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Immunology and Infection

神经干/祖细胞在小鼠EAE的慢性全身性注射

doi: 10.3791/51154 Published: April 15, 2014

Summary

神经干/祖细胞(的NPC)的移植持有再生神经内科伟大的应许。全身交付的NPC已经变成有效的,低侵入性的,而且治疗非常有效的协议,提供干细胞在大脑和受中枢神经系统的实验性慢性炎症性损害啮齿类动物和灵长类动物的脊髓。

Abstract

神经干/祖细胞(的NPC)是一种很有前途的干细胞来源,移植方法,旨在大脑修复或修复再生神经内科。该指令已产生的大量证据显示,大脑修复局灶性或全身性鼻咽癌移植后实现了神经系统疾病的几种临床前模型。

这些实验数据已经确定了细胞传递路线为恢复性干细胞疗法的脑部疾病,需要紧急评估的主要障碍之一。脑实质内干细胞移植术代表逻辑态度来对待这些特点是孤立的和可访问的脑病变,如脊髓损伤和帕金森氏病的病症。不幸的是,这个原则是很差适用特点是多灶性,炎症和传播(无论是在时间和空间)性质,包括多发性硬化症(MS)的条件。因此,脑是由系统·瞄准主位NPC交付已经成为一种低侵入性治疗有效协议,提供细胞到大脑,影响中枢神经系统(CNS)的实验性慢性炎症性损害啮齿类动物和灵长类动物的脊髓。

小区交付这种替代方法依赖于人大pathotropism,特别是他们与生俱来的能力(一) 通过感知功能细胞黏附分子和炎症细胞因子和趋化因子受体的环境; (二)交叉后静脉注射(IV)的泄漏解剖障碍或脑室内(ICV)注射液; (ⅲ)积聚在炎性脑和脊髓损伤血管周围的多个位点(S)的水平;及(iv)发挥卓越组织营养及免疫调节作用到不同的主机的靶细胞在体内

在这里,我们描述了我们已经开发了IV的方法。和<em>的同基因的NPC对小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)侧脑室递送,作为慢性中枢神经系统炎性脱髓鞘模型,并设想全身干细胞递送作为有价值的技术发炎的大脑中神经再生的选择性靶向。

Introduction

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强有力的证据已经出现从体内研究,证明在中枢神经系统疾病1-8的动物模型中的体细胞的神经干/祖细胞(的NPC)的移植的治疗效果。不过,也有一些与干细胞输送到主机的问题需要仔细考虑之前,这些实验结果可以转化为临床应用。向的(非造血)恢复性干细胞疗法对于多灶性,慢性炎症性脑疾病的发展的一个特别重大的障碍是怪物注射的理想的路径的识别。目标疾病的病理生理学有相当的了解(焦或多灶性;主要炎症或退行性小学),以及与交付相关的技术可行性和风险问题谨慎的分析是在确定干细胞传递最优协议。

而焦点( 如帕金森氏症和亨廷顿氏病,脑和脊髓外伤和中风),同样的方法可以证明是几乎不可行的,如MS,其中多灶性,慢性的,空间上传播中枢神经系统损伤会随时间积累的条件。在后一种情况下,针对局灶性细胞注射到病变的个体,也阻碍了移植的NPC的能力有限迁移的中枢神经系统实质内长的距离,从而促使中枢神经系统的替代,更合适的方法识别与微创全国人大针对移植。

从小鼠的NPC针对颅内肿瘤( 例如 ,神经胶质瘤)观测了很大的希望出现的CNS9外血管内注射时。根据这一开创性干细胞pathotrophism 10体内证据,大量的数据被积累有关实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的实验动物的可行性和NPC的全身移植的治疗功效,作为模型的炎性中枢神经系统损伤, 通过静脉内(iv)或侧脑室(ICV)全国人大注射1,2,5,6,8 ......我们首先证明,这是依赖于移植的NPC的能力为目标,进入中枢神经系统发炎,并随后参与多间在体内 11项具体的微环境中的通信程序。为了特异性靶向中枢神经系统,的NPC被直接输送到脑脊髓液(CSF)中通过侧脑室注射循环,或到通过静脉注射的血液。一旦进入无论是血液或脑脊液,移植的NPC积极互动血脑屏障(BBB)或血脑脊液(BCSFB)壁垒和进入CNS实质。这人大移植和血脑屏障(或BCSFB)之间的相互作用是通过特定的NPC表面细胞粘附分子(CAMS)的监管,并通过高水平的CAM反配体对活化的内皮/室管膜细胞12-14的表达提供便利。这些凸轮的例子包括受体,透明质酸,CD44和胞间粘附分子(ICAM)-1配体很迟抗原(VLA)-4 5,15,16(即,在白细胞,负责与活化室管膜的相互作用细胞和内皮细胞),并以一个低得多的程度淋巴细胞功能相关抗原(LFA)-1和P-选择素糖蛋白配体(PSGL)-1。的NPC也表达多种趋化因子受体,包括CCR1,CCR2,CCR5,CXCR3和CXCR4(但不表达CCR3和CCR7),它在功能上是积极的,无论是在体外体内 5,16。因此,systemica莱注入的NPC用这些凸轮,以及G-蛋白偶联受体(GPCR的),积累在发炎的中枢神经系统的电平。相反,注入的NPC进入全身健康小鼠不通过血管或脑脊髓液空间的路由2进入中枢神经系统。中枢神经系统炎症,或内皮/室管膜细胞活化之后的全身细胞因子或lypopolisaccharide(LPS)注射作为化学诱导的脑炎的模型,因此,有必要对全身注射的NPC积累到大脑和脊髓2。因此,中枢神经系统的成功定位与全身治疗鼻咽癌是依赖于机会(胡)的一种疾病特定的窗口中,大脑和脊髓的环境,有利于积累和NPC的跨内皮迁移的鉴定。这种情况一般出现在急性和亚急性炎症17的范围内。一旦已经进入中枢神经系统,移植未分化的NPC已经显示出改善的小鼠的临床病理特征以及更大的,非人灵长类动物与EAE。这已被描述为依赖从最小的细胞替代2和内血管周围的CNS 2,5,6,18免疫调节和神经保护性旁分泌因子非CNS发炎的区域19,20( 例如淋巴结)显着分泌响应于炎性细胞信号引起了浸润的免疫细胞5。

在这里,我们描述成慢性EAE的小鼠模型的全身注射体细胞的NPC的关键方法问题。更具体地说,我们定义我们已经建立了以(i)本协议派生,扩展和移植体的NPC准备从成年C57BL / 6小鼠的脑室下区(SVZ); (ⅱ)引起的慢性EAE在这种小鼠及(iii)进行治疗有效的全身性(ⅳICV)怪物移植我NTO EAE小鼠。

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Protocol

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所有涉及动物的程序是根据实验室动物护理的动物(科学程序)根据批准的英国内政部的原则行事1986(80 PPL号/ 2457至SP)进行。

1,推导从成年小鼠大脑的脑室下区(SVZ)躯体神经干/祖细胞(的NPC)的

  1. 解剖仪器和媒体的制备
    注:这两个解决方案必须准备1-2小时前解剖仪器准备和预热在37℃至少20〜30分钟后再使用(它有助于淡化木瓜蛋白酶和优化酶的活性)。
    1. 高压灭菌一条直线锋利的剪刀,一个小小的手术剪刀和两个小弯锯齿钳。
    2. '消化​​'解决方案:准备两个单独的50ml试管有:
      溶液#1:25毫升Earle氏平衡盐溶液(EBSS)+ 10毫克乙二胺四乙酸(EDTA)+ 10毫克的L-半胱氨酸;和
      解决方案2:25毫升EBSS + 50毫克木瓜蛋白酶。
    3. 制备“完全生长培养基”(CGM):完整小鼠的基础培养基用鼠标增殖补充剂,肝素0.002%,碱性成纤维细胞生长因子(bFGF; 10毫微克/毫升),表皮生长因子(EGF; 20纳克/毫升),和抗生素(PEN /链球菌)。
  2. 大脑解剖
    注意:颞骨的切除可以很容易损坏,因为它们的锐度的组织。为了避免这种情况,牢牢固定骨头用钳子拉出,直到整个骨已被删除。
    1. 对于颈椎脱位N = 5-7,4-8周龄C57BL / 6小鼠各项准备工作的NPC,扑杀的。
    2. 用70%乙醇(在水中)的剔除小鼠的头发和切断后面与直剪锋利的耳朵移除的头部清洗;
    3. 使用一个小的外科剪刀切开皮肤在颅骨中线切口。使用镊子,折叠起来皮肤的两个补丁博览会e为头骨。
    4. 与小的手术剪刀进行两个小切口在颅底和下删除脑桥/延髓(腹头骨)的骨头。通过拉出颞骨进行。用相同的剪刀进行剪切均沿头骨,从基部开始的灯泡,而不会损伤大脑表面。此外,执行额骨和眼睛之间的切割,便于清除顶骨的。用两个镊子开始拉各顶骨向外侧移除头骨。同时拉动,注意脑膜,当要被删除的骨头,可能会损坏大脑。
    5. 一旦头骨已被删除,滑动的大脑和颅骨之间的镊子完全分离脑膜离开了。轻轻地从头骨抬起大脑。切断视神经释放大脑,最后在管与冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)收集大脑。
    6. 保持管上的冰d重复相同的步骤对所有的老鼠。
  3. 在SVZ的解剖,神经球形成和维护检测
    单元×平均数稀释倍数×10 4

    其中10 4表示的血细胞计数室(总体积= 0.1 立方毫米- > 10-4厘米3 - > 10-4毫升)的总体积的转化率。当考虑稀释因子,无论是1与CGM完成并与活力染色必须予以考虑。作为一个例子,如果160细胞已在4个角的正方形被计数,最终浓度的细胞悬浮液(细胞/ ml)为:

    四分之一百六×5(稀释CGM)×2(稀释活力染色)×10 4
    1. 打开一个夹层罩配备在解剖显微镜。
    2. 清洁所有的表面用70%乙醇(在水中),和喷用抗支原体溶液,以降低污染的风险。
    3. 盖用无菌纱布的烧杯的底部(以保留削尖的工具)中,用70%乙醇(在水中)进行填充。浸泡在烧杯中两对镊子,一对微型剪刀,手术刀片。
    4. 将整个大脑的脑切片矩阵。
    5. 使用两种刀片执行从大脑的前极冠状切片2mm时,不包括光纤束,和3mm后部到前一个切口;并把组织放在一个干净的培养皿。
    6. 根据解剖显微镜隔离SVZ组织切成利用虹膜切除术剪刀1毫米3件。重复所有的大脑。
      1. 拌匀上述两种溶液(1.1.2节)以上,并通过0.22微米的过滤器过滤的大脑解剖和SVZs准备被消化之后。
    7. 传输部分分成30毫升'消化'的解决方案,轻轻毫升吸管A10悬浮孵育30分钟,在37℃,5%CO2。每15分钟轻轻摇动试管2-3倍。
    8. 离心机在300×g离心10分钟。
    9. 去除上清,重悬沉淀在200μl的CGM通过先用P1000,然后移液用P200移液管(每个10-20X),直到获得单细胞悬浮液。
    10. 采取暂停长达5毫升CGM和转移到T25厘米2瓶。
    11. 经过5-7天在体外 (DIV)神经球会形成。收集悬浮液到一个15ml试管中,离心10分钟,在150×g下。
    12. 去除上清,重悬沉淀到200微升的CGM。
      机械解离的神经球传代的细胞100-150X用P200移液管,直到获得单细胞悬浮液,并把它高达1毫升的CGM。
    13. 稀释细胞悬液, 10微升细胞悬液,在40微升的CGM获得1:5稀释,并搅拌均匀。将10微升的dilut的Ë细胞悬液,用10微升的一个重要污点,拌匀。
    14. 填写血球计数板用10微升1:1的细胞悬液:活力染色的解决方案。分别计数活(白色)和死(蓝色)的细胞在4角的正方形的数目。为了确定细胞/ ml数,适用下列计算:
    15. 重悬2×10 5个细胞在5ml的CGM并转移到一个T25厘米2烧瓶中;
    16. 重复部分1.3.11-1.3.12每4-5 DIV。从扩张的第二通道开始,通过活力染色排除评估细胞活力,并开始建立一个持续的增长曲线通过在克隆密度(8,000 cells/cm2)电镀的NPC,描述21。保持细胞数量并重复上述步骤,每4-5格。要生成一个连续的生长曲线,进行如下操作:
      注:为了有一个良好的细胞制剂,经过4-5 DIV领域应该已经达到了一个直径为150-200微米。有T的一个很好的估计他的细胞密度,以找到一个最佳的稀释倍数,以便在整个血细胞计数具有均匀分布的,不重叠的细胞是重要的。理想情况下,应该有50-200总细胞之间。计数时,只包含在正方形的细胞不接触的边界必须被考虑。此外,细胞的生存力是有一个健康的制剂的重要因素。重要的是,它应大于90%。线性增长曲线是一条健康的细胞制备的另一个指标。
      1. 计数活细胞和死细胞的数目( 例如,1.3×10 6个)。
      2. 定义增长率除以活细胞的数目由镀细胞的数量( 例如,1.3×10 6/2×10 5 = 6.5)。
      3. 通过乘以增长率细胞存在于前一时间点(在开始= 2×10 5)的总数计算细胞总数。
      4. 报告的平均7;标准偏差建立一个线性趋势线。
    17. 从通道6起,机械分离被替换酶解。离心分离,在150×g离心10分钟后,除去上清液,沉淀重悬在200μl的细胞聚集的解离溶液,悬浮7-8倍速用P200孵育10分钟,在37℃,5%CO 2。
    18. 重悬7-8倍速用P200以获得单细胞悬浮液,并加入800微升的CGM。计数细胞(包括活的和死的),并建立自己的生存能力。重悬2×10 5个细胞在5ml的CGM并转移到一个T25厘米2烧瓶中。
  4. 的NPC的体内细胞示踪病毒转导
    注意:要验证病毒转导效率,建立与转导和nontransduced的NPC平行生长曲线。此外,克隆效率,即神经球形成细胞的绝对数量内的细胞制剂,本化或通过​​DNA含量(用碘化丙啶,PI)的细胞周期分析,也可使用作为电池状态进一步指示。如果受感染的细胞的百分比不应该是良好的,病毒转导的协议可以被重复第二次与细胞相同的人口。一旦感染水平是令人满意的,生长曲线相似,与野生型细胞中获得,转导的NPC可扩展和/或移植。
    1. 收获的神经球并获得单细胞悬液。镀在10ml CGM细胞以高密度(1.5×10 6个细胞在T75厘米2烧瓶)。
    2. 后12小时增加第三代慢病毒载体pRRLsin 3×10 6 TU /毫升。地产人巨细胞病毒设计与大肠杆菌大肠杆菌衍生β-半乳糖苷酶(lacZ),或绿色荧光蛋白(GFP)。
    3. 48小时后,收获细胞,离心分离机,在300×g离心10分钟,并replate的细胞以1:1的比率。
    4. 后3通道在体外验证感染的效率。流式细胞仪是常用来测试感染的功效,和感染的理想水平是普遍接受的是在阳性细胞的75-95%的范围内。再次检查的感染效率后扩张的3通道进一步验证标志物表达的维护。
  5. 神经球冻结
    1. 从T25厘米2的烧瓶中,离心分离机,在300×g离心10分钟收获的神经球,弃去上清液。
    2. 重悬沉淀用1毫升冷冻培养基(CGM用10%二甲基亚砜(DMSO)中。
    3. 将冷冻管在-80℃范围内的冷冻集装箱。
    4. 在至少24小时之后将细胞到cryobox并储存在-80℃下六个月,或带来的液体氮(N 2),用于再存储。
  6. 神经球解冻
    注意:要避免长时间接触邻的毒性作用f的NPC用DMSO,解冻过程必须尽可能快。
    1. 从取出冻存管在-80°C / N 2,并保持它的干冰。
    2. 迅速解冻小瓶在水浴中,直到几乎所有的细胞悬浮液解冻,并只有一小片冰冻悬浮液的存在。
    3. 重悬的细胞悬浮液用5ml预热的新鲜的CGM。
    4. 离心机在300×g离心10分钟。
    5. 用5毫升的新鲜CGM轻轻地除去上清,重悬和板的细胞悬浮液在一个干净的,未处理的T25厘米2烧瓶中。
  7. 1.7)全国人大表征
    NB:最后冲洗的PBS可以和0.05%叠氮化钠-PBS中进行更换,以防止真菌生长或污物,并coverslides被储存在4℃下进行2-3周。

    注意:要染色的细胞内标记添加渗透剂,以PBS中封闭液。如果初级抗体的来源是山羊,牛血清albumiN(BSA)或血清山羊比其他的应该被使用。

    注意:为了染色用于细胞内标记物的透化剂中的第一抗体溶液。
    1. 放置在24孔板的底部13毫米玻璃coverslide。加入150μl的每个coverslide创建一小滴的顶部涂层解决方案。孵育至少30分钟,在37℃,5%CO 2。
    2. 收获的神经球和离解,获得单细胞悬液。
    3. 计数活细胞,并稀释至获得80,000 cells/35微升。轻轻吸从coverslide除去多余的涂料解决方案,和板的35微升细胞悬液。
    4. 孵育25分钟,在37℃,5%CO 2。快速检查在相差显微镜细胞是否已经开始坚持。
    5. 通过将基底鼠标介质以适当的补充剂( 见表1)和抗生素(PE制备的分化培养基中Ñ​​/链球菌)。
    6. 添加400微升分化培养基中,并置于37℃,5%CO 2。
    7. 经过3格,用新鲜的分化培养基介质的变化一半。
    8. 经过6格,取出培养基,用PBS洗一次。在化学罩取下PBS加300微升预热的4%多聚甲醛(PFA)4%的蔗糖。孵育5分钟,在室温(RT)。除去PFA和用PBS洗3次。
    9. 进行免疫细胞化学,除去PBS,用PBS 10%正常山羊血清(NGS)(封闭溶液)块,并孵育1小时,在室温下。
    10. 除去封闭溶液,并加入用PBS 1%NGS稀释所需的初级抗体。孵育在4℃的CO / N,或者,120分钟,在室温。
    11. 培养后,用PBS洗2倍。孵育用PBS 1%NGS稀释适当的二级抗体。孵育60分钟,在RT。
    12. 洗涤2X,用PBS和反染色用4核',6 - 二脒基2 - 苯基吲哚(DAPI)稀释1:20,000以PBS渗透剂3分钟在室温下在黑暗中。用PBS和一次用蒸馏水洗两次。
    13. 放一滴安装介质上的玻璃组织滑动并与钳安装coverslide与面对该安装介质中的细胞。轻轻按下coverslide挤出多余的安装介质。离开coverslide在黑暗中于室温直至安装介质干燥并存放于4℃。

在C57BL / 6小鼠2。髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)诱导实验性自身免疫

  1. 乳液的制备
    1. 在玻璃烧杯中制备[另有定义为完全弗氏佐剂(CFA)]和200微克MOG(35-55肽),考虑到含结核分枝杆菌的4毫克/毫升的不完全弗氏佐剂组成的乳液是乳液的总金额每只小鼠将300微升。
      注:Appropria在终审法院MOG免疫小鼠的TE控制是免疫终审法院只小鼠。在MOG免疫小鼠发病的期望方差为11.3(±1.8)dpi的。

      注意:当计算所需乳液的总体积,可以考虑两倍体积的小鼠进行免疫接种的次数。玻璃器皿应首选塑料器皿,以尽量减少乳液的一部分的浪费。
      1. 用玻璃注射器保持一个19号针头混合约30分钟,始终保持在冰上的乳液。
      2. 要验证乳液是准备好了,滴上少量水乳液。该乳液是准备要注射仅当压降保持原样,并且不散开。
      3. 免疫小鼠的对照组与终审法院只。治疗实验性小鼠(MOG免疫)与MOG的终审法院。在MOG发病的预期方差免疫小鼠为11.3(±1.8)dpi的。
    2. 19号针头转移到1毫升的塑料注射器第二抽吸该乳液。避免气泡,更改与25克针,离开注射器上的冰。注射器充满乳液随时可以使用,应保持在冰上的一对夫妇小时的。
  2. 免疫
    1. 将小鼠(6-8周龄,雌性)进入一个变暖的框中,等待约10分钟,使尾静脉扩张。
    2. 从气候变暖箱传送一个鼠标,一个鼠标限制器。关闭限制器,避免鼠标的任何移动。
    3. 补1毫升胰岛素注射器用100μl百日咳毒素(5微克/毫升)的避免使气泡。慢慢地在尾静脉注射液。取下针头,然后按几秒钟用一张纸堵塞出血。
    4. 将小鼠放回笼子,并重复相同的步骤对所有的小鼠。
    5. 麻醉小鼠连续吸入异氟烷(1-2%,2升/分钟),并注入100μl的乳剂皮下注射于水平两个侧面和尾部(300微升乳液/小鼠)的基部。慢慢取出注射器,避免了乳化液的泄漏。
    6. 纪念鼠标用耳朵穿孔,放置老鼠在笼子里,检查直到完全恢复。重复所有的老鼠。
    7. 48小时后(后2天接种,DPI)重复第2.2.3节。
  3. EAE小鼠的行为分析
    1. 从5 dpi的开始,每日称重小鼠并通过使用表1记载的尺度评分系统监测他们的运动表现。

3,注射神经干/祖细胞到尾静脉(ⅳ)

  1. 细胞制备
    1. 收获的神经球通过离心,在300×g离心10分钟。
    2. 除去上清,加入200微升细胞聚集的解离溶液。孵育10分钟,在37℃,5%CO 2。
    3. 轻轻悬浮10-12X(avoidin克气泡)用P200直到获得单细胞悬浮液,并采取以800微升用基础培养基不含Ca 2 +和Mg 2 +。
    4. 通过使用活力染色以测定细胞存活力和稀悬浮液用基础培养基不含Ca 2 +和Mg 2 +的取得10 6 cells/150微升的最终密度计数细胞。保持细胞悬液在冰上直至使用。
  2. 全国人民代表大会静脉注射
    注:理想的解离成单细胞悬液,并没有气泡是考虑到减少对栓子形成,这可能会导致静脉阻塞和随之而来的死亡或者团块/聚集的风险两个关键方面。
    1. 在疾病(16-18 DPI)的高峰期,权衡和得分老鼠。根据他们的得分分布的小鼠,以具有均匀的组。
    2. 将小鼠成暖箱,等待约10分钟,使尾静脉扩张。 从气候变暖箱传送一个鼠标,一个鼠标限制器。关闭限制器,避免鼠标的任何移动。
    3. 填写1毫升的胰岛素注射器150μL细胞悬液,并确保消除所有的泡沫。慢慢地将溶液注入到尾静脉。用一张纸堵塞出血( 图6A6B)取下针头,然后按几秒钟。
    4. 将鼠标放置在笼子里,并检查,直至康复为止。重复同样的步骤对所有的老鼠。

4,注射神经干/祖细胞的枕大池(ICV)

  1. 细胞制备
    1. 收获的NPC通过在300×g离心离心10分钟。
    2. 除去上清,加入200微升细胞聚集的解离溶液。孵育10分钟,在37℃,5%CO 2。
    3. 轻轻重悬10〜12倍的有P200,直到获得一个CELL悬挂,并采取到800微升与基础培养基不含Ca 2 +,Mg 2 +的。
    4. 计数细胞并稀释该悬浮液用基础培养基不含Ca 2 +和Mg 2 +,以获得所需的细胞密度。保持细胞悬液在冰上直至使用。
  2. 4.2)全国人大侧脑室注射
    1. 在疾病(16-18 DPI)的高峰期,权衡和得分老鼠。根据他们的得分分布的小鼠,以具有均匀的组。
    2. 将鼠标放置在立体定向仪下持续吸入异氟醚(1-2%,2升/分钟)。确保鼠标的头部与耳酒吧。然后调整双方的嘴和鼻子件。确保鼠标的头部是平的和固定的。
    3. 拭小鼠头部与聚维酮碘(PVP-I)和做一个切口切开皮肤在头的后部,以暴露颅骨。
    4. 用显微操作器,插入一个微升的前端ITER注射器插入穿过完整的肌肉和韧带在中线在颈后枕骨和寰椎之间的裂隙。针的弯曲部分保持与枕部的整个长度的内表面紧密接触,如所描述22。
    5. 慢慢地将针并等待几秒钟。运营商是为了学习认识的针是“上钩”,以鼠标头骨,开始注入细胞制备前的感觉。慢慢地注入细胞的体积(3-5分钟)。留在原地的针额外的几秒钟,注射后慢慢取下注射器。
    6. 缝合了皮肤,然后将鼠标放到恢复笼,直到完全康复。

5,组织处理

  1. 深麻醉的小鼠为0.5ml氯胺酮(100毫克/毫升),0.25毫升甲苯噻嗪(23.32毫克/毫升)和4.25毫升无菌水的混合物中,并transcardically灌注,瓦特灰化用生理盐水-EDTA并用4%PFA固定。在4℃下12小时在4%PFA中取出椎柱和大脑和两个后缀在PBS中洗涤组织,从骨骼中移除脊髓和离开所述组织的至少48小时,在30%蔗糖(在PBS中)在4℃下嵌入组织中最佳切割温度(OCT)的化合物和急速冷冻液态氮,描述2。
  2. 用切片机切组织在10-12微米厚的切片。
  3. 另外,嵌入新鲜组织在琼脂糖和使用vibratome 50-80微米厚的薄片切割组织。
  4. 在这两种情况下,孵育O / N在37℃下在5 - 溴-4 - 氯-3 - 吲哚基-βD-吡喃半乳糖苷(X-gal的)溶液,以检测核的β-半乳糖苷酶的活性。
  5. 重新酶切含有β-半乳糖苷酶+细胞分化为5μm的切片和双染色用antiglial纤维酸性蛋白(GFAP)为星形胶质细胞(50微克/毫升),antineuronal细胞核抗原(神经元核抗原)对神经元的部分(1&#956;克/毫升)和antiNestin针对未分化的神经细胞(10微克/毫升)。
  6. 请按照在第1.7.11和1.7.12描述。对于多个染色请务必使用与结合不同的荧光第二抗体。
  7. 对于含有绿色荧光蛋白标记的细胞组织中的步骤5.1-5.3所得款项作为解释,并进行多重染色。
  8. 安装介质的一些滴添加到幻灯片,盖上盖玻片组织。
  9. 对于沾有部分生物素标记的抗体制备抗生物素蛋白生物素复合物溶液(美国广播公司的解决方案,请参阅表2),并在搅拌离开45分钟。
  10. 孵育切片5分钟,用1%H 2 O 2以阻断内源性过氧化物酶的活性。
  11. 用PBS洗两次。
  12. 孵育在室温下1小时ABC溶液。
  13. 用PBS洗两次。
  14. 孵育3,3' -二氨基联苯胺溶液和0.3%H 2 O 2。监控反应未DER显微镜和一旦切片开始得到棕色(通常约5-10分钟),用PBS洗涤。
  15. 用PBS洗两次,并继续按照步骤5.7中所述。

的原料和试剂全面的列表显示在表2中

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Representative Results

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全国人大推导和表征
SVZ解剖是由机械和酶解( 图1A)方法为在池进行6-8周龄C57BL / 6小鼠(n = 5-7只小鼠/池)。经过培养的CGM几天,自由浮动的神经球开始形成( 图1A1B)。主球被收集和机械传代,每4-5格。传代后,活细胞和死细胞的数目是确定的和累积的细胞数作图以生成生长曲线( 图1C)。这使传播速率的指示,从而提供了一个间接的参数来评估全国人民代表大会准备的全局稳定性。当作为神经球增殖,表达的NPC有丝分裂活性的标记物(磷酸化组蛋白H3,PHH3; 5微克/毫升)和未分化的神经细胞( 巢蛋白)( 图2A)。未分化的NPC是要治疗Ëfficacious在EAE移植后必须表达细胞表面粘附分子,包括CD44(5微克/毫升)的VLA-4(10微克/毫升)的α4亚基( 图2F)。当在适当的条件下分化镀的NPC表达标志物典型的3神经谱系( 图2B),如星形胶质细胞标志物GFAP( 图2C)时,神经元标记的微管相关蛋白-2(MAP-2,5微克/毫升)( 图2D)和少突胶质细胞标记物O4(5微克/毫升)和髓鞘碱性蛋白(MBP; 10微克/毫升)( 图2E),从而确认的NPC是对三个主要的神经谱系的多能。以促进移植细胞在体内的识别,的NPC所转导的慢病毒改造成稳定表达报告基因如GFP。转的NPC表达GFP既作为增殖的神经球( 图3A3C),以及后生长因子撤离( 图3B) 体外分化时。来验证转导的效率,GFP的表达通过流式细胞仪分析,从早细胞转导后3通道(即,允许足够的时间来有引入的转基因的稳健表达在蛋白质水平)。当应用第三代慢病毒在体外的NPC,我们一致地观察到> 90%的细胞显示在多个独立的实验( 图3C)的高水平的GFP的,既没有明显的毒性,也不在细胞增殖的变化,比较野生型的生长曲线和时伦蒂-GFP转导的NPC( 图3D)。

慢性EAE诱导
EAE是MS的最佳表征的模型之一,因为它概括了大多数MS的病理和临床事件。 C57BL / 6小鼠用MOG35-55通向上的发展的免疫接种吨EAE的慢性形式。当在诱导期(潜伏期)接近发病(11.3±1.8 DPI),MOG免疫小鼠开始减肥( 图4A)。在执行器/入侵阶段的开始(峰值临床; 16.8±3.2 dpi)的EAE小鼠达到疾病的峰(分数3.5±0.7),和峰值后不久它们表现出渐进性和部分恢复的慢性期间最后稳定阶段(稳定临床)从约30 dpi的起(得分2.8±0.9)( 图4B)。大量的研究,包括一些调查EAE由任何活体显微镜23或磁共振成像24,搭配体内组织病理学,已在效应/入侵阶段(16-22 dpi)的机会的理想窗口(胡)的峰值确定在其中执行系统性的实验性疗法与拟进入慢性炎症EAE中枢神经系统并保护其免受二次ð干细胞豪悦国际。

全国人民代表大会注射
同基因的NPC注入全身的EAE小鼠( 图6)被发现几乎只在中枢神经系统损伤血管周围的地区,无论是在大脑( 图5A)和脊髓( 图5B-D),45天移植后(DPT),描述5。IV。注入的的NPC优先保留一个不成熟的,巢蛋白+( 图5C)表型,而少数的NPC移出血管周围区域的NeuN表达( 图5D)。值得注意的是,的NPC 静脉注射入健康对照组未通过血管途径( 图5E),进入中枢神经系统。经过全国人民代表大会第四注射,发现显著的数字注入的NPC在非中枢神经系统器官如肝,肠,脾,肺,肾,但不是心脏的水平,早在10 DPT( 图5F)。非CNS积累的NPC被完全清除出成分股的 Ë外周器官30 DPT( 图5G)。

图1
图1:从成年小鼠脑室下区分离的NPC和产生稳定的可扩展全国人大线A,稳定地扩展的产生的主要关键步骤示意图,并准备注射的小鼠的NPC,B,神经球体外 。Ç ,培养的NPC神经球传代,每4-5天。活的和死细胞的数量,收集和累积细胞数量绘制生成生长曲线。在B中的比例尺条为200μm。在C数据是细胞的±SD平均累积数(n = 3)。

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图2的NPC鉴定A,增殖鼠标神经球表达PHH3核心组蛋白(绿色),和VI型中间丝蛋白巢蛋白(红色),BE,经过6 DIV在分化条 ​​件下,的NPC是多向星形胶质细胞(GFAP,红色C语言),神经元(MAP-2,绿色D)和少突胶质细胞(O4,绿色E,和MBP,红色E)的谱系。定量的GFAP,MAP-2,和O4表达细胞在6格后,全国人民代表大会体外分化都表明B 。在B数据都以平均值%±标准差(n = 3)。在CE中的比例尺是50微米。 流式细胞仪的主要细胞表面粘附分子调节leukocy的表达分析德外渗在小鼠神经球。 图2F是从Pluchino 转载。2

图3
图3转的NPC与慢病毒表达报告基因绿色荧光蛋白。AB,神经球(A)和分化的NPC(B)已转用第三代伦蒂-GFP载体的相衬图像。流式细胞仪分析在A. C的的NPC,野生型(未转)和伦蒂-GFP转的NPC培养的神经球传代,每4-5天。活的和死细胞的数量,收集和累积细胞数量绘制生成生长曲线。在比例尺A B为200μm。在C数据是细胞的±SD平均累积数(n = 3)。

图4
图4。慢性EAE的功能特性。 A,每天体重在MOG和CFA免疫C57BL / 6小鼠在监测共随访40 dpi的。B,每日EAE得分监测MOG和CFA免疫C57BL / 6小鼠在共随访40 dpi的。数据表示为平均值数±标准差(N = 10只/组)。

图5
图5。全身注射的NPC MIGR吃了EAE小鼠的实质,AE,的vibratome切(70微米)脑(A)和脊髓(B)x-gal染色的EAE小鼠组织切片静脉注射与同基因的NPC,显示移植的β-半乳糖苷酶+细胞(蓝色细胞)内的血管周围中枢神经系统领域坚持到临床月底跟进(106 dpi)的C,β-半乳糖苷酶和iv。注入的NPC(蓝色)内血管周围中枢神经系统领域的坚持,保留了巢+(棕色)表型。ð ,很少有迁移的NPC表达的NeuN +(棕色),只要他们搬出血管周围区域。E,从假处理的EAE小鼠有代表性的脊髓节X-gal的染色。 ,比例尺,20微米FG,组织比其他中枢神经系统的分析表明,IC -或静脉 。注入的NPC(蓝色细胞)达到几乎所有的器官( 肺,肝,脾,心脏,肠,肾)风趣欣10 DPT(F),而是由30 DPT(G)从相同的器官被清除。 图5A-E是从参考图5再现,而图5F-G选自Pluchino 再现。2

图6
。小鼠全身注射的NPC的小鼠EAE EAE的主要关键步骤的协议,用于全身注射的NPC的图6示意图 :从注射CAM的表达制备单细胞分离的NPC细胞培养室( ) ,对注入于效应器/入侵疾病相(B)的峰尾静脉EAE小鼠,朝向检测体内注射的NPC的那些目标中枢神经系统(C),体内组织病理学研究使注入的NPC( 四)治疗可塑性机制的研究。在D中,绿色单元中的少突胶质细胞,深蓝色的细胞的轴突,浅蓝细胞移植的NPC,橙色细胞是星形胶质细胞,和红细胞是内皮细胞。

<TD> 2.5
得分自发反应
0 正常小鼠。疾病没有明显的迹象
1 柔弱的尾部:尾部完全松弛,和不存在卷曲在当鼠标被拾取的尾巴尖
1.5 后肢无力:鼠标显示偶然和短暂trippings在步态蹒跚行走时
2 柔弱的尾部和后肢无力:当放置在它的后面,鼠标不能转动到其正常位置
部分后肢瘫痪:鼠标可以不再使用后肢保持臀部的姿势,或步行,但仍然可以移动一个或两个后肢在一定程度上,前肢不受影响
3 完整的后肢麻痹:运动的后肢完全丧失。鼠标拖动本身只在它的前肢,而不受影响。老鼠在这个阶段中给出食物放在笼子地板,长吸嘴管,并每日皮下注射水合解决方案,以防止脱水。如果小鼠发展疮或皮肤损伤不配合治疗恢复,他们将被人道扑杀
3.5 前肢的弱点:当发生在一个垂直网格,鼠标不能爬,慢慢下降
4 濒死状态
5 鼠标发现死亡或扑杀根据人道终点

BLE 1,临床症状和EAE小鼠上行性麻痹五个阶段的规模。

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Discussion

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成体干细胞的疗法正在成为最有希望的策略,用于治疗慢性炎性CNS疾病如MS2 11中的一个。同时维持其治疗作用的机制仍有待完全阐明,全国人大移植在神经退行性疾病的不同的实验模型的显著影响,已经引起了几分挑衅的信念,干细胞可能很快被应用到人类的研究。然而,设想我们需要面对的一些关键问题,并解决一些悬而未决的问题,如理想的干细胞来源的移植(自体异体,多能多能 )的识别和最佳路线等创新疗法的任何潜在的人类之前的应用管理。

神经变性疾病,会有不同的病理生理学,一些被空间上的限制( 例如 ,在脊髓陪审团,中风),而其他的特征在于通过时空传播( MS)。可以得出的焦点注射的(干)细胞可以是合适的治疗对于前者,虽然它可能是不足够或根本不可行对于后者,其中脑损伤的多个位点的存在表示要克服一个额外的挑战。

一致的证据表明,静脉输液可能是一个有效的(和低侵入性)协议,用于小区管理,通过干细胞来感知环境,特别对家损伤部位(S)的内在能力的支持。然而,全身治疗鼻咽癌到诊所翻译是由几个局限性,如移植细胞的外周非CNS器官的可能累积( 肺,脾,淋巴结,肾),可能会或可能不会站点仍然受阻在体内局部炎症反应。虽然这种非特异性ACCUM注入的NPC出目标中枢神经系统的ulation在小鼠慢性EAE2很快被清除,有长期怪物的持久性(或在某些情况下,专用定位)的证据在次级淋巴器官( 例如 ,淋巴结和脾脏)的电平全身注射小鼠复发EAE5 19,20后。这显著号码移植的NPC的再循环对非中枢神经系统器官的事实产生的稀释效应,不可避免地降低中枢神经系统的NPC的绝对数量。有趣的是,全身注射完全积累出来的中枢神经系统19,20甚至当的NPC是治疗有效的( 例如,通过免疫调节动作)。只有5或淋巴结只有19注入的NPC的整体治疗效果针对中枢神经系统相媲美。这是由于细胞的固有的塑性,其中至surroundin的分子组分的反应不同可能部分克微环境。值得注意的是,如果一方面移植的NPC可能会感到炎性细胞因子的存在,并通过免疫调节机制16发挥其治疗效果,另一方面,他们有可能会和敌对的微环境,最终导致肿瘤25,26形成接触。出于这些原因,最佳选择就是目前集中注入的NPC在中枢神经系统。因此,鞘内给药( 通过腰椎或脑池路线)仍然给药在临床试验中最被接受预期路线。然而,多灶性和MS病变的病理异质性可能会限制这种方法的有效性。

在这里,我们描述了一个有效的协议,从成年SVZ和先后,如何系统地(IVICV)注入受慢性EAE,最STU之一,在小鼠的NPC隔离,保持和鉴定小鼠神经祖细胞死亡的MS的模型。虽然相对简单和直接,这些协议目前需要考虑的一些关键步骤。起初,它是强制性的,以获得稳定的可扩展的,健康的细胞制备。如在整个协议所描述的,细胞的稳定性可以间接地通过观察它们的生长速度推断。理想情况下,神经球应达到的直径为150-200微米,每4-5 DIV和细胞死亡后的通道的百分比必须非常低(小于10%)。此外,神经球必须在显微镜下呈现出紧凑和规则的圆形形状。用慢病毒感染可能会干扰细胞的存活性和稳定性。为了获得最佳的感染,它是强制性的,以获得足够的兴趣的病毒滴定,得到3×10 6 TU /毫升。实际上,虽然一方面病毒量低,会导致受感染的细胞的一小部分,而另一方面使用高量的车月ð可能导致的毒性效应(强烈依赖被感染的基因)。的NPC可以被多次感染与病毒结合,应该第一传导导致转基因阳性活细胞百分比偏低的结果。它始终是一个很好的做法,具有稳定性和可行性参数与野生型,nontransduced内实验对比,控制的NPC。作为慢性EAE的诱导,最有问题的部分是由该乳液的制备方法表示。如上所述,玻璃器皿和冰必须使用在任何时候。该乳液的制备需要30-45分钟,并且它可以被认为是准备好进行注射,只有当它不分散于水时下降。如果乳液消散在水中,这意味着它是尚未准备好,并需要进一步混合。

良好的精度静脉注射过程中的细胞给药的时间是至关重要的。首先,这是非常重要的,有作为英格尔细胞悬浮液,作为喷射凝集细胞可能会阻碍注入小鼠的静脉,并导致其立即死亡。为确保针头插入静脉的正确定位,这是很好的做法,与吸入血液的注射器几微升。在没有血液进入注射器的情况下,操作者应慢慢移动针向前或向后,直到正确位置被找到。仅在这一点上可以在细胞悬浮液中缓慢地注入。重要的是,操作者通常不应该需要申请注射器上的任何压力,因为该液体应该在静脉容易流动。不正确的注入将不可避免地导致相应的注射部位皮下肿胀。

值得注意的是,在不远的将来全身注射NPCs2,27,转基因或不自身可以代表一种治疗选择,以及提供用于递送免疫米的一个重要工具痛感受的调制和/或神经保护药物和亲remyelinating剂直接进入中枢神经系统28。因此,在涉及到全身的NPC交付一定的局限性确实存在,两者IV。ICV。路线最终可能代表了这些疾病,其中的焦点细胞注射可能不构成治疗的金标准协议有效的替代治疗方法。

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Disclosures

作者什么都没有透露。

Acknowledgments

作者感谢杰登史密斯严格审查和编辑校对的稿子。这项工作已获得支持,从国家多发性硬化症协会(NMSS,部分补助RG-4001-A1),意大利多发性硬化症协会(AISM,授予2010/R/31),意大利卫生部(GR08-7),翅膀生命,Banca银行阿格里科拉POPOLARE二拉古萨(BAPR),欧洲研究委员会(ERC)下的ERC-2010-STG赠款协定没有260511-SEM_SEM和欧洲共同体(欧共体)第七框架计划(FP7/2007-2013)根据赠款协议N *度; 280772 - 卓智。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture
EBSS Sigma E2888
L-Cystein Sigma Aldrich C7352
Papain Worthington 30H11965
EDTA Fisher Scientific D/0700/50
Mouse NeuroCult basal medium Stem Cell Technologies 05700
NeuroCult proliferation supplements Stem Cell Technologies 05701
Heparin Sigma H3393
Basic fibroblast growth factor Peprotech 100-18B-1000
Epidermal growth factor Peprotech AF-100-15-1000
Pen/Strep Invitrogen 1514012
Matrigel (coating solution) BD Biosciences 354230
NeuroCult® Differentiation Kit (Mouse) Stem Cell Technologies 05704
Accumax eBioscience 00-4666-56
Dulbecco's PBS (DPBS) (10x) without Ca and Mg PAA Laboratories H15-011
Myco trace PAA Laboratories Q052-020
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Immunofluorescence
Normal goat serum PAA Laboratories B11-035
Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether Sigma Aldrich T8787
Mouse anti Nestin Abcam ab11306
Rabbit anti GFAP DAKO 203344
Mouse anti Histone H3 (phospho S10)  Abcam ab14955
Rabbit anti MAP-2 Abcam ab32454
Rat anti MBP AbD SEROTEC MCA409S
Anti-O4 Antibody, clone 81 | MAB345 Millipore MAB345
DAPI Invitrogen D1306
Mounting solution DAKO S3023
EAE
Freund's Adjuvant Incomplete Sigma Aldrich F5506
Mycobacterium tuberculosis DIFCO H37Ra
MOG(35–55)  Espikem
Pertussis toxin List Biological Laboratories 181
Tissue processing
Iris scissor straight Fine Sciences Tools 14060-09
Blunt/bended forceps Fine Sciences Tools 11080-02
Brain slicer Zivic Instruments BSMAS005-1
Surgical blades Swann-Morton 324
P200, P1000 pipettes
Ketamine (Vetalar) Boehringer Ingelheim 01LC0030
Xylazine (Rompun) Bayer 32371
Stereotaxic frame KOPF Model 900
Hamilton syringe Hamilton 7762-04
Paraformaldehyde (PFA) Sigma 158127
VECTASTAIN Elite ABC Kit Vector Laboratories PK-6100

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References

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神经干/祖细胞在小鼠EAE的慢性全身性注射
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Donegà, M., Giusto, E., Cossetti, C., Schaeffer, J., Pluchino, S. Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE. J. Vis. Exp. (86), e51154, doi:10.3791/51154 (2014).

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