,2,5,6,8 .. Hemos mostrado por primera vez que esto depende de la capacidad de los NPCs trasplantados para apuntar y para entrar en la inflamación del SNC, y participar posteriormente múltiple intercelular programas de comunicación dentro de microambientes específicos in vivo 11. Con el fin de centrarse específicamente en el sistema nervioso central, los personajes se entregan directamente en el líquido cefalorraquídeo (LCR) de distribución por la inyección icv, o en el torrente sanguíneo a través de la inyección iv. Una vez que entra bien en el torrente sanguíneo o en el LCR, NPCs trasplantados interactúan activamente conel hematoencefálica (BBB) ​​o sangre líquido cefalorraquídeo (BCSFB) barreras y entrar en el parénquima del SNC. Esta interacción entre el injerto APN y la acreditación (o BCSFB) está regulada por conjunto específico de moléculas de adhesión celular de la superficie de la APN (CAMs) y facilitada por la expresión de altos niveles de la leva contra-ligandos en endoteliales / células ependimarias activados 12-14. Ejemplos de estas levas incluyen el receptor de hialuronato, CD44, y la molécula de adhesión intercelular (ICAM) -1 ligando antígeno muy tardío (VLA) -4 5,15,16 (que, en los leucocitos, son responsables de la interacción con ependimal activado y células endoteliales), y en un grado de linfocitos asociado a la función de antígeno mucho más baja (LFA) -1 y el ligando glicoproteína P-selectina (PSGL) -1. NPC también expresan una amplia gama de receptores de quimioquinas, incluyendo CCR1, CCR2, CCR5, CXCR3, CXCR4 y (pero no expresan CCR3 y CCR7), que son funcionalmente activos, tanto in vitro como in vivo 5,16. Por lo tanto, systemicaNPC LLY inyectados utilizan estas levas, junto con la proteína G de receptores acoplados (GPCRs), a acumularse en el nivel de la inflamación del SNC. Por el contrario, los NPCs inyecta por vía sistémica en ratones sanos no entre al SNC a través vascular o cefalorraquídeo rutas espacio fluido 2. Inflamación del SNC, o la activación de células endoteliales / ependimal siguiente sistémica de citoquinas o lypopolisaccharide inyección (LPS) como un modelo de encefalitis inducida químicamente, por lo tanto, es necesario para la acumulación de NPC sistémicamente inyectados en el cerebro y la médula espinal 2. Por lo tanto, la orientación exitosa de la CNS con terapias sistémicas NPC depende de la identificación de una ventana específica de la enfermedad de la Oportunidad (WoO) en el que el cerebro y el medio ambiente de la médula espinal son propicias para la acumulación y la migración transendotelial de NPCs. Tales condiciones generalmente surgen en el contexto de la inflamación aguda y subaguda 17. Una vez que haya entrado en el sistema nervioso central, trasplantado NPCs indiferenciadasse ha demostrado para mejorar las características clínico-patológicas de los ratones, así como de mayor tamaño, primates no humanos con EAE. Esto ha sido descrito a ser dependientes de la sustitución célula mínima 2 y la secreción considerable de factores paracrinos reguladoras y neuroprotectores inmunes dentro perivascular CNS 2,5,6,18 vs no CNS zonas inflamadas 19,20 (por ejemplo, los ganglios linfáticos) en respuesta a la la señalización celular inflamatoria provocada por la infiltración de células inmunes 5.

Aquí se describe los aspectos metodológicos fundamentales de la inyección sistémica de NPCs somáticos en un modelo murino de EAE crónico. Más específicamente, se definen los protocolos que hemos establecido para (i) Obtenga, ampliar y prepararse para el trasplante NPCs somáticos de la zona subventricular (SVZ) de adultos C57BL / 6 ratones; (Ii) inducir la EAE crónica en tales ratones y (iii) realizar terapéuticamente eficaz sistémica (IV o icv) de la APN el trasplante iratones nto EAE.

Protocol

Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con los principios de cuidado de los animales de laboratorio aprobados por el Ministerio del Interior del Reino Unido en virtud de los animales (procedimientos científicos) Act 1986 (PPL N º 80/2457 de SP). 1. Derivación de somática Neuronales células madre / progenitoras (CPN) de la zona subventricular (SVZ) del cerebro de ratones adultos Elaboración de instrumentos de disección y medios de comunicación …

Representative Results

NPC derivación y caracterización Disecciones SVZ se realizan en piscinas (n = 5-7 ratones / piscina) de 6-8 semanas de edad C57BL / 6 ratones por medio de disociación mecánica y enzimática (Figura 1A). Después de unos pocos días de cultivo en CGM, neuroesferas de libre flotación comienzan a formarse (Figuras 1A y 1B). Esferas primarias se recolectaron y mecánicamente a pases cada 4-5 DIV. Al pases, número de células vivas y muertas y se determinan el n…

Discussion

Terapias basadas en células madre somáticas están surgiendo como una de las estrategias más prometedoras para el tratamiento de trastornos del SNC inflamatorias crónicas tales como MS2 11. Aunque todavía tienen que ser completamente dilucidado los mecanismos que sustentan sus efectos terapéuticos, el impacto significativo de la APN el trasplante en diferentes modelos experimentales de enfermedades neurodegenerativas ha dado lugar a la creencia de un tanto provocativa que las células madre pueden pront…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen a Jayden Smith por su revisión crítica y la edición de la prueba el manuscrito. Este trabajo ha recibido el apoyo de la Sociedad Nacional de Esclerosis Múltiple (NMSS, becas parciales RG-4001-A1), la italiana Asociación de Esclerosis Múltiple (AISM, concede 2010/R/31), el Ministerio de Sanidad italiano (GR08-7), Wings for Life, Banca Agricola Popolare di Ragusa (BAPR), el Consejo Europeo de Investigación (ERC) en el marco del acuerdo de ERC-2010-STG subvención sin el Programa Marco de la Comunidad Europea séptimo (CE) 260511-SEM_SEM y (FP7/2007-2013) en virtud de Acuerdo de subvención n * el grado; 280772 – iONE.

Materials

Cell culture
EBSS Sigma E2888
L-Cystein SIGMA-ALDRICH CO LTD C7352
Papain WORTHINGTON 30H11965
EDTA Fisher scientific D/0700/50
Mouse NeuroCult basal medium Stem Cell technologies 05700
NeuroCult proliferation supplements Stem Cell technologies 05701
Heparin Sigma H3393
Basic fibroblast growth factor Peprotech 100-18B-1000
Epidermal growth factor Peprotech AF-100-15-1000
Pen/Strep Invitrogen 1514012
Matrigel (coating solution) BD biosciences 354230
NeuroCult® Differentiation Kit (Mouse) Stem cell technologies 05704
Accumax eBioscience 00-4666-56
Dulbecco's PBS (DPBS) (10x) without Ca& Mg PAA LABORATORIES LTD H15-011
Myco trace PAA LABORATORIES LTD Q052-020
Dimethyl sulfoxide (DMSO) SIGMA D2650
immunofluorescence
Normal goat serum PAA LABORATORIES LTD B11-035
Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether SIGMA-ALDRICH CO LTD T8787
Mouse anti Nestin Abcam ab11306
Rabbit anti GFAP DAKO 203344
Mouse anti Histone H3 (phospho S10)  Abcam ab14955
Rabbit anti MAP-2 Abcam ab32454
Rat anti MBP AbD SEROTEC MCA409S
Anti-O4 Antibody, clone 81 | MAB345 Millipore MAB345
DAPI Invitrogen D1306
Mounting solution DAKO S3023
EAE
Freund's Adjuvant Incomplete SIGMA-ALDRICH CO LTD F5506
Mycobacterium tuberculosis  DIFCO H37Ra
MOG(35–55)  Espikem
Pertussis toxin List Biological Laboratories 181
Tissue processing
Iris scissor straight Fine Sciences Tolls 14060-09
Blunt/bended forceps Fine Sciences Tolls 11080-02
Brain slicer Zivic instruments BSMAS005-1
Surgical blades Swann-Morton 324
P200, P1000 pipettes
Ketamine (Vetalar) Boehringer Ingelheim 01LC0030  
Xylazine (Rompun) Bayer 32371
Stereotaxic frame KOPF Model 900
Hamilton syringe Hamilton 7762-04
Paraformaldehyde (PFA) SIGMA 158127
VECTASTAIN Elite ABC Kit vector laboratories PK-6100

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Donegà, M., Giusto, E., Cossetti, C., Schaeffer, J., Pluchino, S. Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE. J. Vis. Exp. (86), e51154, doi:10.3791/51154 (2014).

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