Summary
Högkvalitativt totalt RNA har förberetts från cellkroppar av mus ryggmärg motor nervceller genom laser fånga mikrodissektion efter färgning ryggmärg avsnitt med Azure B i 70% etanol. Tillräckligt med RNA (~40-60 ng) återvinns från 3 000-4 000 motoriska nervceller för att möjliggöra nedströms RNA-analys av RNA-seq och qRT-PCR.
Abstract
Beredning av högkvalitativt RNA från celler av intresse är avgörande för exakt och meningsfull analys av transkriptionella skillnader mellan celltyper eller mellan samma celltyp i hälsa och sjukdom eller efter farmakologiska behandlingar. I ryggmärgen kompliceras sådana preparat från motoriska nervceller, målet för intresse för många neurologiska och neurodegenerativa sjukdomar, av det faktum att motoriska nervceller representerar <10% av den totala cellpopulationen. Laser capture microdissection (LMD) har utvecklats för att lösa detta problem. Här beskriver vi ett protokoll för att snabbt återställa, frysa och dela upp mus ryggmärg för att undvika RNA skador av endogena och exogena RNases, följt av färgning med Azure B i 70% etanol för att identifiera motoriska nervceller samtidigt hålla endogena RNase hämmas. LMD används sedan för att fånga de färgade nervcellerna direkt i guanidin tiocyanat lysis buffert, upprätthålla RNA integritet. Standardtekniker används för att återställa det totala RNA och mäta dess integritet. Detta material kan sedan användas för nedströmsanalys av transkriptionerna av RNA-seq och qRT-PCR.
Introduction
I däggdjursvävnader som består av flera olika celltyper har tillkomsten av LMD-instrument (Laser Capture Microdissection) gett möjlighet att välja en specifik celltyp för analys på RNA- eller proteinnivå. För närvarande möjliggör förstärkning och nästa generations sekvenseringstekniker användning av en pool av totalt RNA från några tusen celler för att få en relativt grundlig inventering av transkriptomen, inklusive bedömning av relativa nivåer av RNA och identifiering av olika skarvade former. Hittills kommer proteomiska analyser av några tusen celler att nå ner genom endast mer rikliga arter. Till exempel har vi identifierat <1 000 av de vanligaste proteinerna från 3 000-4 000 motoriska neuroncellkroppar (visas inte), och Zhu och medarbetare har nyligen rapporterat att de identifierar 2 665 proteiner från ~ 15 000 tumörceller1. Med ytterligare utveckling av masspektrometri är det dock troligt att sådana analyser kommer att sträcka sig till mycket större djup.
Här presenterar vi ett specifikt protokoll som används för LMD av motoriska neuroncellkroppar från ryggmärg av möss, följt av förberedelse av RNA. Detta protokoll användes i samband med jämförelse av RNAs från motoriska nervceller av presymtomatiska transgena mutanta superoxid dismutas (SOD)1 amyotrofisk laterala skleros (ALS) möss med RNAs beredda från en vild typ SOD1 transgen stam av både RNA-seq och qRT-PCR validering2. I synnerhet utgör motoriska nervceller, i det främre hornet av den grå materian i ryggmärgen, <10% av den totala cellpopulationen, omgiven av ett hav av astrocyter, och som sådan kan deras transkriptionsprofil inte lätt dekonvoluteras från studier av hela sladden. En laser capture strategi är således idealisk för att analysera RNA uttryck i dessa celler, med fysiologi bevaras genom snabbt excising och frysning av sladden efter kort intracardiac saltlösning perfusion. Motorisk neuron somata är stor och är därmed lätt detekterbar, här med hjälp av ett färgämne som har stark affinitet för nervceller3. Dessutom, med en sådan storlek, ger dessa celler en relativt stor mängd RNA per cell fångad. Förfarandet som används, som beskrivs nedan, kan lätt justeras för att erhålla andra neuronala celltyper, liksom potentiellt andra celltyper, särskilt identifierade antingen genom färgfärgningsteknik eller genom antikroppsfärgning.
Protocol
De procedurer som beskrivs här för anestesi, dödshjälp och hjärtperfusion av möss utfördes enligt ett protokoll som godkänts av Yale University Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Förberedelse av RNase-fria instrument och lösningar
- RNase är en vanlig förorening av alla laboratorieytor, inklusive bänkskivor, mikropipetter och prövaren.
- Byt handskar ofta eller regelbundet torka med en RNAse dekontaminerande lösning.
- Rostfria dissektionsverktyg och glas kan göras RNase-fria genom uppvärmning vid >200 °C i 1 timme eller mer. Obs: Ångsterilisering förstör inte RNase. Alternativt kan du torka med en RNase dekontaminerande lösning, sedan med RNase-fri 70% etanol och lufttorka.
- Torka bänkskivor, andra labbytor och mikropipettorer med RNase dekontaminerande lösning, sedan med RNase-fri 70% etanol. Utse en specifik labbbänk eller arbetsyta för RNA-återhämtning och analys. Obs: Ta bort spetsutmatarna innan du torkar pipettors axlar och lämna dem borta, om möjligt.
- Använd rör, mikrocentrifugrör, pipetter och mikropipettespetsar som av tillverkaren är certifierade som RNase-fria. Användning av mycket låga bindningsspetsar och mikrorör rekommenderas. Använd om möjligt nyöppnade lådor eller påsar med dessa komponenter och håll dem åtskilda från den allmänna labbförsörjningen.
- Skaffa RNase-fria lösningar [Dulbeccos kalcium- och magnesiumfria PBS (PBS), etanol, RNase-fri 70% etanol] från kommersiella källor. Använd nyöppnade flaskor för varje experiment.
- Källan till Azure B-färgämnet är avgörande för framgångsrik återställning av intakt RNA. Testa varje färgsats innan du förbinder ädelprover med färgning och insamling. Samla några tusen nervceller från ett icke-perserimentalt djur, förbered RNA och bestäm RNA-integriteten enligt beskrivningen nedan för att hitta en som konsekvent producerar RIN-nummer över 8,5.
- Lös upp Azure B-färgämne (1%, wt/vol) i RNase-fri 70% etanol, vanligtvis 0,3 g i 30 ml etanol i ett 50 ml centrifugeringsrör. Blanda väl på en rocker på RT över natten eller tills alla partiklar har löst sig. Ett rör av denna lösning kan användas för att färga flera diabilder utan att påverka färgningsintensiteten.
- Som en försiktighetsåtgärd, använd ett annat rör av fläck för varje biologisk replikat.
- Använd cryomolds och O.C.T. för att bädda in sladdsektioner utan ytterligare behandling.
- Håll kryostaten vid -20 till -24 °C. Efter sektionering, placera diabilderna i en -80 °C frys tills ett tillräckligt antal har förberetts. Starta RNA-förberedelsen så snart som möjligt efter att bilderna har gjorts. För långtidslagring, förvara odefekterade eller delvis sektionerade OCT-block, snarare än diabilder, vid 80 °C.
- Gör guanidin tiocyanatbufferten för RNA-beredning från de dissekerade motoriska nervcellerna med hjälp av lösningarna från RNA-preparatets tillverkare enligt dess anvisningar.
2. Beredning av ryggmärgssektioner från möss (figur 1A)
- Rengör alla dissektionsverktyg, glasrutschbanor, rakblad och dissekeringsplattform genom att baka eller torka med RNase dekontaminerande lösning, följt av RNase-fri 70% etanol. Låt torka i 2 min. Håll allt dammfritt genom att täcka med labbservetter.
- Djurhanteringsförfaranden, inklusive anestesi, hjärtperfusion och dödshjälp, bör utföras i enlighet med kraven från den lokala institutionella djurvårds- och användningskommittén (IACUC), med målet att snabbt föra djuret till den punkt där ryggmärgen dissekerar.
- Söv musen genom intraperitoneal (ip) injektion av en dödlig dos Ketamin (450 mg/kg).
- När en djup nivå av anestesi uppnås och bekräftas av brist på tå-nyp svar, placera mus ventral sida upp på en dissekering plattform (en styrofoam bräda, till exempel), öppna brösthålan för att exponera hjärtat och sätt in 27 G fjäril nål av en infusion inställd i vänster ventrikel (som är till höger om prövaren). Nicka rätt atrium med en vass tång och granska med PBS med en hastighet av 5-7 ml/min i ca 2 min med hjälp av en peristaltisk pump. Vätskan som strömmar från atriumet bör vara i stort sett fri från blod vid denna tidpunkt.
- Ta bort perfusionsnålen, halshugg musen och vänd den på dissekeringskortet. Öppna huden för att exponera ryggraden, använd liten sax och tång för att ta bort ryggkotorna och lyft ut ryggmärgen medan du skär nervrötterna med en skarp tång. Hastighet och övning är avgörande för att flytta från början av perfusionen till avlägsnandet av sladden; detta bör inte ta mer än 7 minuter.
- Skölj sladden i 10 sekunder i RNase-fritt vatten för att tvätta bort eventuellt kvarvarande blod. Lägg ryggmärgen på en RNase-fri glasrutschbana med böjda tångar mycket försiktigt men snabbt. Dela ryggmärgen tvärs övergående med ett rent rakblad i 9-10 stycken.
- Placera bitarna i en kryomold fylld med O.C.T. med samma tång och rikta dem vertikalt med en ren nål. Placera formen i en grund bricka som innehåller 2-metylbutan förkyld med flytande kväve och lägg sedan brickan i ett flytande kvävebad för att snabbt frysa ryggmärgsbitarna för att undvika RNA-nedbrytning.
- Förvara det OKT-inbäddade blocket vid -80 °C i upp till 6 månader före sektionering. Processen från hämtning av sladden genom frysning bör göras inom 5 minuter för att upprätthålla RNA-integriteten.
- Cryosection O.C.T.-embedded block vid -20 °C med en cryostat för att producera 20 μm skivor, som var och en innehåller 9-10 ryggmärgskorssektioner, på RNase-fria PEN-membran 2 μm diabilder hålls initialt vid rumstemperatur för att säkerställa att sektionerna klibbar vid glidningen. Frys omedelbart om sektionen på en -20 °C yta inuti kryostaten. Håll rutschkanorna på -80 °C tills de används.
3. Färgning av ryggmärgssektioner (figur 1A)
- På ett rent rack, ordna sex 50 ml koniska rör. Fyll dem alla med 25-30 ml RNase-fri 70% etanol, så att djupet är tillräckligt för att täcka alla sektioner på en bild när bilden är nedsänkt. Gör 30-35 ml 1% Azure B-lösning enligt beskrivningen tidigare och håll den på samma rack för att minimera tiden mellan att byta lösningar under tvätt eller färgning. Håll tre eller fyra labbservetter framför racket för att snabbt tömma extra lösning.
- Ta ut rutschkanorna ur frysen på torris vid -80 °C. Tina en rutschkana genom att placera den på en handskhandflata. Ta bort det mesta av fukten och kondensen på rutschkanan genom att torka av den med en labbservett, var försiktig så att du inte rör vid sektionerna. Lägg rutschkanan på färskt kiselgeltorsikmedel i en Petri-skål i 30-40 sekunder för att torka helt. Om luftfuktigheten i labbet är hög kan kortvarig behandling i en vakuumsyrekan användas för att torka rutschkanan snabbare.
- Tvätt och färgning.
- Doppa den torkade rutschkanan i det första röret med RNase-fri 70% etanol. Blötlägg rutschkanan i 30 sekunder och tvätta sedan bilden för att ta bort OKT genom att doppa den upp och ner i 45-60 sek . Ta bort glidningen ur lösningen och töm ut överflödig vätska på labbservetter. Upprepa samma process genom att doppa bilden i det andra röret på 70% etanol. Om OKT runt ryggmärgssektionerna inte är helt borta, upprepa tvätten i det tredje röret.
- Efter att ha tömt överskottsvätskan, dränk bilden i 1% Azure B-lösning i 70% RNase-fri etanol i 30-45 sek. Töm överskjutande Azure B på en labb rensning; Vid denna tidpunkt kommer hela bilden att vara blå.
- Doppa glidningen i nästa rör med 70% etanol och doppa upp och ner snabbt 3-4x för att ta bort överflödigt färgämne och för att göra den specifika motoriska neuronfärgningen synlig. Om sektionerna ser mycket mörkt färgade ut, upprepa det kvarhållande steget i ett nytt rör med 70% etanol. Om färgningen verkar för lätt returnerar du bilden till Azure B-lösningen i ytterligare 30 sekunder och upprepar destainingen. Torka av överskottetanolen och lufttorka rutschkanan i ~ 40 sek tills all vätska är borta. Den grå materian kommer att vara ljusblå, medan motorneuronerna kommer att färgas djupt blå, vilket är lätt synligt. Starta dissekeringen omedelbart.
4. Mikrodissektion för laserfångst (LMD) (figur 1B)
- Slå på mikroskopet och lossa rörhållaren för att fästa locket på ett 0,6 ml mikrofugerör för provtagning. Sätt 30 μl guanidin tiocyanatlysbuffert i locket på ett 0,6 ml mikrofugerör. Täck lockets yta med vätska genom att sprida lösningen med en pipettspets. På detta sätt kommer alla insamlade nervceller att lösas upp i löslig lösning när de dissekeras. Rikta locket mot hålet och målet med mikroskopprogramvaran. Håll locket i täckt läge tills laserfångst påbörjas.
- Placera den lufttorkade rutschkanan på LMD-mikroskopets scen upp och ner, så att PEN-diakons membran glider nedåt. Membranet med sektioner ska vända mot hålet, under vilket är uppsamlingsröret.
- Slå på lasern 10 min innan du påbörjar bildförberedelserna. Fokusera på en ryggmärgssektion med 5X-målet. Flytta till 20X-målet för dissekering.
- Markera en "dummy" region med ljuspennan och låt lasern skära ut den utan att samla den. Detta slappnar av PEN-membranet och gör det möjligt att markera och skära flera regioner successivt.
- Fokusera om och identifiera motoriska nervceller i ventral horn regionen. Dessa nervceller känns igen på deras plats, deras pyramidala morfologi, deras stora storlek och deras mörkblå färgning med Azure B (Figur 2).
- Använd ljuspennan, välj ritverktyget och markera längs kanten av motorneuronerna, vilket gör en komplett kontur. Försök att göra konturen så nära motoriska neuron som möjligt för att undvika förorening från andra celler än motorneuron. (Testa några avsnitt i förväg för att se hur bred laserskärningslinjen är och justera avståndet efter behov.) Markera flera celler innan du skär; programvaran kommer ihåg positionerna.
- Ta under locket under skärläget genom att klicka på lockets läge. Klicka på startknappen för att initiera motorisk neuron dissekering med lasern. Samla alla motoriska nervceller från alla sektioner på en glidning i locket på ett mikrofugerör.
- När uppsamlingen är klar, ta ut mikrofugeröret ur hållaren genom att lossa brickan och försiktigt lossa röret. Lös upp motorneuronerna helt i bufferten genom att pipetting lösningen upp och ner. Flytta lösningen in i rörens kropp genom att centrifugera vid 14 000 x g i 2 minuter vid 4 °C. Frys provet omedelbart i torris och förvara det vid -80 °C. Denna process, från glidfärgning genom motorisk neuronsamling, bör göras inom 30 minuter för en bild för att minimera RNA-nedbrytning.
5. RNA-förberedelse från motoriska nervceller
Tina alla insamlade nervceller från ett djur och slå ihop dem för att extrahera RNA. Exempel kan se ljusblå ut beroende på antalet motoriska nervceller (färgade med Azure B) i dem. Extrahera RNA med ett lämpligt kit enligt protokollet som tillhandahålls för LMD-vävnad, eluering i minsta möjliga volym. Ta 1 μl för att kontrollera provet. Frys snabbt det återstående RNA på torr is och förvara vid -80 °C.
6. Bestämning av RNA:s kvalitet och kvantitet
Bestäm RNA-kvaliteten med 1 μl-provet på ett kapillärelektroforesmikrofluikanchip enligt tillverkarens protokoll. Totala RNA preparat med ett RNA Integrity Number (RIN) över 8,5 kan användas för RNA-seq och qRT-PCR. Datautmatningen inkluderar vanligtvis också den ungefärliga koncentrationen av provet.
Representative Results
Protokollet som beskrivs ovan och i figur 1 bör producera 50 ng eller mer av totalt RNA med en RIN på >8,5 från 3 000-4 000 ryggmärgsmotorneuroncellkroppar dissekerade från 9-10 20 μm-skivorna på cirka 20 PEN-diabilder. Eftersom detta antal bilder representerar mindre än 10% av ett O.C.T.-inbäddat block av en mus ryggmärg, är det möjligt att återvända till blocket, som har lagrats vid -80 °C, och skära fler skivor för att gå igenom en annan omgång RNA-förberedelse. Om större mängder RNA behövs för en analys är det bättre att bara göra antalet bilder (t.ex. 20) på en gång som kan bearbetas genom dissekering och RNA-förberedelse om några dagar, gör sedan fler bilder för en andra omgång och kombinera produkterna. Var noga med att kontrollera RIN för varje preparat först för att undvika att kombinera en bra med en dålig. RNA-seq-metoder blir mer känsliga och nya PCR-tekniker lovar högre känslighet än nuvarande. Således kommer mindre RNA från färre neuroncellkroppar att krävas, vilket möjliggör större sekvenseringsdjup och mer omfattande validering av intressanta träffar. Å andra sidan kan fullständig efterlevnad av MIQE-rekommendationerna för qRT-PCR-analysoch validering 4 kräva större belopp för att möjliggöra nödvändiga kontrollreaktioner för RNA med låg förekomst.
Bild 2 visar en typisk serie bilder av en del av en kammare med ryggmärgs ventralt horn efter Azure B-färgning och dissekering. I panel A är de stora, mörkt färgade cellkropparna motoriska nervceller, bekräftade av antichattantikroppsfärgning2, och är lätt differentierade från mindre närliggande celler. Panel B visar samma region med enskilda cellkroppar skisserade med ljuspennan och numrerade av mikroskopprogramvaran. Konturerna följer noggrant cellkroppens marginaler, med en liten ersättning för laserns skärbredd. Detta avstånd måste bestämmas för varje lasereffektinställning för att minimera införandet av främmande material samtidigt som man undviker förlust av motorisk neuroncytosoll. Panelerna C och D visar sektionen efter att lasern har skurits och de enskilda cellkropparna har fallit ner i uppsamlingslocket. Observera att skärmarginalen inte exakt följer ljuspennans kontur i panel C, men stannar till stor del utanför den. Denna oregelbundenhet är uppenbar i panel D, liksom det mörka området runt varje snitt, vilket återspeglar värmeskadorna på vävnaden som orsakas av lasern. På grund av detta, om två cellkroppar är mycket nära varandra, är det bättre att beskriva dem för ett enda snitt, snarare än att försöka skära dem separat och förlora lite RNA för att värma skador i deras region med nära kontakt.
Figur 3 visar typiska resultat av en elektroforesisk analys av RNA-integriteten hos ett prov av RNA som framställs av ~ 4 000 musmotoriska neuroncellkroppar som samlats in av LMD. Den övre panelen är det elektroferogram som produceras av 1 μl av det totala RNA; inset till höger är en bild av gelén. I båda, notera de framträdande ribosomal RNA toppar. Den nedre panelen är elektrosfärogrammet i körfältet som innehåller RNA-storleksstandarder. Analysprogramvaran beräknade en RIN på 9,8 för detta prov, med en koncentration på 4,9 ng/μl. Totalt 13 μl av denna lösning var tillgänglig efter analysen, vilket ger 64 ng RNA för nedströms qRT-PCR validering av transkriptionsbelopp. För en typisk qRT-PCR-analys av måttligt rikliga transkriptioner är 0,15-0,20 ng totalt RNA tillräckligt för att producera korrekt kvantifiering2, så mängden RNA som är tillgängligt från denna förberedelse är tillräcklig för att validera ett antal transkriptioner med flera primeruppsättningar, somrekommenderas 4. Naturligtvis kan större mängder input RNA användas för att tillåta validering av sällsynta transkriptioner. Detta belopp är också mer än tillräckligt för att möjliggöra biblioteksförberedelser och nästa generations RNA-seq.
Figur 1. Översikt över ryggmärg skiva produktion och laser fånga mikrodissektion av ryggmärg motor neuron cell organ. A) Större steg i segmentproduktion och färgning. B) Tecknad vy över ryggmärgssektionen och laserav dissekering. Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 2. Före och efter bilder av en laser dissekering av Azure B färgade motor neuron cell organ. A) En del av ventrala hornet i en fläckig sektion. Notera de fyra stora, mörkt färgade cellerna. Det finns också några lätt färgade och något mindre celler, som inte är motoriska nervceller (bekräftade av anti-Chat antikroppsfärgning; visas inte, men se Bandyopadhyay2) och som inte kommer att väljas för dissekering. De många små, mörka fläckarna är förmodligen neuronala processer (dendriter och axoner), men detta har inte bekräftats. B) De fyra cellkropparna som skisseras med ljuspennan. Observera att konturerna noga följer cellernas marginaler, med ett minsta avstånd mellan dem. Detta avstånd bör fastställas empiriskt för varje mikroskop och laser. Programvaran numrerar de enskilda nervcellerna, vilket förenklar att hålla reda på hur många som har samlats in. C och D) Efter att lasern har skurits och bitarna som innehåller cellkropparna har fallit ner i uppsamlingslocket. Observera att hålet som lämnas kvar är något större än konturen och är oregelbundet. Detta återspeglar laserstrålens bredd och dess något varierande skäreffektivitet beroende på vävnadens lokala sammansättning. Det är också uppenbart att kanten av mörknad vävnad som omger varje hål på grund av lokala värmeskador orsakade av lasern.
Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 3. Elektroforesisk analys av integriteten hos RNA som framställs av LMD-prover. A) En 1 μl alikvot av RNA beredd från ~4,000 motor neuron cell organ av ovanstående protokoll analyserades av mikrokapillär elektrofores på ett mikrofluidics chip. Elektropherogrammet visas, med framstående ribosomala RNA toppar. Till höger finns en bild av själva gelén. B) Elektrosfärogrammet av storleksstandarden visas, med motsvarande gelbana till höger. Instrumentprogramvaran beräknade en RIN på 9,8 för detta prov och en koncentration på 4,9 ng/μl. Klicka här för att se större bild.
Discussion
Det viktigaste måttet på framgång för detta protokoll för att producera totalt RNA genom lasermikrodissektion av ryggmärgsskivor är RIN-värdet5. För RNA-prover från högre eukaryoter ger värden över 8,5 regelbundet högkvalitativa sekvenserings- och qRT-PCR-data. Om utbytet är lågt men kvaliteten är hög, upprepa preparatet. Om integriteten är lägre (även 7,5-8), är det dock bättre att hitta källan till problemet och försöka igen. Det finns många steg där något kan gå fel, men egentligen bara två källor till problemet - endogen RNase-förorening eller exogen RNase-förorening. Den första kan hanteras genom övning, så att tiden från musens offer till frysning av dess O.C.T-inbäddade sladd minimeras. Den andra punkten i protokollet där endogena RNase kan bidra till ett dåligt resultat är under beredningen av skivorna. Varje skiva ska hålla sig till en pen-bild i rumstemperatur snabbt, men den smälter (O.C.T blir klar). Ju snabbare skivan kan återerrosas desto bättre. Kryostaten vi använder har plana ytor inuti kammaren som ligger på -20 °C, som vi använder för att snabbt frysa skivan igen. Hitta en liknande plats i kryostaten som används och se till att skivan blir ogenomskinlig igen snabbt.
Att spåra källor till exogena RNase kan vara svårt, eftersom det finns så många möjligheter. De enda reagenser som används som inte uttryckligen är RNase-fria är O.C.T. och Azure B. Om Azure B har fungerat tillfredsställande tidigare kan du prova en ny flaska O.C.T., även om det här reagenset aldrig har varit ett problem. RNase-fria reagenser kan också bytas ut, även från en annan leverantör. En mycket troligare källa är utredaren. Förutom en grundlig sanering av arbetsområdet är det ofta användbart att en annan labbmedlem följer med och observerar alla steg i proceduren. Även om detta är någon som inte rutinmässigt utför denna procedur, kan en ny uppsättning ögon plocka upp en annars obemärkt föroreningskälla.
Att utvidga detta protokoll till att återställa RNA från andra ryggmärgsceller, från ryggmärgsceller från andra arter eller från specifika celltyper i andra organ kommer att kräva modifieringar inom flera områden som är inriktade på att uppnå tydlig identifiering av de celler som är av intresse samtidigt som man undanrömar, eller åtminstone minimerar, effekten av endogena RNase. I protokollet här tillät snabb borttagning och frysning av sladden, tillsammans med Azure B-färgning i 70% etanol, både minimering av RNA-nedbrytning och enkel identifiering av motoriska neuroncellkroppar. Azure B är en väletablerad histokemisk fläck för nervceller som verkar binda till RNA3 och har använts för att utvärdera RNA-innehåll av nervceller i obduktionsprover av hjärnvävnad från patienter med neurodegenerativ sjukdom6. Noterbart var att Azure B-färgning varken påverkade integriteten hos det renade RNA eller dess förmåga att omfördelad och analyseras. Andra färgämnen, såsom cresylviolett 7 och toluidinblått8 har använts i liknande LMD-protokoll. Samla cellkropparna direkt i guanidin tiocyanat lösning som de dissekerades förutsatt att det sista steget som resulterade i rutinmässig återhämtning av intakt RNA.
Liknande metoder kan föreställas för andra celler och organ, erkänna att identifiera celler av intresse samtidigt minimera eller helst förhindra RNA nedbrytning av endogena RNases är det kritiska kravet för framgångsrik analys. I vävnader som har höga nivåer av RNase, såsom bukspottkörtel, snabb hantering och låg temperatur har kombinerats för att möjliggöra återhämtning av RNA från β-celler, dra nytta av deras naturliga autofluorescens för visualisering9. Förfaranden med antikroppsfärgning för identifiering har ocksårapporterats 10, men har inte varit helt framgångsrika i våra händer. Slutligen finns många musmodeller tillgängliga som uttrycker fluorescerande fusionsproteiner (dvs. GFP, YFP, RFP) i celler av intresse, som kan användas för att identifiera demi vävnadssektioner på LMD-mikroskopet. Faktum är att de musstammar vi har analyserat med detta protokoll uttrycker ett fusionsprotein mellan SOD1 och YFP11, och deras ryggmärgsmotorneuroner är mycket fluorescerande. Vi kunde dock inte hitta en uppsättning etanoltvättar och / eller uttorkningsförhållanden som samtidigt skulle ta bort O.C.T., hämma RNase-aktiviteten och konsekvent upprätthålla tillräcklig YFP-fluorescens för att möjliggöra visualisering av motoriska nervceller och deras återhämtning av LMD. Kanske kan ett nytt fluorescerande protein eller en variant av de tillgängliga som upprätthåller fluorescens i organiska lösningsmedel hittas för att övervinna denna begränsning.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka George Farr och medlemmar av Horwich lab för hjälpsamma diskussioner. Detta arbete stöddes av Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Webster Veterinary | 26637041101 | Any source approved by the institutional veterinary service |
| Dissection tools (scissors, forceps, etc.) | Any convenient source of high-quality dissection instruments | ||
| Cryostat | Leica Microsystem | CM3050S | Other cryostats should be suitable |
| LMD6000 B | Leica Microsystem | Other LMD systems have not been tested | |
| RNase-free PEN-membrane 2 μm slides | Leica Microsystem | 11505189 | Other slide types have been tested and do not perform well |
| RNeasy Micro kit (50) | Qiagen | 74004 | Any kit that uses guanidine thiocyanate lysis buffer and has been tested for recovering small quantities of RNA can be used |
| Agilent 2100 BioAnalyzer | Agilent Technologies | G2939A | |
| Azure B Certified | MP Biomedicals | 190520 | Critical! Product from any source has to be tested before use for its ability to maintain RNA integrity |
| PBS | Sigma Life Science | D8537 | Any reliable source of RNase-free PBS |
| RNA Ethanol 70% (made with DEPC treated water) | American Bioanalytical | AB04010-00500 | Any reliable source, can be lab-made |
| Water, RNase-free, Endotoxin tested (treated with DEPC to eliminate RNase) | American Bioanalytical | AB02128-00500 | Any reliable source, can be lab-made |
| RNase AWAY | Invitrogen Life Technologies | 10328-011 | Other similar RNase removal reagents, such as RNaseZAP (also from Invitrogen) can be used |
| 2-Methylbutane | Electron Microscopy Sciences | 78-78-4 | Any source |
| Maxymum Recovery microfuge tubes (0.6 and 1.5 ml) and pipette tips | Axygen | 311-03-051 & 311-09-051 | Ultra-low retention, RNase free tubes and tips; test other manufacturer's products before using |
| O.C.T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryomold Intermediate Size | Tissue-Tek | 4566 | |
| Lab wipes (Kimwipes) | KIMTECH | 34155 |
References
- Zhu, J., Nie, S., Wu, J., Lubman, D. M. Target proteomic profiling of frozen pancreatic CD24+ adenocarcinoma tissues by immuno-laser capture microdissection and nano-LC-MS/MS. J. Proteome. Res. , (2013).
- Bandyopadhyay, U., et al. RNA-Seq profiling of spinal cord motor neurons from a presymptomatic SOD1 ALS mouse. PLoS ONE. 8 (1), 10-1371 (2013).
- Shea, J. R. A method for in situ cytophotometric estimation of absolute amount of ribonucleic acid using azure B1. J. Histochem. Cytochem. 18 (2), 143-152 (1970).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin. Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol. Biol. 7, (2006).
- Doebler, J. A., Rhoads, R. E., Anthony, A. Neuronal RNA in Pick's and Alzheimer's diseases. Comparison of disease-susceptible and disease-resistant cortical areas. Arch. Neurol. 46 (2), 134-137 (1989).
- Lobsiger, C. S., Boillée, S., Cleveland, D. W. Toxicity from different SOD1 mutants dysregulates the complement system and the neuronal regenerative response in ALS motor neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (18), (2007).
- Ferraiuolo, L., et al. Microarray analysis of the cellular pathways involved in the adaptation to and progression of motor neuron injury in the SOD1 G93A mouse model of familial ALS. J. Neurosci. 27 (34), 9201-9219 (2007).
- Sturm, D., et al. Improved protocol for laser microdissection of human pancreatic islets from surgical specimens. J. Vis. Exp. 6 (71), (2013).
- Burbach, G. J., Dehn, D., Nagel, B., Del Turco, D., Deller, T. Laser microdissection of immunolabeled astrocytes allows quantification of astrocytic gene expression. J. Neurosci. Methods. 138 (1-2), 141-148 (2004).
- Wang, J., et al. Progressive aggregation despite chaperone associations of a mutant SOD1-YFP in transgenic mice that develop ALS. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (5), 1392-1397 (2009).
