Transplantasjon av neural stilk / stamceller (NPC) har store løfter i regenerativ nevrologi. Den systemiske leveringen av NPC har slått til effektiv, lav invasiv, og terapeutisk meget effektiv protokoll for å levere stamceller i hjernen og ryggmargen hos gnagere og ikke-humane primater som påvirkes av eksperimentell kronisk inflammatorisk skade i sentralnervesystemet.
Nevrale stilk / forløper celler (NPC) er en lovende stamcellekilde for transplantasjon tilnærminger som tar sikte på hjernen reparasjon eller restaurering i regenerativ nevrologi. Dette direktivet har oppstått fra den omfattende bevis for at hjernen reparasjon oppnås etter fokal eller systemisk NPC transplantasjon i flere prekliniske modeller av nevrologiske sykdommer.
Disse eksperimentelle data har identifisert cellen levering rute som en av de viktigste hindringene for restorative stilk cellen terapi for hjernesykdommer som krever øyeblikkelig vurdering. Intraparenchymal stamcelle pode representerer en logisk tilnærming til disse patologier kjennetegnet ved isolerte og tilgjengelige hjerneskader slik som ryggmargsskader og Parkinsons sykdom. Dessverre er dette prinsippet som gjelder dårlig på tilstander som kjennetegnes ved en multifokal, inflammatoriske og disseminert (både i tid og rom) natur, inklusive multippel sklerose (MS). Som sådan, hjerne målretting av systemic NPC arrangementet har blitt en lav invasiv og terapeutisk effektiv protokoll for å levere celler til hjernen og ryggmargen hos gnagere og ikke-humane primater som påvirkes av eksperimentell kronisk inflammatorisk skade i sentralnervesystemet (CNS).
Denne alternative fremgangsmåte for celle levering er avhengig av NPC pathotropism, spesielt deres iboende evne til å (i) avføle miljøet via funksjonelle celle adhesjons-molekyler og inflammatorisk cytokin-og chemokine reseptorer; (Ii) krysse lekker anatomiske (iv.) Barrierer etter intravenøs eller intracerebroventrikulær (ICV) injeksjon; (Iii) samle seg på nivå med multiple perivaskulær område (r) av inflammatoriske hjerne-og ryggmargsskade; og (iv) utøver bemerkelsesverdige vev trofiske og immun regulatoriske effekter på forskjellige verts målceller in vivo.
Her beskriver vi de metodene som vi har utviklet for iv. og <em> ICV levering av syngene NPCer i mus med eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE), som modell for kronisk betennelse i sentralnervesystemet demyelinisering, og ser for oss den systemiske stamcelle levering som en verdifull teknikk for selektiv målretting av den betente hjernen i regenerativ nevrologi.
Sterke bevis har oppstått fra in vivo studier som attesterer den terapeutiske effekten av transplantasjon av somatiske nevrale stilk / forløper celler (NPC) i dyremodeller av forstyrrelser i sentralnervesystemet 1-8. Likevel, en rekke spørsmål knyttet til levering av stamceller i verten krever nøye vurdering før disse eksperimentelle resultatene kan omsettes til kliniske applikasjoner. En spesielt betydelig hinder mot utvikling av (nonhematopoietic) Restorative stamcelle terapi for multifokale, kroniske inflammatoriske hjernesykdommer er identifikasjonen av den ideelle rute for NPC injeksjon. En god forståelse av patofysiologien ved den målrettede sykdom (fokal eller multifokal, primær inflammatorisk eller primær degenerativ), og en forsiktig analyse av gjennomførbarhet og risiko problemer forbundet med leveringsteknikker er å identifisere en optimal protokoll for stamcelle levering.
Mens det sentrale ( <em> F.eks. i nervesystemet parenchyma) stamcelletransplantasjon er en logisk tilnærming til behandling av CNS-sykdommer kjennetegnet ved romlig begrensede områder av skade (for eksempel Parkinsons og Huntingtons sykdom, hjerne og ryggmarg traumatiske skader, og hjerneslag), kan den samme metode påvise å være praktisk talt ikke er gjennomførbar under forhold slik som MS, hvor en multifokal, kronisk, og rommessig disseminert CNS skade akkumuleres over tid. I dette siste tilfellet, er rettet mot brenn celle injeksjoner til individuelle lesjoner også hindret av den begrensede kapasiteten av transplanterte NPCer å migrere over lange avstander innen CNS parenchyma, og dermed spørre identifisering av alternative, mer egnede metoder for CNS målretting med mindre invasive NPC transplantasjoner .
Store løftet kom fra observasjoner som NPCer er rettet mot en intrakranial svulst (f.eks. Glioma) i mus når injiseres intravaskulært utenfor CNS9. Etter dette seminalin vivo bevis for stamcelle pathotrophism 10, har omfattende data blitt samlet knyttet til gjennomførbarhet og terapeutisk effekt av systemisk transplantasjon av NPCer i forsøksdyr med eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE), som en modell av inflammatorisk CNS skade, enten via intravenøs (iv) eller intracerebroventrikulær (ICVen.) NPC injeksjon 1,2,5,6,8 .. Vi har først vist at dette er avhengig av evnen til transplanterte NPCer å målrette og gå inn i betent CNS, og til senere å engasjere flere inter kommunikasjonsprogrammer innenfor bestemte microenvironments i vivo 11. For å spesifikt målrette CNS er NPC leveres direkte inn i cerebrospinalvæsken (CSF) sirkulasjon av ICV injeksjon, eller inn i blodstrømmen via intravenøs injeksjon. Når inn enten i blodbanen eller CSF, transplanterte NPCer samhandle aktivt medblod-hjerne (BBB) eller blod cerebrospinalvæsken (BCSFB) barrierer og gå inn i CNS parenchyma. Dette samspillet mellom NPC pode og BBB (eller BCSFB) er regulert av bestemte sett av NPC overflate celleadhesjonsmolekyler (cams) og tilrettelagt av uttrykket av høye nivåer av CAM counter-ligander på aktiverte endothelial / ependymal celler 12-14. Eksempler på disse omfatter CAM reseptoren for hyaluronate, CD44, og det intercellulære adhesjonsmolekyl (ICAM) -1 ligand svært sent antigen (VLA) -4 5,15,16 (som i leukocytter, er ansvarlig for interaksjon med aktivert ependymal og endotelceller), og til en mye lavere grad lymfocytt-funksjon-assosiert antigen (LFA) -1-og P-selektin glykoprotein ligand (PSGL) -1. NPC også uttrykke et bredt spekter av chemokine reseptorer, inkludert CCR1, CCR2, CCR5, CXCR3, CXCR4 og (men ikke uttrykker CCR3 og CCR7), som er funksjonelt aktive, både in vitro og in vivo 5,16. Dermed systemically injisert NPC bruke disse CAM, sammen med G-protein koblet reseptor (GPCR), til å hope seg opp på nivået av den betente CNS. Motsatt, NPCer injisert systemisk til sunn mus ikke inn i CNS via vaskulær eller cerebrospinalvæsken plass ruter to. CNS inflammasjon eller endotelisk / ependymal celleaktivering etter systemisk cytokin eller lypopolisaccharide (LPS) injeksjon som en modell av kjemisk indusert encefalitt, er derfor nødvendig for akkumulering av systemisk injiserte NPC inn i hjernen og ryggmargen 2.. Således er vellykket målretting av CNS med systemisk terapi NPC avhengig av identifiseringen av en sykdom bestemt vindu av muligheter (WoO) som hjernen og ryggmargen miljø er bidrar til akkumulering og transendothelial migrering av NPC. Slike tilstander vanligvis oppstår i forbindelse med akutt og subakutt inflammasjon 17.. Når ha kommet inn i CNS, transplantert udifferensierte NPCerhar vist seg å lindre de klinisk-patologiske trekk ved mus så vel som større og ikke-menneskelige primater med EAE. Dette har blitt beskrevet til å være avhengig av minimal celle utskifting 2 og bemerkelsesverdig sekresjon av immunregulerings og neurobeskyttende parakrine faktorer innenfor perivaskulær CNS 2,5,6,18 vs ikke-CNS-betente områder 19,20 (f.eks lymfeknuter) som reaksjon på inflammatorisk celle signal fremkalte ved å infiltrere immunceller fem.
Heri vi beskrive de viktigste metodiske aspekter ved systemisk injeksjon av somatiske NPCer i en musemodell for kronisk EAE. Mer spesifikt, vi definerer protokoller som vi har etablert for å (i) utlede, utvide og forberede for transplantasjon somatiske NPCer fra subventricular sone (SVZ) av voksne C57BL / 6 mus; (Ii) å indusere kronisk EAE hos slike mus, og (iii) utføre terapeutisk effektiv systemisk (intravenøs eller ICV) NPC transplantasjon into EAE mus.
Somatiske stamceller basert terapi er fremstår som en av de mest lovende strategi for behandling av kroniske inflammatoriske forstyrrelser i sentralnervesystemet slik som 11 MS2. Mens de mekanismene nærende deres terapeutiske effekter fortsatt trenger å bli fullstendig kjent, har den betydelige effekten av NPC transplantasjon i ulike eksperimentelle modeller av nevrodegenerative sykdommer gitt opphav til noe provoserende troen på at stamceller kan snart bli brukt i studier på mennesker. Men før envisagi…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Jayden Smith for kritisk gjennomgang og bevis redigere manuskriptet. Dette arbeidet har fått støtte fra National Multiple Sclerosis Society (NMSS, delvis tilskudd RG-4001-A1), den italienske multippel sklerose Association (AISM, gi 2010/R/31), den italienske helsedepartementet (GR08-7), Wings for Life, Banca Agricola Popolare di Ragusa (BAPR), European Research Council (ERC) under ERC-2010-StG Grant avtalenr 260511-SEM_SEM og Det europeiske fellesskap (EF) syvende rammeprogram (FP7/2007-2013) henhold Grant Agreement n * grader; 280772 – Ione.
Cell culture | |||
EBSS | Sigma | E2888 | |
L-Cystein | SIGMA-ALDRICH CO LTD | C7352 | |
Papain | WORTHINGTON | 30H11965 | |
EDTA | Fisher scientific | D/0700/50 | |
Mouse NeuroCult basal medium | Stem Cell technologies | 05700 | |
NeuroCult proliferation supplements | Stem Cell technologies | 05701 | |
Heparin | Sigma | H3393 | |
Basic fibroblast growth factor | Peprotech | 100-18B-1000 | |
Epidermal growth factor | Peprotech | AF-100-15-1000 | |
Pen/Strep | Invitrogen | 1514012 | |
Matrigel (coating solution) | BD biosciences | 354230 | |
NeuroCult® Differentiation Kit (Mouse) | Stem cell technologies | 05704 | |
Accumax | eBioscience | 00-4666-56 | |
Dulbecco's PBS (DPBS) (10x) without Ca& Mg | PAA LABORATORIES LTD | H15-011 | |
Myco trace | PAA LABORATORIES LTD | Q052-020 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | SIGMA | D2650 | |
immunofluorescence | |||
Normal goat serum | PAA LABORATORIES LTD | B11-035 | |
Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether | SIGMA-ALDRICH CO LTD | T8787 | |
Mouse anti Nestin | Abcam | ab11306 | |
Rabbit anti GFAP | DAKO | 203344 | |
Mouse anti Histone H3 (phospho S10) | Abcam | ab14955 | |
Rabbit anti MAP-2 | Abcam | ab32454 | |
Rat anti MBP | AbD SEROTEC | MCA409S | |
Anti-O4 Antibody, clone 81 | MAB345 | Millipore | MAB345 | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
Mounting solution | DAKO | S3023 | |
EAE | |||
Freund's Adjuvant Incomplete | SIGMA-ALDRICH CO LTD | F5506 | |
Mycobacterium tuberculosis | DIFCO | H37Ra | |
MOG(35–55) | Espikem | ||
Pertussis toxin | List Biological Laboratories | 181 | |
Tissue processing | |||
Iris scissor straight | Fine Sciences Tolls | 14060-09 | |
Blunt/bended forceps | Fine Sciences Tolls | 11080-02 | |
Brain slicer | Zivic instruments | BSMAS005-1 | |
Surgical blades | Swann-Morton | 324 | |
P200, P1000 pipettes | |||
Ketamine (Vetalar) | Boehringer Ingelheim | 01LC0030 | |
Xylazine (Rompun) | Bayer | 32371 | |
Stereotaxic frame | KOPF | Model 900 | |
Hamilton syringe | Hamilton | 7762-04 | |
Paraformaldehyde (PFA) | SIGMA | 158127 | |
VECTASTAIN Elite ABC Kit | vector laboratories | PK-6100 |