Summary
उच्च गुणवत्ता वाले कुल आरएनए को 70% इथेनॉल में नीला बी के साथ रीढ़ की हड्डी के वर्गों को धुंधला करने के बाद लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन द्वारा माउस रीढ़ की हड्डी मोटर न्यूरॉन्स के सेल निकायों से तैयार किया गया है। आरएनए-सेक्यू और क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा डाउनस्ट्रीम आरएनए विश्लेषण की अनुमति देने के लिए पर्याप्त आरएनए (~ 40-60 एनजी) 3000-4000 मोटर न्यूरॉन्स से बरामद किया जाता है।
Abstract
ब्याज की कोशिकाओं से उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए की तैयारी सेल प्रकारों के बीच या स्वास्थ्य और रोग में एक ही सेल प्रकार या फार्माकोलॉजिक उपचार के बाद प्रतिलेखन मतभेदों के सटीक और सार्थक विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है। रीढ़ की हड्डी में, मोटर न्यूरॉन्स से इस तरह की तैयारी, कई न्यूरोलॉजिक और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में रुचि का लक्ष्य, इस तथ्य से जटिल है कि मोटर न्यूरॉन्स कुल सेल आबादी का <10% प्रतिनिधित्व करते हैं। इस समस्या के समाधान के लिए लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन (एलएमडी) विकसित किया गया है। यहां, हम अंतर्जात और बहिर्जात आरएनएस द्वारा आरएनए क्षति से बचने के लिए जल्दी से ठीक होने, फ्रीज और सेक्शन माउस स्पाइनल कॉर्ड के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिसके बाद 70% इथेनॉल में नीला बी के साथ धुंधला हो जाता है, जबकि अंतर्जात आरएनएस को बाधित रखते हुए मोटर न्यूरॉन्स की पहचान की जाती है। एलएमडी का उपयोग आरएनए अखंडता को बनाए रखते हुए सीधे ग्वानिडीन थिओसायनेट लाइसिस बफर में दाग न्यूरॉन्स को पकड़ने के लिए किया जाता है। मानक तकनीकों का उपयोग कुल आरएनए को ठीक करने और इसकी अखंडता को मापने के लिए किया जाता है। इस सामग्री का उपयोग आरएनए-सेक्यू और क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा टेप के डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए किया जा सकता है।
Introduction
कई अलग-अलग सेल प्रकारों से बने स्तनधारी ऊतकों में, लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन (एलएमडी) इंस्ट्रूमेंटेशन के आगमन ने आरएनए या प्रोटीन स्तर पर विश्लेषण के लिए एक विशिष्ट सेल प्रकार का चयन करने की संभावना को वहन किया है। वर्तमान में, प्रवर्धन और अगली पीढ़ी की अनुक्रमण तकनीकें कुछ हजार कोशिकाओं से कुल आरएनए के एक पूल का उपयोग करने के लिए ट्रांसक्रिप्टोम की अपेक्षाकृत पूरी तरह से सूची प्राप्त करने में सक्षम बनाती हैं, जिसमें आरएनए के सापेक्ष स्तरों का आकलन और विभिन्न स्प्लिट किए गए रूपों की पहचान शामिल है। आज तक, कुछ हजार कोशिकाओं के प्रोटेओमिक्स विश्लेषण केवल अधिक प्रचुर मात्रा में प्रजातियों के माध्यम से नीचे पहुंच जाएगा । उदाहरण के लिए, हमने 3000-4,000 मोटर न्यूरॉन सेल निकायों (नहीं दिखाए गए) से सबसे प्रचुर मात्रा में प्रोटीन के <1,000 की पहचान की है, और झू और सहकर्मियों ने हाल ही में ~ 15,000 ट्यूमर कोशिकाओं1से 2,665 प्रोटीन की पहचान करने की सूचना दी है। हालांकि, बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के आगे के विकास के साथ, यह संभावना है कि इस तरह के विश्लेषण कहीं अधिक गहराई तक विस्तारित होंगे।
यहां, हम चूहों की रीढ़ की हड्डी से मोटर न्यूरॉन सेल निकायों के एलएमडी के लिए उपयोग किए जाने वाले एक विशिष्ट प्रोटोकॉल पेश करते हैं, जिसके बाद आरएनए की तैयारी होती है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग आरएनए की तुलना प्रेसिम्प्टोमैटिक ट्रांसजेनिक म्यूटेंट सुपरऑक्साइड डिस्मुटेज़ (एसओडी) 1 एमियोट्रोफिक लेटरल स्क्लेरोसिस (एएलएस) चूहों के मोटर न्यूरॉन्स से करने के संदर्भ में किया गया था, जिसमें आरएनए से तैयार आरएनए से आरएनए-एसईक्यू और क्यूआरटी-पीसीआर सत्यापन2दोनों द्वारा जंगली प्रकार के एसओडी1 ट्रांसजेनिक तनाव से तैयार किया गया था। विशेष रूप से, रीढ़ की हड्डी में ग्रे पदार्थ के पूर्वकाल सींग में मोटर न्यूरॉन्स, कुल सेल आबादी का <10% शामिल है, जो एस्ट्रोसाइट्स के समुद्र से घिरा हुआ है, और इस तरह, उनके ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल को पूरी कॉर्ड के अध्ययन से आसानी से विघटित नहीं किया जा सकता है। एक लेजर कैप्चर दृष्टिकोण इस प्रकार इन कोशिकाओं में आरएनए अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए आदर्श है, जिसमें शरीर विज्ञान को संक्षिप्त इंट्राकार्डिएक खारा परफ्यूजन के बाद कॉर्ड को तेजी से उत्तेजित और ठंडा करके संरक्षित किया जाता है। मोटर न्यूरॉन सोमता बड़े हैं और इस प्रकार आसानी से पता लगाने योग्य हैं, यहां एक डाई का उपयोग करके जिसमें न्यूरॉन्स3के लिए मजबूत आत्मीयता है। इसके अलावा, इस तरह के आकार के साथ, ये कोशिकाएं प्रति सेल अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में आरएनए प्रदान करती हैं। उपयोग की जाने वाली प्रक्रिया, जैसा कि नीचे विस्तृत है, अन्य न्यूरोनल सेल प्रकारों के साथ-साथ संभावित अन्य सेल प्रकारों को प्राप्त करने के लिए आसानी से समायोजित किया जा सकता है, विशेष रूप से डाई स्टेनिंग तकनीकों द्वारा या एंटीबॉडी धुंधला द्वारा पहचाना जाता है।
Protocol
संज्ञाहरण, इच्छामृत्यु, और चूहों के हृदय परफ्यूजन के लिए यहां वर्णित प्रक्रियाओं को येल विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत किया गया था ।
1. RNase मुक्त उपकरणों और समाधान की तैयारी
- RNase बेंच टॉप, माइक्रोपिपेटेस, और अन्वेषक सहित सभी प्रयोगशाला सतहों का एक आम संदूषक है।
- दस्ताने अक्सर बदलें या नियमित रूप से आरएनसीई डीकंमामिनेटिंग समाधान के साथ पोंछें।
- स्टेनलेस स्टील विच्छेदन उपकरण और कांच के बर्तन 1 घंटे या उससे अधिक के लिए >200 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग करके RNase मुक्त बनाया जा सकता है। नोट: भाप नसबंदी RNase को नष्ट नहीं करता है। वैकल्पिक रूप से, आरएनएज़ डीरटैमिनेटिंग समाधान के साथ पोंछें, फिर आरएनएसई-मुक्त 70% इथेनॉल और हवा सूखी के साथ।
- रेनासे-डीकंबैमिनेशन समाधान के साथ बेंच टॉप, अन्य प्रयोगशाला सतहों और माइक्रोपिपेटर्स को पोंछें, फिर आरएनए-मुक्त 70% इथेनॉल के साथ। आरएनए वसूली और विश्लेषण के लिए एक विशिष्ट प्रयोगशाला बेंच या कार्य क्षेत्र नामित करें। नोट: पिपेटर्स के शाफ्ट पोंछने से पहले टिप इजेक्टर निकालें और यदि संभव हो तो उन्हें छोड़ दें।
- ट्यूब, माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब, पिपेट और माइक्रोपिपेट युक्तियों का उपयोग करें जो उनके निर्माता द्वारा आरएनएसई-मुक्त होने के लिए प्रमाणित हैं। बहुत कम बाध्यकारी युक्तियों और माइक्रोट्यूब का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। यदि संभव हो, तो इन घटकों के हौसले से खोले गए बक्से या बैग का उपयोग करें और उन्हें सामान्य प्रयोगशाला आपूर्ति से अलग रखें।
- वाणिज्यिक स्रोतों से RNase-मुक्त समाधान [Dulbecco के कैल्शियम और मैग्नीशियम मुक्त पीबीएस (पीबीएस), इथेनॉल, आरएनएसई-मुक्त 70% इथेनॉल] प्राप्त करें। प्रत्येक प्रयोग के लिए नई खोली गई बोतलों का उपयोग करें।
- नीला बी डाई का स्रोत बरकरार आरएनए की सफल वसूली के लिए महत्वपूर्ण है । धुंधला और संग्रह करने के लिए कीमती नमूने करने से पहले डाई के प्रत्येक बैच का परीक्षण करें। एक गैर-अनुभवात्मक जानवर से कुछ हजार न्यूरॉन्स एकत्र करें, आरएनए तैयार करें, और आरएनए अखंडता का निर्धारण करें जैसा कि नीचे वर्णित है कि एक को खोजने के लिए लगातार 8.5 से ऊपर रिन नंबर पैदा करता है।
- आरएनएसई-मुक्त 70% इथेनॉल में नीला बी डाई (1%, wt/vol) को भंग करें, आमतौर पर 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में 30 मिलीलीटर इथेनॉल में 0.3 ग्राम। रात भर या जब तक सभी कण भंग न हो जाए तब तक आर टी में एक घुमाव पर अच्छी तरह से मिलाएं। इस समाधान की एक ट्यूब धुंधला तीव्रता को प्रभावित किए बिना कई स्लाइड दाग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
- एहतियात के तौर पर, प्रत्येक जैविक दोहराने के लिए दाग की एक अलग ट्यूब का उपयोग करें।
- आगे के उपचार के बिना कॉर्ड वर्गों एम्बेड करने के लिए क्रायोमोल्ड्स और ओ.C.टी. का उपयोग करें।
- क्रायोस्टेट को -20 से -24 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें। सेक्शनिंग के बाद, स्लाइड्स को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में तब तक रखें जब तक कि पर्याप्त संख्या तैयार न हो जाए। स्लाइड ्स के बाद जल्द से जल्द आरएनए की तैयारी शुरू करें। दीर्घकालिक भंडारण के लिए, 80 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड के बजाय बिना खंडित या आंशिक रूप से खंडित OCT ब्लॉक रखें।
- आरएनए तैयारी किट निर्माता द्वारा अपनी दिशाओं के अनुसार प्रदान किए गए समाधानों का उपयोग कर विच्छेदित मोटर न्यूरॉन्स से आरएनए तैयारी के लिए ग्वानिडीन थिओसाइनेट बफर बनाएं।
2. चूहों से रीढ़ की हड्डी वर्गों की तैयारी (चित्रा 1A)
- सभी विच्छेदन उपकरण, ग्लास स्लाइड, रेजर ब्लेड, और विच्छेदन मंच को पाक या RNase दूषित समाधान के साथ पोंछते हुए साफ करें, इसके बाद RNase-मुक्त 70% इथेनॉल। 2 मिनट के लिए सूखने दें। लैब वाइप्स से कवर करके सब कुछ धूल मुक्त रखें।
- एनेस्थीसिया, हृदय परफ्यूजन और इच्छामृत्यु सहित पशु हैंडलिंग प्रक्रियाओं को स्थानीय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) की आवश्यकताओं के अनुसार किया जाना चाहिए, जिसमें जानवर को रीढ़ की हड्डी के विच्छेदन के बिंदु पर तेजी से लाने का लक्ष्य है।
- केटामाइन (450 मिलीग्राम/किलो) की घातक खुराक के इंट्रापेरिटोनियल (आईपी) इंजेक्शन द्वारा माउस को एनेस्थेटाइज करें।
- एक बार संज्ञाहरण का एक गहरा स्तर प्राप्त हो जाता है और पैर की अंगुली चुटकी प्रतिक्रिया की कमी से पुष्टि की जाती है, माउस वेंट्रल साइड को विच्छेदन मंच (उदाहरण के लिए स्टायरोफोम बोर्ड) पर रखें, दिल को बेनकाब करने के लिए छाती गुहा खोलें, और बाएं वेंट्रिकल में सेट एक जलसेक की 27 जी तितली सुई डालें (जो अन्वेषक के दाईं ओर है)। निक एक तेज संदंश के साथ सही आलिंद, और एक पेरिस्टाल्टिक पंप का उपयोग कर के बारे में 2 मिनट के लिए 5-7 मिलीलीटर की दर से PBS के साथ perfuse । एट्रियम से बहने वाला तरल इस बिंदु पर काफी हद तक रक्त से मुक्त होना चाहिए।
- परफ्यूजन सुई निकालें, माउस को काटना, और विच्छेदन बोर्ड पर इसे चालू करें। रीढ़ की हड्डी के कॉलम को बेनकाब करने के लिए त्वचा को खोलें, कशेरुकी को हटाने के लिए छोटी कैंची और संदंश का उपयोग करें, और तेज संदंश के साथ तंत्रिका जड़ों को तोड़ते हुए रीढ़ की हड्डी को उठाएं। परफ्यूजन की शुरुआत से लेकर कॉर्ड को हटाने तक जाने में गति और अभ्यास आवश्यक है; यह 7 मिनट से अधिक नहीं लेना चाहिए।
- किसी भी अवशिष्ट रक्त को धोने के लिए RNase-मुक्त पानी में 10 सेकंड के लिए कॉर्ड कुल्ला। रीढ़ की हड्डी को एक घुमावदार संदंश के साथ एक RNase मुक्त ग्लास स्लाइड पर बहुत धीरे लेकिन जल्दी से रखें। रीढ़ की हड्डी को 9-10 टुकड़ों में एक साफ रेजर ब्लेड का उपयोग करके धीरे-धीरे विभाजित करें।
- एक ही संदंश का उपयोग कर O.C T. से भरा एक क्रायोमोल्ड में टुकड़े प्लेस, और उन्हें खड़ी एक साफ सुई का उपयोग कर संरेखित करें। मोल्ड को एक उथले ट्रे में रखें जिसमें तरल नाइट्रोजन के साथ 2-मिथाइलबुटेन प्रीकूल्ड होता है, और फिर आरएनए के क्षरण से बचने के लिए रीढ़ की हड्डी के टुकड़ों को तेजी से फ्रीज करने के लिए ट्रे को तरल नाइट्रोजन स्नान में डाल दें।
- सेक्शनिंग से पहले 6 महीने तक के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर OCT-एम्बेडेड ब्लॉक स्टोर करें। आरएनए अखंडता को बनाए रखने के लिए ठंड के माध्यम से कॉर्ड को पुनः प्राप्त करने से प्रक्रिया 5 मिनट के भीतर की जानी चाहिए।
- क्रायोसेक्शन ओ.C.टी.-एम्बेडेड ब्लॉक -20 डिग्री सेल्सियस पर 20 माइक्रोम स्लाइस का उत्पादन करने के लिए क्रायोस्टेट के साथ, प्रत्येक में 9-10 रीढ़ की हड्डी के पार वर्गों, RNase-मुक्त पेन-झिल्ली 2 माइक्रोन स्लाइड पर शुरू में कमरे के तापमान पर रखा गया ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि अनुभाग स्लाइड का पालन करते हैं। तुरंत क्रायोस्टेट के अंदर -20 डिग्री सेल्सियस सतह पर अनुभाग को फिर से फ्रीज करें। स्लाइड्स में -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें जब तक इस्तेमाल नहीं किया जाता।
3. रीढ़ की हड्डी वर्गों के धुंधला (चित्रा 1A)
- एक साफ रैक पर, छह 50 मिलीलीटर शंकु नलियों की व्यवस्था करें। उन सभी को 25-30 मिलीलीटर RNase-मुक्त 70% इथेनॉल के साथ भरें, ताकि स्लाइड डूबने पर सभी वर्गों को स्लाइड पर कवर करने के लिए गहराई पर्याप्त हो। पहले वर्णित 1% नीला बी समाधान के 30-35 मिलीलीटर बनाओ और धोने या धुंधला के दौरान समाधान बदलने के बीच समय को कम करने के लिए इसे एक ही रैक पर रखें। अतिरिक्त समाधान जल्दी नाली के लिए रैक के सामने तीन या चार प्रयोगशाला पोंछे रखें।
- आगे की स्लाइड्स में देखें -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से सूखी बर्फ पर। एक स्लाइड को दस्ताने हथेली पर रखकर गल लें। स्लाइड पर नमी और संघनन के अधिकांश इसे पोंछते हुए एक प्रयोगशाला पोंछ के साथ हटा दें, सावधान किया जा रहा है वर्गों को छूने के लिए नहीं । पूरी तरह से सूखने के लिए 30-40 सेकंड के लिए पेट्री डिश में ताजा सिलिका जेल डेसिकेंट पर स्लाइड रखें। यदि प्रयोगशाला आर्द्रता अधिक है, तो वैक्यूम डेसिकेटर में संक्षिप्त उपचार का उपयोग स्लाइड को अधिक तेज़ी से सुखाने के लिए किया जा सकता है।
- धोना और धुंधला करना।
- सूखे स्लाइड को RNase-मुक्त 70% इथेनॉल की पहली ट्यूब में डुबोएं। 30 सेकंड के लिए स्लाइड सोख, तो स्लाइड धोने के लिए यह सूई और 45-60 सेकंड के लिए नीचे द्वारा अक्टूबर को हटाने के लिए । स्लाइड को घोल से बाहर निकालें और लैब वाइप्स पर अतिरिक्त तरल को छान लें। 70% इथेनॉल की दूसरी ट्यूब में स्लाइड को डुबोकर इसी प्रक्रिया को दोहराएं। यदि रीढ़ की हड्डी के वर्गों के आसपास अक्टूबर पूरी तरह से नहीं चला गया है, तीसरी ट्यूब में धोने दोहराएं ।
- अतिरिक्त तरल को निकालने के बाद, 30-45 सेकंड के लिए 70% RNase-मुक्त इथेनॉल में 1% नीला बी समाधान में स्लाइड को जलमग्न करें। एक प्रयोगशाला पोंछ पर अतिरिक्त नीला बी नाली; इस बिंदु पर, पूरी स्लाइड नीली हो जाएगी।
- 70% इथेनॉल की अगली ट्यूब में स्लाइड जलमग्न करें, और अतिरिक्त डाई को हटाने और विशिष्ट मोटर न्यूरॉन धुंधला दृश्य बनाने के लिए जल्दी से 3-4x डुबकी। यदि अनुभाग बहुत गहरे रंग के दिखते हैं, तो 70% इथेनॉल की ताजा ट्यूब में डिटेनिंग चरण दोहराएं। यदि धुंधला बहुत हल्का लगता है, तो स्लाइड को एक और 30 सेकंड के लिए नीला बी समाधान पर वापस करें और डिटेनिंग दोहराएं। अतिरिक्त इथेनॉल को मिटा दें और हवा ~ 40 सेकंड के लिए स्लाइड को सूखा दें जब तक कि सभी तरल न चले जाएं। ग्रे मैटर हल्का नीला होगा, जबकि मोटर न्यूरॉन्स गहरे नीले रंग के दाग होंगे, जो आसानी से दिखाई देते हैं। विच्छेदन तुरंत शुरू करें।
4. लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन (एलएमडी) (चित्रा 1B)
- माइक्रोस्कोप चालू करें और नमूना संग्रह के लिए 0.6 मिलीलीटर माइक्रोफ्यूज ट्यूब की टोपी संलग्न करने के लिए ट्यूब धारक को उतार दें। 0.6 मिली माइक्रोफ्यूज ट्यूब की टोपी में 30 माइक्रोल ग्ओनिडीन थिओसाइनेट लाइसिस बफर डालें। पिपेट टिप का उपयोग करके समाधान को फैलाकर टोपी की सतह को तरल के साथ कवर करें। इस तरह, सभी एकत्र न्यूरॉन्स को घुलनशील समाधान में भंग कर दिया जाएगा क्योंकि वे विच्छेदित हैं। छेद और माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर के साथ उद्देश्य के साथ टोपी संरेखित करें। लेजर कैप्चर शुरू करने तक कैप को कवर पोजीशन में रखें।
- हवा को सूखे स्लाइड को एलएमडी माइक्रोस्कोप के स्टेज पर उल्टा रखें, ताकि पेन स्लाइड की झिल्ली नीचे की ओर आ जाए। वर्गों के साथ झिल्ली छेद का सामना करना चाहिए, जिसके नीचे संग्रह ट्यूब है।
- स्लाइड तैयार करने शुरू करने से पहले लेजर 10 मिनट चालू करें। 5X उद्देश्य के साथ रीढ़ की हड्डी के खंड पर ध्यान केंद्रित करें। विच्छेदन के लिए 20X उद्देश्य के लिए ले जाएँ।
- प्रकाश कलम के साथ एक "डमी" क्षेत्र चिह्नित करें और लेजर को इसे इकट्ठा किए बिना इसे काटने की अनुमति दें। यह पेन झिल्ली को आराम देता है और लगातार कई क्षेत्रों को चिह्नित और काटना संभव बनाता है।
- वेंट्रल हॉर्न क्षेत्र में मोटर न्यूरॉन्स को फिर से केंद्रित करें और पहचानें। ये न्यूरॉन्स अपने स्थान, उनके पिरामिड आकृति विज्ञान, उनके बड़े आकार, और नीला बी(चित्रा 2)के साथ उनके गहरे नीले रंग के धुंधला द्वारा पहचानने योग्य हैं ।
- प्रकाश कलम का उपयोग करना, ड्राइंग उपकरण का चयन करें और मोटर न्यूरॉन्स के किनारे के साथ निशान, एक पूरी रूपरेखा बना रही है । मोटर न्यूरॉन के अलावा अन्य कोशिकाओं से प्रदूषण से बचने के लिए मोटर न्यूरॉन के लिए संभव के रूप में बंद के रूप में रूपरेखा बनाने की कोशिश करो। (लेजर कट-लाइन कितनी चौड़ी है, यह देखने के लिए पहले से कुछ अनुभागों का परीक्षण करें और आवश्यक रूप से निकासी को समायोजित करें। काटने से पहले कई कोशिकाओं को चिह्नित करें; सॉफ्टवेयर पदों को याद रखेगा।
- कैप पोजीशन पर क्लिक करके कटिंग पोजीशन के नीचे कैप लाएं। लेजर के साथ मोटर न्यूरॉन विच्छेदन शुरू करने के लिए स्टार्ट बटन पर क्लिक करें। एक माइक्रोफ्यूज ट्यूब की टोपी में एक स्लाइड पर सभी वर्गों से सभी मोटर न्यूरॉन्स ले लीजिए।
- कलेक्शन पूरा होने के बाद ट्रे उतारकर होल्डर से माइक्रोफ्यूज ट्यूब निकाल लें और धीरे-धीरे ट्यूब को उखाड़ दें। पूरी तरह से ऊपर और नीचे समाधान पाइपिंग द्वारा बफर में मोटर न्यूरॉन्स भंग। 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 14,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा ट्यूब के शरीर में समाधान ले जाएँ। सैंपल को तुरंत सूखी बर्फ में फ्रीज कर -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। इस प्रक्रिया, मोटर न्यूरॉन संग्रह के माध्यम से धुंधला स्लाइड से, आरएनए गिरावट को कम करने के लिए एक स्लाइड के लिए 30 मिनट के भीतर किया जाना चाहिए ।
5. मोटर न्यूरॉन्स से आरएनए तैयारी
एक जानवर से एकत्र न्यूरॉन्स के सभी गल और आरएनए निकालने के लिए उन्हें एक साथ पूल। नमूने उन में मोटर न्यूरॉन्स (नीला बी के साथ दाग) की संख्या के आधार पर पीला नीला लग सकता है । एलएमडी ऊतक के लिए प्रदान किए गए प्रोटोकॉल के अनुसार एक उपयुक्त किट का उपयोग करके आरएनए निकालें, न्यूनतम मात्रा में संभव है। नमूने की मात्रा और अखंडता की जांच करने के लिए 1 माइक्रोन लें। सूखी बर्फ पर शेष आरएनए को तेजी से फ्रीज करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
6. आरएनए गुणवत्ता और मात्रा का निर्धारण
निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस माइक्रोफ्लुइडिक्स चिप पर 1 माइक्रोन सैंपल के साथ आरएनए गुणवत्ता निर्धारित करें। 8.5 से ऊपर आरएनए इंटीग्रिटी नंबर (आरआईआर) के साथ कुल आरएनए तैयारी का उपयोग आरएनए-एसईक्यू और क्यूआरटी-पीसीआर के लिए किया जा सकता है। डेटा आउटपुट में आमतौर पर नमूने की अनुमानित एकाग्रता भी शामिल है।
Representative Results
ऊपर उल्लिखित प्रोटोकॉल और चित्रा 1 में 3000-4000 रीढ़ की हड्डी मोटर न्यूरॉन सेल निकायों से >8.5 की एक RIN के साथ कुल आरएनए के 50 एनजी या अधिक उत्पादन करना चाहिए के बारे में 20 कलम स्लाइड पर 9-10 20 माइक्रोम स्लाइस से विच्छेदन। क्योंकि स्लाइड की यह संख्या माउस रीढ़ की हड्डी के ओ.C.टी.-एम्बेडेड ब्लॉक के 10% से भी कम का प्रतिनिधित्व करती है, इसलिए ब्लॉक पर लौटना संभव है, जिसे -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया है, और आरएनए तैयारी के एक और दौर से गुजरने के लिए अधिक स्लाइस काटें। यदि विश्लेषण के लिए आरएनए की बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है, तो एक समय में केवल स्लाइड(उदाहरण के लिए 20) की संख्या बनाना बेहतर होता है जिसे कुछ दिनों में विच्छेदन और आरएनए तैयारी के माध्यम से संसाधित किया जा सकता है, फिर दूसरे दौर के लिए और अधिक स्लाइड बनाएं और उत्पादों को जोड़ें। एक बुरे के साथ एक अच्छा एक संयोजन से बचने के लिए पहले प्रत्येक तैयारी के RIN की जांच करने के लिए सुनिश्चित करें । आरएनए-एसईक्यू विधियां अधिक संवेदनशील होती जा रही हैं और नई पीसीआर प्रौद्योगिकियां वर्तमान लोगों की तुलना में उच्च संवेदनशीलता का वादा कर रही हैं । इस प्रकार, कम न्यूरॉन सेल निकायों से कम आरएनए की आवश्यकता होगी, जिससे अधिक अनुक्रमण गहराई और दिलचस्प हिट के अधिक व्यापक सत्यापन की अनुमति मिलेगी। दूसरी ओर, क्यूआरटी-पीसीआर विश्लेषण और सत्यापन4 के लिए MIQE सिफारिशों का पूर्ण पालन कम भरपूर आरएनए के लिए आवश्यक नियंत्रण प्रतिक्रियाओं के लिए अनुमति देने के लिए बड़ी मात्रा में आवश्यकता हो सकती है।
चित्रा 2 नीला बी धुंधला और विच्छेदन के बाद एक रीढ़ की हड्डी वेंट्रल सींग अनुभाग के एक हिस्से की छवियों की एक विशिष्ट श्रृंखला से पता चलता है । पैनल ए में, बड़े, गहरे दाग वाले सेल निकाय मोटर न्यूरॉन्स हैं, जो एंटी-चैट एंटीबॉडी स्टेनिंग2द्वारा पुष्टि किए जाते हैं, और आसानी से छोटे पड़ोसी कोशिकाओं से अलग होते हैं। पैनल बी प्रकाश कलम के साथ उल्लिखित और माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर द्वारा गिने गए व्यक्तिगत सेल निकायों के साथ एक ही क्षेत्र दिखाता है। रूपरेखा बारीकी से सेल निकायों के हाशिए का पालन करें, लेजर की काटने की चौड़ाई के लिए एक छोटे से भत्ते के साथ । इस अंतर को मोटर न्यूरॉन साइटोसोल के नुकसान से बचने के दौरान बाहरी सामग्री के समावेश को कम करने के लिए प्रत्येक लेजर पावर सेटिंग के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए। पैनल सी और डी लेजर कटौती के बाद अनुभाग दिखाने के लिए और व्यक्तिगत सेल निकायों संग्रह टोपी में गिरा दिया है । ध्यान दें कि काटने मार्जिन वास्तव में पैनल सी में प्रकाश कलम रूपरेखा का पालन नहीं करता है, लेकिन काफी हद तक इसके बाहर रहता है । यह अनियमितता पैनल डी में स्पष्ट है, जैसा कि प्रत्येक कट के आसपास काला क्षेत्र है, जो लेजर के कारण ऊतक को गर्मी की क्षति को दर्शाता है। इस वजह से, यदि दो सेल निकाय एक दूसरे के बहुत करीब हैं, तो उन्हें एक कट के लिए तैयार करना बेहतर है, बजाय उन्हें अलग से काटने की कोशिश करने और निकट संपर्क के अपने क्षेत्र में गर्मी के नुकसान के लिए कुछ आरएनए खोने के बजाय।
चित्रा 3 एलएमडी द्वारा एकत्र ~ 4,000 माउस मोटर न्यूरॉन सेल निकायों से तैयार आरएनए के नमूने के आरएनए अखंडता के इलेक्ट्रोफोरेटिक विश्लेषण के विशिष्ट परिणाम दिखाता है। ऊपरी पैनल कुल आरएनए के 1 माइक्रोन द्वारा उत्पादित इलेक्ट्रोफेरोग्राम है; दाईं ओर इनसेट जेल की एक छवि है। दोनों में, प्रमुख राइबोसोमल आरएनए चोटियों पर ध्यान दें। निचला पैनल आरएनए आकार मानकों वाले लेन का इलेक्ट्रोफेरोग्राम है। विश्लेषण सॉफ्टवेयर 4.9 एनजी/ विश्लेषण के बाद इस समाधान के कुल 13 माइक्रोन उपलब्ध थे, जो ट्रांसक्रिप्ट राशि के डाउनस्ट्रीम क्यूआरटी-पीसीआर सत्यापन के लिए आरएनए के 64 एनजी प्रदान करते थे। मामूली प्रचुर मात्रा में प्रतिलिपियों के एक विशिष्ट क्यूआरटी-पीसीआर विश्लेषण के लिए, कुल आरएनए का 0.15-0.20 एनजी सटीक क्वांटिटेशन2का उत्पादन करने के लिए पर्याप्त है, इसलिए इस तैयारी से उपलब्ध आरएनए की मात्रा कई प्राइमर सेट के साथ कई प्रतिलिपियों को मान्य करने के लिए पर्याप्त है, जैसा कि अनुशंसित4। बेशक, इनपुट आरएनए की बड़ी मात्रा का उपयोग दुर्लभ प्रतिलिपियों के सत्यापन की अनुमति देने के लिए किया जा सकता है। यह राशि पुस्तकालय तैयार करने और अगली पीढ़ी के आरएनए-सेक्यू की अनुमति देने के लिए भी पर्याप्त से अधिक है।
चित्रा 1. रीढ़ की हड्डी के टुकड़े उत्पादन और लेजर का अवलोकन रीढ़ की हड्डी मोटर न्यूरॉन सेल निकायों के माइक्रोडिसेक्शन पर कब्जा। A)स्लाइस उत्पादन और धुंधला में प्रमुख कदम। B)रीढ़ की हड्डी के खंड और लेजर विच्छेदन का कार्टून दृश्य। बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2। नीला बी दाग मोटर न्यूरॉन सेल निकायों के एक लेजर विच्छेदन की छवियों से पहले और बाद में । ए)एक दागदार खंड के वेंट्रल सींग का एक हिस्सा। चार बड़े, गहरे दाग कोशिकाओं पर ध्यान दें। कुछ हल्के दाग और कुछ हद तक छोटी कोशिकाएं भी हैं, जो मोटर न्यूरॉन्स नहीं हैं (एंटी-चैट एंटीबॉडी स्टेनिंग द्वारा पुष्टि की गई; नहीं दिखाया गया है, लेकिन बंदोपाध्याय2देखें) और जिन्हें विच्छेदन के लिए नहीं चुना जाएगा। कई छोटे, काले धब्बे शायद न्यूरोनल प्रक्रियाएं (डेंड्राइट्स और एक्सॉन) हैं, लेकिन इसकी पुष्टि नहीं की गई है। ख)प्रकाश कलम के साथ उल्लिखित चार सेल निकाय। ध्यान दें कि रूपरेखा बारीकी से कोशिकाओं के हाशिए का पालन करें, उन दोनों के बीच एक ंयूनतम दूरी के साथ । यह अंतर प्रत्येक माइक्रोस्कोप और लेजर के लिए अनुभवजन्य रूप से स्थापित किया जाना चाहिए। सॉफ्टवेयर व्यक्तिगत न्यूरॉन्स, जो कितने एकत्र किया गया है की ट्रैक रखने को सरल संख्या । सी और डी)लेजर कट जाने के बाद और सेल निकायों वाले टुकड़े संग्रह टोपी में गिर गए हैं। ध्यान दें कि पीछे छोड़ा गया छेद रूपरेखा से कुछ बड़ा है और अनियमित है। यह ऊतक की स्थानीय संरचना के आधार पर लेजर बीम की चौड़ाई और इसकी थोड़ी चर काटने की दक्षता को दर्शाता है। इसके अलावा स्पष्ट लेजर की वजह से स्थानीय हीटिंग क्षति के कारण प्रत्येक छेद आसपास के अंधेरे ऊतकों की रिम है ।
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चित्र 3। एलएमडी नमूनों से तैयार आरएनए की अखंडता का इलेक्ट्रोफोरेटिक विश्लेषण। A)उपरोक्त प्रोटोकॉल द्वारा ~ 4,000 मोटर न्यूरॉन सेल निकायों से तैयार आरएनए के 1 माइक्रोल एलिकोट का विश्लेषण माइक्रोकैपिलरी इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा माइक्रोफ्लुइडिक्स चिप पर किया गया था। इलेक्ट्रोफेरोग्राम दिखाया गया है, जिसमें प्रमुख राइबोसोमल आरएनए चोटियां हैं। दाईं ओर जेल की एक छवि है। B)आकार मानकों का इलेक्ट्रोफेरोग्राम दिखाया गया है, सही करने के लिए इसी जेल लेन के साथ । इंस्ट्रूमेंट सॉफ्टवेयर ने इस नमूने के लिए 9.8 की रिन की गणना की और 4.9 एनजी/माइक्रोन की एकाग्रता की गणना की। बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
Discussion
रीढ़ की हड्डी के स्लाइस के लेजर माइक्रोडिसेक्शन द्वारा कुल आरएनए के उत्पादन के लिए इस प्रोटोकॉल की सफलता का सबसे महत्वपूर्ण उपाय आरआईआईएन मूल्य5है । उच्च यूकेरियोट्स से आरएनए नमूनों के लिए, 8.5 से ऊपर के मान नियमित रूप से उच्च गुणवत्ता वाले अनुक्रमण और क्यूआरटी-पीसीआर डेटा प्राप्त करते हैं। यदि उपज कम है लेकिन गुणवत्ता अधिक है, तो तैयारी दोहराएं। यदि अखंडता कम है (यहां तक कि 7.5-8), हालांकि, समस्या के स्रोत को ढूंढना और फिर से प्रयास करना बेहतर है। ऐसे कई कदम हैं जहां कुछ गलत हो सकता है, लेकिन वास्तव में समस्या के केवल दो स्रोत - अंतर्जात RNase संदूषण या बहिर्जात RNase संदूषण। पहले अभ्यास द्वारा संबोधित किया जा सकता है, ताकि माउस के बलिदान से उसके O.C.T-एम्बेडेड कॉर्ड को ठंडा करने के लिए समय को कम किया जा सके। प्रोटोकॉल में दूसरा बिंदु जहां अंतर्जात RNase एक खराब परिणाम में योगदान कर सकते है स्लाइस की तैयारी के दौरान है । प्रत्येक टुकड़ा एक कमरे के तापमान कलम स्लाइड जल्दी से पालन करना चाहिए, लेकिन यह पिघल जाएगा (O.C.T स्पष्ट हो जाता है) । जितनी तेजी से स्लाइस को बेहतर रीफ्रोज किया जा सकता है। हमारे द्वारा उपयोग किए जाने वाले क्रायोस्टेट में कक्ष के अंदर सपाट सतहें होती हैं जो -20 डिग्री सेल्सियस पर होती हैं, जिसका उपयोग हम स्लाइस को जल्दी से फिर से फ्रीज करने के लिए करते हैं। इस्तेमाल किया क्रायोस्टेट में एक समान स्थान का पता लगाएं और सुनिश्चित करें कि टुकड़ा फिर से तेजी से अपारदर्शी हो जाता है ।
बहिर्जात RNase के स्रोतों को ट्रैक करना मुश्किल हो सकता है, क्योंकि बहुत सारी संभावनाएं हैं। केवल अभिकर् चर का उपयोग किया जाता है जो स्पष्ट रूप से RNase-मुक्त नहीं हैं ओ.C टी और नीला बी । यदि नीला बी संतोषजनक प्रदर्शन किया है पहले, O.C T. की एक ताजा बोतल की कोशिश करो, हालांकि इस अभिवात एक समस्या कभी नहीं किया गया है । RNase मुक्त अभिकर्दक भी प्रतिस्थापित किया जा सकता है, यहां तक कि एक अलग आपूर्तिकर्ता से । एक बहुत अधिक संभावना स्रोत अन्वेषक है । कार्य क्षेत्र की पूरी तरह से सफाई के अलावा, अक्सर एक और प्रयोगशाला सदस्य का पालन करना और प्रक्रिया में सभी चरणों का पालन करना उपयोगी होता है। यहां तक कि अगर यह कोई है जो नियमित रूप से इस प्रक्रिया को नहीं करता है, आंखों का एक ताजा सेट संदूषण का एक अंयथा किसी का ध्यान नहीं स्रोत उठा सकते हैं ।
अन्य रीढ़ की हड्डी की कोशिकाओं से आरएनए ठीक करने के लिए इस प्रोटोकॉल का विस्तार, अन्य प्रजातियों से रीढ़ की हड्डी की कोशिकाओं से, या अन्य अंगों में विशिष्ट कोशिका प्रकार से, कई ब्याज की कोशिकाओं की स्पष्ट पहचान प्राप्त करने में निर्देशित क्षेत्रों में संशोधनों की आवश्यकता होगी, जबकि निराकरण, या कम से कम, अंतर्जात RNase के प्रभाव को कम करने। यहां प्रोटोकॉल में, तेजी से हटाने और कॉर्ड की ठंड, 70% इथेनॉल में नीला बी धुंधला के साथ मिलकर, आरएनए क्षरण और मोटर न्यूरॉन सेल निकायों की आसान पहचान दोनों को कम करने की अनुमति दी। नीला बी न्यूरॉन्स के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित हिस्टोकेमिकल दाग है जो आरएनए3 को बांधने के लिए प्रकट होता है और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग6के रोगियों से मस्तिष्क के ऊतकों के ऑटोप्सी नमूनों में न्यूरॉन्स की आरएनए सामग्री का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। विशेष रूप से, नीला बी धुंधला या तो शुद्ध आरएनए की अखंडता या उसके रिवर्स लिखित और विश्लेषण करने की क्षमता को प्रभावित नहीं किया । अन्य रंगों, जैसे क्रेसिलवायलेट 7 और टोल्यूडीन ब्लू8 का उपयोग समान एलएमडी प्रोटोकॉल में किया गया है। सेल निकायों को सीधे ग्वानिडीन थिओसाइनेट समाधान में इकट्ठा करना क्योंकि उन्हें विच्छेदित किया गया था, अंतिम चरण प्रदान किया गया था जिसके परिणामस्वरूप बरकरार आरएनए की नियमित वसूली हुई थी।
इसी तरह के दृष्टिकोण अन्य कोशिकाओं और अंगों के लिए अनुरूप किया जा सकता है, यह पहचानने कि ब्याज की कोशिकाओं की पहचान करते हुए कम या, अधिमानतः, अंतर्जात RNases द्वारा आरएनए क्षरण को रोकने के सफल विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण आवश्यकता है । जिन ऊतकों में आरएनएई के उच्च स्तर होते हैं, जैसे अग्न्याशय, तेजी से हैंडलिंग और कम तापमान को β-कोशिकाओं से आरएनए की वसूली की अनुमति देने के लिए संयुक्त किया गया है, जो दृश्य9के लिए उनके प्राकृतिक ऑटोफ्लोरेसेंस का लाभ उठाते हुए। पहचान के लिए एंटीबॉडी धुंधला का उपयोग कर प्रक्रियाओं को भी10की सूचना दी गई है, लेकिन हमारे हाथों में पूरी तरह से सफल नहीं किया गया है । अंत में, कई माउस मॉडल उपलब्ध हैं जो ब्याज की कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन(यानी जीएफपी, वाईएफपी, आरएफपी) व्यक्त करते हैं, जिसका उपयोग एलएमडी माइक्रोस्कोप पर ऊतक अनुभागों में उनकी पहचान करने के लिए किया जा सकता है। वास्तव में, माउस उपभेदों हम इस प्रोटोकॉल के साथ विश्लेषण किया है SOD1 और YFP11के बीच एक संलयन प्रोटीन व्यक्त करते हैं, और उनके रीढ़ की हड्डी मोटर न्यूरॉन्स अत्यधिक फ्लोरोसेंट हैं । हालांकि, हम इथेनॉल वॉश और/या निर्जलीकरण की स्थिति का एक सेट खोजने में सक्षम नहीं थे जो एक साथ ओ.C.टी. को हटा देंगे, RNase गतिविधि को रोकते हैं, और मोटर न्यूरॉन्स के दृश्य और एलएमडी द्वारा उनकी वसूली की अनुमति देने के लिए पर्याप्त वाईएफपी फ्लोरेसेंस को लगातार बनाए रखते हैं। शायद एक नया फ्लोरोसेंट प्रोटीन या उपलब्ध लोगों का एक संस्करण जो कार्बनिक सॉल्वैंट्स में फ्लोरेसेंस को बनाए रखता है, इस सीमा को दूर करने के लिए पाया जा सकता है।
Disclosures
लेखकों की घोषणा वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।
Acknowledgments
लेखकों को सहायक चर्चा के लिए जॉर्ज Farr और हॉर्विच लैब के सदस्यों का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस काम को हावर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट ने सपोर्ट किया ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Webster Veterinary | 26637041101 | Any source approved by the institutional veterinary service |
| Dissection tools (scissors, forceps, etc.) | Any convenient source of high-quality dissection instruments | ||
| Cryostat | Leica Microsystem | CM3050S | Other cryostats should be suitable |
| LMD6000 B | Leica Microsystem | Other LMD systems have not been tested | |
| RNase-free PEN-membrane 2 μm slides | Leica Microsystem | 11505189 | Other slide types have been tested and do not perform well |
| RNeasy Micro kit (50) | Qiagen | 74004 | Any kit that uses guanidine thiocyanate lysis buffer and has been tested for recovering small quantities of RNA can be used |
| Agilent 2100 BioAnalyzer | Agilent Technologies | G2939A | |
| Azure B Certified | MP Biomedicals | 190520 | Critical! Product from any source has to be tested before use for its ability to maintain RNA integrity |
| PBS | Sigma Life Science | D8537 | Any reliable source of RNase-free PBS |
| RNA Ethanol 70% (made with DEPC treated water) | American Bioanalytical | AB04010-00500 | Any reliable source, can be lab-made |
| Water, RNase-free, Endotoxin tested (treated with DEPC to eliminate RNase) | American Bioanalytical | AB02128-00500 | Any reliable source, can be lab-made |
| RNase AWAY | Invitrogen Life Technologies | 10328-011 | Other similar RNase removal reagents, such as RNaseZAP (also from Invitrogen) can be used |
| 2-Methylbutane | Electron Microscopy Sciences | 78-78-4 | Any source |
| Maxymum Recovery microfuge tubes (0.6 and 1.5 ml) and pipette tips | Axygen | 311-03-051 & 311-09-051 | Ultra-low retention, RNase free tubes and tips; test other manufacturer's products before using |
| O.C.T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryomold Intermediate Size | Tissue-Tek | 4566 | |
| Lab wipes (Kimwipes) | KIMTECH | 34155 |
References
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