Transplantation af neurale stamceller / stamceller (NPCs) besidder store løfter i regenerativ neurologi. Den systemiske levering af NPC har udviklet sig til en effektiv, lav invasiv og terapeutisk meget effektiv protokol til at levere stamceller i hjernen og rygmarven hos gnavere og ikke-humane primater, der berøres af eksperimentel kronisk inflammatorisk skade på det centrale nervesystem.
Neurale stamceller / precursorceller (NPCs) er en lovende stamcelle kilde til transplantationscentre tilgange sigter mod hjernen reparation eller restaurering i regenerativ neurologi. Dette direktiv er opstået fra den omfattende dokumentation for, at hjernen reparation opnås efter fokal eller systemisk NPC transplantation i flere prækliniske modeller af neurologiske sygdomme.
Disse eksperimentelle data har identificeret den celle levering rute som en af de vigtigste forhindringer for genoprettende stamcelleterapier inden for hjernesygdomme, der kræver akut vurdering. Intraparenchymal stamcelle podning repræsenterer en logisk tilgang til disse patologier karakteriseret ved isolerede og tilgængelige hjernelæsioner såsom rygmarvsskader og Parkinsons sygdom. Desværre er dette princip er dårligt gælder for tilstande karakteriseret ved en multifokal, provokerende og formidles (både i tid og rum) natur, herunder multipel sklerose (MS). Som sådan hjerne målretning af systemic NPC levering er blevet en lav invasiv og terapeutisk effektiv protokol til at levere celler til hjernen og rygmarven gnavere og ikke-humane primater, der berøres af eksperimentel kronisk inflammatorisk skade på det centrale nervesystem (CNS).
Denne alternative metode til celle levering afhængig af NPC pathotropism specifikt deres medfødte evne til at (i) fornemmer i miljøet via funktionelle celleadhæsionsmolekyler og inflammatoriske cytokin og kemokinreceptorer; (Ii) krydse utætte anatomiske barrierer efter intravenøs (IV). Eller intracerebroventrikulær (icv) injektion; (Iii) akkumuleres på niveau med flere perivaskulær site (s) af inflammatorisk hjerne og rygmarv skader; og (iv) udøve bemærkelsesværdig væv trofisk og immune regulerende virkninger på forskellige vært målceller in vivo.
Her beskriver vi de metoder, vi har udviklet til iv. og <em> ICV levering af syngene NPCs i mus med eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE), som model for kronisk CNS inflammatorisk demyelinisation og forestiller den systemiske stamcelle levering som en værdifuld teknik til selektiv målretning af den betændte hjerne i regenerativ neurologi.
Er opstået stærke beviser fra in vivo studier, der attesterer den terapeutiske effekt af transplantation af somatiske neurale stamceller / precursorceller (NPCs) i dyremodeller af CNS-sygdomme 1-8. Ikke desto mindre er en række spørgsmål i forbindelse med levering af stamceller i værten kræver omhyggelig overvejelse, før disse eksperimentelle resultater kan omsættes til kliniske anvendelser. En særlig væsentlig hurdle i retning af udvikling af (ikke-hæmatopoietiske) genoprettende stamcellebehandling for multifokale, kroniske inflammatoriske hjernesygdomme er identifikationen af den ideelle rute NPC injektion. En fast forståelse af patofysiologien af de målrettede sygdom (fokal eller multifokal, primær inflammatoriske eller primær degenerativ), og en forsigtig analyse af feasibility-og risikoforhold forbundet med levering teknikker er at identificere den optimale protokol for stamcelle levering.
Mens omdrejningspunktet ( <em> F.eks. i nervesystemet parenkym) stamcelletransplantation er en logisk tilgang til behandling af CNS-sygdomme karakteriseret ved rumligt afgrænsede områder med skader (fx Parkinsons og Huntingtons sygdom, hjerne og rygmarv traumatiske skader, og slagtilfælde), kan meget samme fremgangsmåde bevise at være praktisk ikke lade sig gøre i forhold såsom MS, hvor en multifokal, kronisk, og rumligt formidles CNS skade akkumuleres over tid. I sidstnævnte tilfælde er rettet mod fokale celle injektioner til individuelle læsioner også hæmmet af den begrænsede kapacitet af transplanterede NPC'ere at migrere over lange afstande inden for CNS parenkym, hvorved der opstår identifikation af alternative, mere hensigtsmæssige metoder til CNS målretning med mindre invasive NPC transplantationer .
Store løfte fremgik af bemærkninger, NPC'ere er målrettet en intrakraniel tumor (f.eks. Gliom) i mus, når det injiceres intravaskulært udenfor CNS9. Efter denne skelsættendein vivo evidens for stamcelle pathotrophism 10, har omfattende data blevet akkumuleret vedrørende gennemførlighed og terapeutiske effekt af den systemiske transplantation af NPC'ere i forsøgsdyr med eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE), som en model for inflammatorisk CNS skader, enten via intravenøs (iv) eller intracerebroventrikulær (icv.) NPC injektion 1,2,5,6,8 .. Vi har først vist, at dette er afhængig af evnen til transplanterede NPC'ere at målrette og indtaste den betændte CNS, og efterfølgende at engagere flere intercellulære kommunikationsprogrammer inden for specifikke mikromiljøer in vivo 11. For specifikt at målrette CNS, er NPC'ere leveret direkte i cerebrospinalvæsken (CSF) cirkulation af ICV injektion, eller ind i blodbanen via iv injektion. Når indtastning enten i blodbanen eller CSF, transplanterede NPC'ere aktivt samspil medblod-hjerne (BBB) eller blod cerebrospinalvæske (BCSFB) barrierer og indtast CNS parenkym. Denne interaktion mellem NPC graft og BBB (eller BCSFB) reguleres af specifikt sæt af NPC overflade celleadhæsionsmolekyler (CAMs) og lettes ved ekspression af høje niveauer af CAM counter-ligander på aktiverede endotelceller / ependymal celler 12-14. Eksempler på disse CAM'er omfatter receptoren for hyaluronat, CD44 og intercellulært adhæsionsmolekyle (ICAM) -1 ligand meget sent antigen (VLA) -4 5,15,16 (, at leukocytter, er ansvarlige for interaktionen med aktiveret ependymal og endotelceller), og i langt mindre grad lymfocytfunktion-associeret antigen (LFA) -1 og P-selectin glycoprotein ligand (PSGL) -1. NPC udtrykker også en bred vifte af kemokinreceptorer herunder CCR1, CCR2, CCR5, CXCR3 og CXCR4 (men udtrykker ikke CCR3 og CCR7), som er funktionelt aktive, både in vitro og in vivo 5,16. Således systemically injiceret NPC bruge disse CAM'er, sammen med G-protein-koblet receptor (GPCR), til at akkumulere på niveau med den betændte CNS. Omvendt NPC'ere injiceret systemisk i sund mus ikke kommer ind i CNS via vaskulære eller cerebrospinalvæske plads ruter 2. CNS-inflammation, eller endotel / ependymal celle aktivering efter systemisk cytokin eller lypopolisaccharide (LPS) injektion som en model for kemisk induceret hjernebetændelse, er derfor nødvendig for akkumulering af systemisk injicerede NPC'ere i hjernen og rygmarven 2.. Således vellykket målretning af CNS med systemiske NPC behandlinger er afhængig af identifikationen af en sygdom specifik vindue af muligheder (WoO) hvor hjernen og rygmarven miljø er befordrende for ophobning og transendothelial migration af NPC'ere. Sådanne betingelser generelt opstår i forbindelse med akut og subakut inflammation 17.. Når man først har indtastet CNS, transplanterede udifferentierede NPC'erehar vist sig at lindre Clínico-patologiske træk mus samt større, ikke-humane primater med EAE. Dette er blevet beskrevet til at være afhængig af celle udskiftning minimal 2 og bemærkelsesværdige sekretion af immun regulatoriske og neuroprotektive paracrine faktorer inden perivaskulær CNS 2,5,6,18 vs ikke-CNS betændte områder 19,20 (f.eks lymfeknuder), som svar på den inflammatorisk cellesignalering fremkaldt af infiltrerende immunceller 5.
Heri beskrives de vigtige metodologiske aspekter af systemisk injektion af somatiske NPC i en musemodel af kronisk EAE. Mere specifikt definerer vi de protokoller, som vi har etableret til (i) stamme, udvide og forberede transplantationscentre somatiske NPC'ere fra subventricular zone (SVZ) af voksne C57BL / 6 mus; (Ii) fremkalde kronisk EAE i sådanne mus og (iii) udføre terapeutisk effektiv systemisk (iv eller icv) NPC transplantation into EAE mus.
Somatiske stamceller baserede terapier dukker op som en af de mest lovende strategier til behandling af kroniske inflammatoriske CNS-lidelser, såsom MS2 11. Mens stadig skal være helt klarlagt de mekanismer bevare deres terapeutiske virkninger, har den store betydning af NPC transplantation i forskellige eksperimentelle modeller for neurodegenerative sygdomme givet anledning til den noget provokerende tro på, at stamceller kan snart blive anvendt i humane studier. Men inden man overvejer eventuelle mennesk…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Jayden Smith for en kritisk gennemgang og bevis redigere manuskriptet. Dette arbejde har modtaget støtte fra National Scleroseforeningen (NMS'er, delvise tilskud RG-4001-A1), den italienske Multipel Sclerose Association (AISM indrømme 2010/R/31), det italienske sundhedsministerium (GR08-7), Wings for Life, Banca Agricola Popolare di Ragusa (BAPR), Det Europæiske Forskningsråd (ERC) under ERC-2010-StG tilskudsaftale nr. 260.511-SEM_SEM og Det Europæiske Fællesskab (EF) 7. rammeprogram (FP7/2007-2013) under tilskudsaftale n * deg; 280.772 – Ione.
Cell culture | |||
EBSS | Sigma | E2888 | |
L-Cystein | SIGMA-ALDRICH CO LTD | C7352 | |
Papain | WORTHINGTON | 30H11965 | |
EDTA | Fisher scientific | D/0700/50 | |
Mouse NeuroCult basal medium | Stem Cell technologies | 05700 | |
NeuroCult proliferation supplements | Stem Cell technologies | 05701 | |
Heparin | Sigma | H3393 | |
Basic fibroblast growth factor | Peprotech | 100-18B-1000 | |
Epidermal growth factor | Peprotech | AF-100-15-1000 | |
Pen/Strep | Invitrogen | 1514012 | |
Matrigel (coating solution) | BD biosciences | 354230 | |
NeuroCult® Differentiation Kit (Mouse) | Stem cell technologies | 05704 | |
Accumax | eBioscience | 00-4666-56 | |
Dulbecco's PBS (DPBS) (10x) without Ca& Mg | PAA LABORATORIES LTD | H15-011 | |
Myco trace | PAA LABORATORIES LTD | Q052-020 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | SIGMA | D2650 | |
immunofluorescence | |||
Normal goat serum | PAA LABORATORIES LTD | B11-035 | |
Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether | SIGMA-ALDRICH CO LTD | T8787 | |
Mouse anti Nestin | Abcam | ab11306 | |
Rabbit anti GFAP | DAKO | 203344 | |
Mouse anti Histone H3 (phospho S10) | Abcam | ab14955 | |
Rabbit anti MAP-2 | Abcam | ab32454 | |
Rat anti MBP | AbD SEROTEC | MCA409S | |
Anti-O4 Antibody, clone 81 | MAB345 | Millipore | MAB345 | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
Mounting solution | DAKO | S3023 | |
EAE | |||
Freund's Adjuvant Incomplete | SIGMA-ALDRICH CO LTD | F5506 | |
Mycobacterium tuberculosis | DIFCO | H37Ra | |
MOG(35–55) | Espikem | ||
Pertussis toxin | List Biological Laboratories | 181 | |
Tissue processing | |||
Iris scissor straight | Fine Sciences Tolls | 14060-09 | |
Blunt/bended forceps | Fine Sciences Tolls | 11080-02 | |
Brain slicer | Zivic instruments | BSMAS005-1 | |
Surgical blades | Swann-Morton | 324 | |
P200, P1000 pipettes | |||
Ketamine (Vetalar) | Boehringer Ingelheim | 01LC0030 | |
Xylazine (Rompun) | Bayer | 32371 | |
Stereotaxic frame | KOPF | Model 900 | |
Hamilton syringe | Hamilton | 7762-04 | |
Paraformaldehyde (PFA) | SIGMA | 158127 | |
VECTASTAIN Elite ABC Kit | vector laboratories | PK-6100 |