Summary
L’ARN total de haute qualité a été préparé à partir des corps cellulaires des motoneurones de la moelle épinière de souris par microdissection de capture laser après coloration des sections de la moelle épinière avec Azure B dans de l’éthanol à 70%. Un ARN suffisant (~40-60 ng) est récupéré à partir de 3 000 à 4 000 motoneurones pour permettre l’analyse de l’ARN en aval par ARN-seq et qRT-PCR.
Abstract
La préparation d’ARN de haute qualité à partir de cellules d’intérêt est essentielle à une analyse précise et significative des différences transcriptionnelles entre les types de cellules ou entre le même type de cellule dans la santé et la maladie ou après des traitements pharmacologiques. Dans la moelle épinière, une telle préparation à partir des motoneurones, cible d’intérêt dans de nombreuses maladies neurologiques et neurodégénératives, est compliquée par le fait que les motoneurones représentent <10% de la population cellulaire totale. La microdissection par capture laser (LMD) a été développée pour résoudre ce problème. Ici, nous décrivons un protocole pour récupérer, geler et sectionner rapidement la moelle épinière de souris pour éviter les dommages à l’ARN par les RNases endogènes et exogènes, suivis d’une coloration avec Azure B dans de l’éthanol à 70% pour identifier les motoneurones tout en maintenant la RNase endogène inhibée. LMD est ensuite utilisé pour capturer les neurones colorés directement dans le tampon de lyse du thiocyanate de guanidine, maintenant ainsi l’intégrité de l’ARN. Des techniques standard sont utilisées pour récupérer l’ARN total et mesurer son intégrité. Ce matériau peut ensuite être utilisé pour l’analyse en aval des transcriptions par RNA-seq et qRT-PCR.
Introduction
Dans les tissus de mammifères composés de plusieurs types de cellules différents, l’avènement de l’instrumentation de microdissection de capture laser (LMD) a permis de sélectionner un type de cellule spécifique pour l’analyse au niveau de l’ARN ou de la protéine. À l’heure actuelle, les techniques d’amplification et de séquençage de nouvelle génération permettent d’utiliser un pool d’ARN total provenant de quelques milliers de cellules pour obtenir un inventaire relativement complet du transcriptome, y compris l’évaluation des niveaux relatifs d’ARN et l’identification de diverses formes épissées. À ce jour, les analyses protéomiques de quelques milliers de cellules n’atteindront que des espèces plus abondantes. Par exemple, nous avons identifié <1 000 des protéines les plus abondantes de 3 000 à 4 000 corps cellulaires de motoneurones (non représentés), et Zhu et ses collègues ont récemment signalé avoir identifié 2 665 protéines d’environ 15 000 cellules tumorales1. Avec les développements ultérieurs de la spectrométrie de masse, cependant, il est probable que de telles analyses s’étendront à une profondeur beaucoup plus grande.
Ici, nous présentons un protocole spécifique utilisé pour la LMD des corps cellulaires des motoneurones de la moelle épinière de souris, suivi de la préparation de l’ARN. Ce protocole a été utilisé dans le cadre de la comparaison d’ARN de motoneurones de souris mutantes transgéniques présymptomatiques de superoxyde dismutase (SOD)1 de sclérose latérale amyotrophique (SLA) avec des ARN préparés à partir d’une souche transgénique SOD1 de type sauvage par validation RNA-seq et qRT-PCR2. Notamment, les motoneurones, dans la corne antérieure de la matière grise dans la moelle épinière, constituent <10% de la population cellulaire totale, entourée d’une mer d’astrocytes, et en tant que tels, leur profil transcriptionnel ne peut pas être facilement déconvolué à partir d’études de la corde entière. Une approche de capture laser est donc idéale pour analyser l’expression de l’ARN dans ces cellules, avec une physiologie préservée en excisant et en congelant rapidement le cordon suivant une brève perfusion saline intracardiaque. Les somata des motoneurones sont grands et sont donc facilement détectables, ici en utilisant un colorant qui a une forte affinité pour les neurones3. De plus, avec une telle taille, ces cellules fournissent une quantité relativement importante d’ARN par cellule capturée. La procédure utilisée, comme détaillé ci-dessous, pourrait être facilement ajustée pour obtenir d’autres types de cellules neuronales, ainsi que potentiellement d’autres types de cellules, spécifiquement identifiés par des techniques de coloration de colorant ou par la coloration d’anticorps.
Protocol
Les procédures décrites ici pour l’anesthésie, l’euthanasie, et la perfusion cardiaque des souris ont été exécutées sous un protocole approuvé par le comité institutionnel de soin et d’utilisation d’animal d’université de Yale.
1. Préparation d’instruments et de solutions sans RNase
- La RNase est un contaminant commun à toutes les surfaces de laboratoire, y compris les paillanes, les micropipettes et l’investigateur.
- Changez les gants souvent ou régulièrement essuyez avec une solution décontaminante RNAse.
- Les outils de dissection en acier inoxydable et la verrerie peuvent être rendus sans RNase en chauffant à >200 °C pendant 1 heure ou plus. Remarque: La stérilisation à la vapeur ne détruit pas RNase. Alternativement, essuyez avec une solution décontaminante RNase, puis avec de l’éthanol sans RNase à 70% et séchez à l’air.
- Essuyez les paillages, les autres surfaces de laboratoire et les micropipettors avec une solution décontaminante de RNase, puis avec de l’éthanol à 70% sans RNase. Désigner un banc de laboratoire ou une zone de travail spécifique pour la récupération et l’analyse de l’ARN. Remarque : Retirez les éjecteurs de pointe avant d’essuyer les arbres des pipettors et laissez-les éteints, si possible.
- Utilisez des tubes, des tubes à microcentrifugation, des pipettes et des embouts de micropipette certifiés par leur fabricant comme exempts de RNase. L’utilisation de pointes de liaison et de microtubes très bas est recommandée. Si possible, utilisez des boîtes ou des sacs de ces composants fraîchement ouverts et gardez-les séparés de l’approvisionnement général du laboratoire.
- Obtenir des solutions sans RNase [PBS sans calcium et magnésium (PBS) de Dulbecco, éthanol, éthanol à 70 % sans RNase] de sources commerciales. Utilisez des bouteilles nouvellement ouvertes pour chaque expérience.
- La source du colorant Azure B est essentielle à la récupération réussie de l’ARN intact. Testez chaque lot de colorant avant de consacrer des échantillons précieux à la coloration et au prélèvement. Recueillir quelques milliers de neurones d’un animal non expérimental, préparer l’ARN, et déterminer l’intégrité de l’ARN comme décrit ci-dessous pour trouver un qui produit constamment des nombres de RIN au-dessus de 8,5.
- Dissoudre le colorant Azure B (1 %, en poids/vol) dans de l’éthanol à 70 % sans RNase, généralement 0,3 g dans un tube à centrifuger de 50 ml. Bien mélanger sur une bascule à RT pendant la nuit ou jusqu’à ce que toutes les particules se dissolvent. Un tube de cette solution peut être utilisé pour colorer plusieurs lames sans affecter l’intensité de la coloration.
- Par mesure de précaution, utilisez un tube de coloration différent pour chaque répétition biologique.
- Utilisez les cryomoldes et o.C.t. pour l’incorporation des sections de cordon sans autre traitement.
- Maintenir le cryostat à -20 à -24 °C. Après le sectionnement, placer les lames dans un congélateur à -80 °C jusqu’à ce qu’un nombre suffisant ait été préparé. Commencez la préparation de l’ARN dès que possible après la réalisation des lames. Pour l’entreposage à long terme, conserver les blocs de TPO non sectionnés ou partiellement sectionnés, plutôt que les lames, à 80 °C.
- Fabriquer le tampon de thiocyanate de guanidine pour la préparation de l’ARN à partir des motoneurones disséqués en utilisant les solutions fournies par le fabricant du kit de préparation de l’ARN selon ses instructions.
2. Préparation des sections de moelle épinière de souris (figure 1A)
- Nettoyez tous les outils de dissection, les lames de verre, les lames de rasoir et la plate-forme de dissection en les faisant cuire ou en essuyant avec une solution décontaminante de RNase, suivie d’éthanol à 70% sans RNase. Laisser sécher pendant 2 min. Gardez tout sans poussière en le recouvrant de lingettes de laboratoire.
- Les procédures de manipulation des animaux, y compris l’anesthésie, la perfusion cardiaque et l’euthanasie, doivent être effectuées conformément aux exigences du comité institutionnel local de soins et d’utilisation des animaux (IACUC), dans le but d’amener rapidement l’animal au point de dissection de la moelle épinière.
- Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale (ip) d’une dose létale de kétamine (450 mg/kg).
- Une fois qu’un niveau profond d’anesthésie est atteint et confirmé par l’absence d’une réponse pince-orteil, placez la face ventrale de la souris sur une plate-forme de dissection (une planche de polystyrène, par exemple), ouvrez la cavité thoracique pour exposer le cœur et insérez l’aiguille papillon de 27 G d’une perfusion dans le ventricule gauche (qui se trouve à la droite de l’investigateur). Nick l’oreillette droite avec une pince pointue, et perfuser avec pbs à un taux de 5-7 ml/min pendant environ 2 min en utilisant une pompe péristaltique. Le liquide qui s’écoule de l’oreillette doit être largement exempt de sang à ce stade.
- Retirez l’aiguille de perfusion, décapitez la souris et retournez-la sur le tableau de dissection. Ouvrez la peau pour exposer la colonne vertébrale, utilisez de petits ciseaux et une pince pour enlever les vertèbres et soulevez la moelle épinière tout en sectionnant les racines nerveuses avec une pince tranchante. La vitesse et la pratique sont essentielles pour passer du début de la perfusion à l’ablation du cordon; cela ne devrait pas prendre plus de 7 min.
- Rincez le cordon pendant 10 secondes dans de l’eau sans RNase pour laver tout sang résiduel. Posez la moelle épinière sur une lame de verre sans RNase avec une pince incurvée très doucement mais rapidement. Divisez la moelle épinière transversalement à l’aide d’une lame de rasoir propre en 9-10 morceaux.
- Placez les pièces dans un cryomold rempli d’O.C.T. en utilisant les mêmes pinces et alignez-les verticalement à l’aide d’une aiguille propre. Placez le moule dans un plateau peu profond contenant du 2-méthylbutane pré-refroidi avec de l’azote liquide, puis mettez le plateau dans un bain d’azote liquide pour congeler rapidement les morceaux de moelle épinière afin d’éviter la dégradation de l’ARN.
- Conservez le bloc intégré à l’OPO à -80 °C jusqu’à 6 mois avant le sectionnement. Le processus de récupération du cordon à la congélation doit être effectué dans les 5 minutes pour maintenir l’intégrité de l’ARN.
- Cryosection du bloc incorporé en O.C.T. à -20 °C avec un cryostat pour produire des tranches de 20 μm, chacune contenant 9 à 10 sections transversales de la moelle épinière, sur des lames PEN-membrane 2 μm sans RNase conservées initialement à température ambiante pour s’assurer que les sections adhèrent à la lame. Recongelez immédiatement la section sur une surface de -20 °C à l’intérieur du cryostat. Conservez les diapositives à -80 °C jusqu’à ce qu’elles le dent.
3. Coloration des sections de la moelle épinière (figure 1A)
- Sur un rack propre, disposez six tubes coniques de 50 ml. Remplissez-les tous avec 25-30 ml d’éthanol à 70% sans RNase, de sorte que la profondeur soit suffisante pour couvrir toutes les sections d’une lame lorsque la lame est immergée. Fabriquez 30 à 35 ml de solution Azure B à 1 % comme décrit précédemment et conservez-la sur le même rack pour réduire le temps entre les solutions de changement pendant le lavage ou la coloration. Gardez trois ou quatre lingettes de laboratoire devant le rack pour vider rapidement la solution supplémentaire.
- Sortez les toboggans du congélateur à -80 °C sur de la glace carbonique. Décongelez une lame en la plaçant sur une paume gantée. Enlevez la majeure partie de l’humidité et de la condensation sur la lame en l’essuyant avec une lingette de laboratoire, en prenant soin de ne pas toucher les sections. Mettez la lame sur du dessicant de gel de silice frais dans une boîte de Pétri pendant 30-40 secondes pour sécher complètement. Si l’humidité du laboratoire est élevée, un bref traitement dans un dessicateur sous vide peut être utilisé pour sécher la lame plus rapidement.
- Lavage et coloration.
- Trempez la lame séchée dans le premier tube d’éthanol à 70% sans RNase. Trempez la lame pendant 30 secondes, puis lavez la lame pour retirer l’OCT en la trempant de haut en bas pendant 45-60 secondes. Sortez la lame de la solution et égouttez l’excès de liquide sur des lingettes de laboratoire. Répétez le même processus en trempant la lame dans le deuxième tube d’éthanol à 70%. Si le PTOM autour des sections de la moelle épinière n’a pas complètement disparu, répétez le lavage dans le troisième tube.
- Après avoir drainé l’excès de liquide, plongez la lame dans une solution Azure B à 1% dans de l’éthanol sans RNase à 70% pendant 30-45 sec. Drainez l’excès d’Azure B sur une lingette de laboratoire ; à ce stade, toute la diapositive sera bleue.
- Plongez la lame dans le tube suivant d’éthanol à 70%, et plongez de haut en bas rapidement 3-4x pour éliminer l’excès de colorant et rendre visible la coloration spécifique du motoneurone. Si les sections semblent très sombrement colorées, répétez l’étape de destaining dans un tube frais d’éthanol à 70%. Si la coloration semble trop légère, retournez la diapositive à la solution Azure B pendant encore 30 secondes et répétez la décoloration. Essuyez l’excès d’éthanol et séchez la lame à l’air pendant environ 40 secondes jusqu’à ce que tout le liquide ait disparu. La matière grise sera bleu clair, tandis que les motoneurones seront colorés d’un bleu profond, ce qui est facilement visible. Commencez la dissection immédiatement.
4. Microdissection par capture laser (LMD) (Figure 1B)
- Allumez le microscope et déchargez le support du tube pour fixer le capuchon d’un tube de microfuges de 0,6 ml pour le prélèvement d’échantillons. Mettre 30 μl de tampon de lyse de thiocyanate de guanidine dans le capuchon d’un tube de microfuge de 0,6 ml. Couvrir la surface du bouchon avec du liquide en étalant la solution à l’aide d’une pointe de pipette. De cette façon, tous les neurones collectés seront dissous dans une solution solubilisante au fur et à mesure qu’ils seront disséqués. Alignez le capuchon avec le trou et l’objectif avec le logiciel de microscope. Gardez le capuchon dans la position couverte jusqu’à ce que vous commenciez la capture laser.
- Placez la lame séchée à l’air sur la scène du microscope LMD à l’envers, de sorte que la membrane de la lame PEN soit exposée vers le bas. La membrane avec des sections doit faire face au trou, sous lequel se trouve le tube de collecte.
- Allumez le laser 10 min avant de commencer la préparation de la diapositive. Concentrez-vous sur une section de moelle épinière avec l’objectif 5X. Passer à l’objectif 20X pour la dissection.
- Marquez une région « factice » avec le stylo lumineux et laissez le laser la découper sans la collecter. Cela détend la membrane PEN et permet de marquer et de couper plusieurs régions successivement.
- Recentrez et identifiez les motoneurones dans la région ventrale de klaxon. Ces neurones sont reconnaissables à leur emplacement, leur morphologie pyramidale, leur grande taille et leur coloration bleu foncé avec Azure B (Figure 2).
- À l’aide du stylo lumineux, sélectionnez l’outil de dessin et marquez le long du bord des motoneurones, en faisant un contour complet. Essayez de rendre le contour aussi proche que possible du motoneurone pour éviter la contamination par des cellules autres que le motoneurone. (Testez certaines sections au préalable pour voir quelle est la largeur de la ligne de découpe laser et ajustez le jeu si nécessaire.) Marquer plusieurs cellules avant de couper; le logiciel se souviendra des positions.
- Placez le capuchon sous la position de coupe en cliquant sur la position du capuchon. Cliquez sur le bouton démarrer pour lancer la dissection des motoneurones avec le laser. Recueillir tous les motoneurones de toutes les sections sur une diapositive dans le capuchon d’un tube de microfuge.
- Une fois la collecte terminée, sortez le tube de microfuge du support en déchargeant le plateau et en délogeant doucement le tube. Dissoudre complètement les motoneurones dans le tampon en pipetting la solution de haut en bas. Déplacer la solution dans le corps du tube en centrifugant à 14 000 x g pendant 2 min à 4 °C. Congeler immédiatement l’échantillon dans de la glace carbonique et le conserver à -80 °C. Ce processus, de la coloration de la lame à la collecte des motoneurones, doit être effectué dans les 30 minutes pour une lame afin de minimiser la dégradation de l’ARN.
5. Préparation de l’ARN à partir de motoneurones
Décongelez tous les neurones collectés d’un animal et regroupez-les pour extraire l’ARN. Les échantillons peuvent sembler bleu pâle en fonction du nombre de motoneurones (tachés d’Azur B) qu’ils contiennent. Extraire l’ARN à l’aide d’un kit approprié selon le protocole prévu pour le tissu LMD, en éluant dans le volume minimum possible. Prélever 1 μl pour vérifier la quantité et l’intégrité de l’échantillon. Congeler rapidement l’ARN restant sur de la glace carbonique et le conserver à -80 °C.
6. Détermination de la qualité et de la quantité de l’ARN
Déterminer la qualité de l’ARN avec l’échantillon de 1 μl sur une puce microfluidique d’électrophorèse capillaire selon le protocole du fabricant. Les préparations d’ARN total avec un numéro d’intégrité de l’ARN (NRI) supérieur à 8,5 peuvent être utilisées pour l’ARN-seq et la qRT-PCR. La sortie des données comprend également généralement la concentration approximative de l’échantillon.
Representative Results
Le protocole décrit ci-dessus et à la figure 1 devrait produire 50 ng ou plus d’ARN total avec un NRI de >8,5 à partir de 3 000 à 4 000 corps cellulaires de neurones moteurs de la moelle épinière disséqués des tranches de 9 à 10 20 μm sur environ 20 lames PEN. Étant donné que ce nombre de lames représente moins de 10% d’un bloc intégré en O.C.T. d’une moelle épinière de souris, il est possible de revenir au bloc, qui a été stocké à -80 ° C, et de couper plus de tranches pour passer par un autre cycle de préparation d’ARN. Si de plus grandes quantités d’ARN sont nécessaires pour une analyse, il est préférable de ne faire que le nombre de lames(par exemple 20) à la fois qui peuvent être traitées par dissection et préparation d’ARN en quelques jours, puis de faire plus de lames pour un deuxième tour et de combiner les produits. Assurez-vous d’abord de vérifier le NRI de chaque préparation pour éviter de combiner un bon avec un mauvais. Les méthodes RNA-seq deviennent de plus en plus sensibles et les nouvelles technologies de PCR promettent une sensibilité plus élevée que les méthodes actuelles. Ainsi, moins d’ARN provenant de moins de corps cellulaires neuronaux seront nécessaires, permettant une plus grande profondeur de séquençage et une validation plus complète des hits intéressants. D’autre part, le respect intégral des recommandations du MIQE pour l’analyse et la validation qRT-PCR4 peut nécessiter des quantités plus importantes pour permettre les réactions de contrôle nécessaires pour les ARN de faible abondance.
La figure 2 montre une série typique d’images d’une partie d’une section de corne ventrale de la moelle épinière après coloration et dissection Azure B. Dans le panneau A, les grands corps cellulaires sombrement colorés sont des motoneurones, confirmés par la coloration des anticorps anti-Chat2, et se différencient facilement des cellules voisines plus petites. Le panneau B montre la même région avec des corps cellulaires individuels délimités avec le stylo lumineux et numérotés par le logiciel du microscope. Les contours suivent de près les marges des corps cellulaires, avec une petite tolérance pour la largeur de coupe du laser. Cet espacement doit être déterminé pour chaque réglage de puissance laser afin de minimiser l’inclusion de matériel superflu tout en évitant la perte de cytosol de neurone moteur. Les panneaux C et D montrent la section après que le laser a coupé et que les corps cellulaires individuels sont tombés dans le bouchon de collecte. Notez que la marge de coupe ne suit pas exactement le contour du stylet clair dans le panneau C, mais reste en grande partie en dehors de celui-ci. Cette irrégularité est apparente dans le panneau D, tout comme la zone assombrie autour de chaque coupe, qui reflète les dommages causés par la chaleur au tissu par le laser. Pour cette raison, si deux corps cellulaires sont très proches l’un de l’autre, il est préférable de les décrire pour une seule coupe, plutôt que d’essayer de les couper séparément et de perdre de l’ARN pour chauffer les dommages dans leur région de contact proche.
La figure 3 montre les résultats typiques d’une analyse électrophorétique de l’intégrité de l’ARN d’un échantillon d’ARN préparé à partir d’environ 4 000 corps cellulaires de motoneurones de souris collectés par LMD. Le panneau supérieur est l’électrophérogramme produit par 1 μl de l’ARN total; l’encart à droite est une image du gel. Dans les deux cas, notez les pics d’ARN ribosomique proéminents. Le panneau inférieur est l’électrophérogramme de la voie contenant des étalons de taille d’ARN. Le logiciel d’analyse a calculé un NRI de 9,8 pour cet échantillon, avec une concentration de 4,9 ng/μl. Un total de 13 μl de cette solution était disponible après l’analyse, fournissant 64 ng d’ARN pour la validation qRT-PCR en aval des quantités de transcription. Pour une analyse qRT-PCR typique de transcriptions modérément abondantes, 0,15-0,20 ng d’ARN total est suffisant pour produire une quantification précise2,de sorte que la quantité d’ARN disponible à partir de cette préparation est suffisante pour valider un certain nombre de transcriptions avec plusieurs ensembles d’amorces, comme recommandé4. Bien sûr, de plus grandes quantités d’ARN d’entrée peuvent être utilisées pour permettre la validation de transcriptions rares. Cette quantité est également plus que suffisante pour permettre la préparation de la bibliothèque et l’ARN-seq de nouvelle génération.
Figure 1. Vue d’ensemble de la production de tranches de moelle épinière et de la microdissection de capture laser des corps cellulaires des neurones moteurs de la moelle épinière. A)Principales étapes de la production de tranches et de la coloration. B) Vue de dessin animé de la section de la moelle épinière et de la dissection au laser. Cliquez ici pour agrandir l’image.
Figure 2. Images avant et après d’une dissection au laser de corps de cellules de motoneurones colorés Azure B. A) Partie de la corne ventrale d’une section tachée. Notez les quatre grandes cellules sombrement colorées. Il y a aussi quelques cellules légèrement colorées et un peu plus petites, qui ne sont pas des motoneurones (confirmées par une coloration anticorps anti-Chat; non montrées, mais voir Bandyopadhyay2) et qui ne seront pas sélectionnées pour la dissection. Les nombreuses petites taches sombres sont probablement des processus neuronaux (dendrites et axones), mais cela n’a pas été confirmé. B) Les quatre corps cellulaires délimités par le stylo lumineux. Notez que les contours suivent de près les marges des cellules, avec une distance minimale entre elles. Cet espacement doit être établi empiriquement pour chaque microscope et laser. Le logiciel numérote les neurones individuels, ce qui simplifie le suivi du nombre de neurones collectés. C et D) Après que le laser a coupé et les morceaux contenant les corps cellulaires sont tombés dans le capuchon de collecte. Notez que le trou laissé derrière est un peu plus grand que le contour et est irrégulier. Cela reflète la largeur du faisceau laser et son efficacité de coupe légèrement variable en fonction de la composition locale du tissu. Le bord du tissu assombri entourant chaque trou en raison des dommages de chauffage local causés par le laser est également apparent.
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Figure 3. Analyse électrophorétique de l’intégrité de l’ARN préparé à partir d’échantillons LMD. A)Une aliquote de 1 μl de l’ARN préparée à partir d’environ 4 000 corps cellulaires de motoneurones par le protocole ci-dessus a été analysée par électrophorèse microcapillaire sur une puce microfluidique. L’électrophérogramme est montré, avec des pics d’ARN ribosomique proéminents. Sur la droite se trouve une image du gel lui-même. B) L’électrophérogramme des étalons de taille est montré, avec la voie de gel correspondante à droite. Le logiciel de l’instrument a calculé un NRI de 9,8 pour cet échantillon et une concentration de 4,9 ng/μl. Cliquez ici pour agrandir l’image.
Discussion
La mesure la plus significative du succès de ce protocole pour la production d’ARN total par microdissection laser de tranches de moelle épinière est la valeur RIN5. Pour les échantillons d’ARN provenant d’eucaryotes supérieurs, des valeurs supérieures à 8,5 produisent régulièrement des données de séquençage et de qRT-PCR de haute qualité. Si le rendement est faible mais que la qualité est élevée, répétez la préparation. Si l’intégrité est inférieure (même 7,5-8), cependant, il est préférable de trouver la source du problème et de réessayer. Il y a beaucoup d’étapes où quelque chose peut mal tourner, mais vraiment seulement deux sources du problème - contamination endogène RNase ou contamination exogène RNase. Le premier peut être résolu par la pratique, de sorte que le temps entre le sacrifice de la souris et la congélation de son cordon intégré O.C.T est minimisé. L’autre point du protocole où la RNase endogène peut contribuer à un mauvais résultat est lors de la préparation des tranches. Chaque tranche doit adhérer rapidement à une glissière PEN à température ambiante, mais elle fondra (l’O.C.T devient clair). Plus vite la tranche peut être refrozen, mieux c’est. Le cryostat que nous utilisons a des surfaces planes à l’intérieur de la chambre qui sont à -20 °C, que nous utilisons pour regeler rapidement la tranche. Trouvez un endroit similaire dans le cryostat utilisé et assurez-vous que la tranche redevient opaque rapidement.
Traquer les sources de RNase exogène peut être difficile, car il y a tellement de possibilités. Les seuls réactifs utilisés qui ne sont pas expressément sans RNase sont O.C.T. et Azure B. Si l’Azure B a déjà fonctionné de manière satisfaisante, essayez une nouvelle bouteille d’O.C.T., bien que ce réactif n’ait jamais été un problème. Les réactifs sans RNase peuvent également être remplacés, même auprès d’un autre fournisseur. Une source beaucoup plus probable est l’enquêteur. En plus d’un nettoyage approfondi de la zone de travail, il est souvent utile qu’un autre membre du laboratoire suive et observe toutes les étapes de la procédure. Même s’il s’agit de quelqu’un qui n’effectue pas systématiquement cette procédure, un regard neuf peut capter une source de contamination autrement inaperçue.
L’extension de ce protocole à la récupération de l’ARN d’autres cellules de la moelle épinière, des cellules de la moelle épinière d’autres espèces ou de types de cellules spécifiques dans d’autres organes nécessitera des modifications dans plusieurs domaines visant à obtenir une identification claire des cellules d’intérêt tout en obviant, ou du moins en minimisant, l’impact de la RNase endogène. Dans le protocole ici, l’élimination et la congélation rapides du cordon, couplées à la coloration d’Azure B dans de l’éthanol à 70%, ont permis à la fois de minimiser la dégradation de l’ARN et d’identifier facilement les corps cellulaires des motoneurones. Azure B est une tache histochimique bien établie pour les neurones qui semble se lier à l’ARN3 et a été utilisé pour évaluer la teneur en ARN des neurones dans des échantillons d’autopsie de tissu cérébral de patients atteints de maladie neurodégénérative6. Notamment, la coloration d’Azure B n’a affecté ni l’intégrité de l’ARN purifié ni sa capacité à être transcrite et analysée à l’envers. D’autres colorants, tels que le crésyl violet7 et le bleu de toluidine8, ont été utilisés dans des protocoles LMD similaires. La collecte des corps cellulaires directement dans une solution de thiocyanate de guanidine pendant qu’ils étaient disséqués a fourni l’étape finale qui a entraîné la récupération de routine de l’ARN intact.
Des approches similaires peuvent être envisagées pour d’autres cellules et organes, reconnaissant que l’identification des cellules d’intérêt tout en minimisant ou, de préférence, en prévenant la dégradation de l’ARN par des RNases endogènes est la condition critique pour une analyse réussie. Dans les tissus qui ont des niveaux élevés de RNase, tels que le pancréas, la manipulation rapide et la basse température ont été combinées pour permettre la récupération de l’ARN des cellules β, en tirant parti de leur autofluorescence naturelle pour la visualisation9. Des procédures utilisant la souillure d’anticorps pour l’identification ont été également rapportées10,mais n’ont pas été entièrement réussies dans nos mains. Enfin, de nombreux modèles murins sont disponibles qui expriment des protéines de fusion fluorescentes(c’est-à-dire GFP, YFP, RFP) dans des cellules d’intérêt, qui pourraient être utilisées pour les identifier dans des sections tissulaires sur le microscope LMD. En fait, les souches de souris que nous avons analysées avec ce protocole expriment une protéine de fusion entre SOD1 et YFP11, et leurs motoneurones de la moelle épinière sont hautement fluorescents. Nous n’avons pas été en mesure, cependant, de trouver un ensemble de lavages à l’éthanol et/ou de conditions de déshydratation qui élimineraient simultanément l’O.C.T., inhiberaient l’activité de la RNase et maintiendraient systématiquement une fluorescence YFP suffisante pour permettre la visualisation des motoneurones et leur récupération par LMD. Peut-être qu’une nouvelle protéine fluorescente ou une variante de celles disponibles qui maintient la fluorescence dans les solvants organiques peut être trouvée pour surmonter cette limitation.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Les auteurs souhaitent remercier George Farr et les membres du laboratoire horwich pour leurs discussions utiles. Ce travail a été soutenu par le Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Webster Veterinary | 26637041101 | Any source approved by the institutional veterinary service |
| Dissection tools (scissors, forceps, etc.) | Any convenient source of high-quality dissection instruments | ||
| Cryostat | Leica Microsystem | CM3050S | Other cryostats should be suitable |
| LMD6000 B | Leica Microsystem | Other LMD systems have not been tested | |
| RNase-free PEN-membrane 2 μm slides | Leica Microsystem | 11505189 | Other slide types have been tested and do not perform well |
| RNeasy Micro kit (50) | Qiagen | 74004 | Any kit that uses guanidine thiocyanate lysis buffer and has been tested for recovering small quantities of RNA can be used |
| Agilent 2100 BioAnalyzer | Agilent Technologies | G2939A | |
| Azure B Certified | MP Biomedicals | 190520 | Critical! Product from any source has to be tested before use for its ability to maintain RNA integrity |
| PBS | Sigma Life Science | D8537 | Any reliable source of RNase-free PBS |
| RNA Ethanol 70% (made with DEPC treated water) | American Bioanalytical | AB04010-00500 | Any reliable source, can be lab-made |
| Water, RNase-free, Endotoxin tested (treated with DEPC to eliminate RNase) | American Bioanalytical | AB02128-00500 | Any reliable source, can be lab-made |
| RNase AWAY | Invitrogen Life Technologies | 10328-011 | Other similar RNase removal reagents, such as RNaseZAP (also from Invitrogen) can be used |
| 2-Methylbutane | Electron Microscopy Sciences | 78-78-4 | Any source |
| Maxymum Recovery microfuge tubes (0.6 and 1.5 ml) and pipette tips | Axygen | 311-03-051 & 311-09-051 | Ultra-low retention, RNase free tubes and tips; test other manufacturer's products before using |
| O.C.T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryomold Intermediate Size | Tissue-Tek | 4566 | |
| Lab wipes (Kimwipes) | KIMTECH | 34155 |
References
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