Summary
وقد تم إعداد عالية الجودة مجموع الحمض النووي الريبي من أجسام الخلايا من الخلايا العصبية الحركية الحبل الشوكي الماوس عن طريق الليزر التقاط microdissection بعد تلطيخ أقسام الحبل الشوكي مع أزور B في الإيثانول 70٪. يتم استرداد ما يكفي من الحمض النووي الريبي (~ 40-60 نانوغرام) من الخلايا العصبية الحركية 3000-4000 للسماح تحليل الحمض النووي الريبي المصب من قبل RNA-seq وqRT-PCR.
Abstract
يعد إعداد الحمض النووي الريبي عالي الجودة من الخلايا ذات الأهمية أمرا حاسما للتحليل الدقيق والهادف للاختلافات النسخية بين أنواع الخلايا أو بين نفس نوع الخلية في الصحة والمرض أو بعد العلاجات الدوائية. في الحبل الشوكي ، وهذا الإعداد من الخلايا العصبية الحركية ، والهدف من الاهتمام في العديد من الأمراض العصبية والعصبية ، ومما يعقد من حقيقة أن الخلايا العصبية الحركية تمثل <10 ٪ من مجموع سكان الخلية. تم تطوير الالتصاط الدقيق لالتقاط الليزر (LMD) لمعالجة هذه المشكلة. هنا، ونحن نصف بروتوكول لاسترداد بسرعة، وتجميد، وقسم الحبل الشوكي الماوس لتجنب تلف الحمض النووي الريبي عن طريق RNases الذاتية والخارجية، تليها تلطيخ مع أزور B في الإيثانول 70٪ لتحديد الخلايا العصبية الحركية مع الحفاظ على RNase الذاتية تثبيط. ثم يتم استخدام LMD لالتقاط الخلايا العصبية الملطخة مباشرة في العازلة تحلل ثيوسيانات جوانيدين، والحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي. وتستخدم التقنيات القياسية لاستعادة الحمض النووي الريبي الكلي وقياس سلامته. ويمكن بعد ذلك استخدام هذه المواد لتحليل المصب من النصوص من قبل RNA-seq وqRT-PCR.
Introduction
في أنسجة الثدييات المكونة من أنواع خلايا مختلفة متعددة ، أتاح ظهور أجهزة الالتقاط الدقيق لالتقاط الليزر (LMD) إمكانية اختيار نوع معين من الخلايا للتحليل على مستوى الحمض النووي الريبي أو البروتين. وفي الوقت الحاضر، تتيح تقنيات التضخيم والتسلسل من الجيل التالي استخدام مجموعة من إجمالي الحمض النووي الريبي من بضعة آلاف من الخلايا للحصول على جرد شامل نسبيا للنسخة، بما في ذلك تقييم المستويات النسبية للرنانات المضادة للريبي وتحديد مختلف الأشكال المقسمة. وحتى الآن، فإن تحليلات البروتيوميات لبضعة آلاف من الخلايا سوف تصل إلى أسفل من خلال الأنواع الأكثر وفرة فقط. على سبيل المثال، حددنا 1000 < من البروتينات الأكثر وفرة من 3000-4000 جسم خلايا الخلايا العصبية الحركية (غير مبين)، وقد أبلغ تشو وزملاء العمل مؤخرا تحديد 2665 البروتينات من ~ 15،000 الخلايا السرطانية1. ومع ذلك، ومع استمرار التطورات في قياس الطيف الكتلي، من المرجح أن تمتد هذه التحليلات إلى عمق أكبر بكثير.
هنا، نقدم بروتوكول محدد يستخدم لLMD من أجسام خلايا الخلايا العصبية الحركية من الحبل الشوكي للفئران، تليها إعداد الحمض النووي الريبي. وقد استخدم هذا البروتوكول في سياق مقارنة الحمض النووي الريبي من الخلايا العصبية الحركية من أول أكسيد فائق المتحولة وراثيا presymptomatic dismutase (SOD)1 التصلب الجانبي الضموري (ALS) الفئران مع الحمض النووي الريبي أعدت من سلالة SOD1 المعدلة وراثيا من نوع البرية من قبل كل من الحمض النووي الريبي-seq وqRT-PCR التحقق من صحة2. وتجدر الإشارة إلى أن الخلايا العصبية الحركية ، في القرن الأمامي للمادة الرمادية في الحبل الشوكي ، تشكل <10٪ من إجمالي عدد الخلايا ، وتحيط بها بحر من الخلايا الفلكية ، وعلى هذا النحو ، لا يمكن تفكيك ملفها الشخصي النسخي بسهولة من دراسات الحبل بأكمله. وبالتالي فإن نهج التقاط الليزر مثالي لتحليل تعبير الحمض النووي الريبي في هذه الخلايا ، مع الحفاظ على علم وظائف الأعضاء عن طريق استئصال وتجميد الحبل بسرعة بعد التغلغل الملحي القصير داخل القلب. سوماتا الخلايا العصبية الحركية هي كبيرة وبالتالي يمكن الكشف عنها بسهولة, هنا باستخدام صبغة لديها تقارب قوي للخلايا العصبية3. وبالإضافة إلى ذلك، مع هذا الحجم، توفر هذه الخلايا كمية كبيرة نسبيا من الحمض النووي الريبي لكل خلية تم التقاطها. الإجراء المستخدم، كما هو مفصل أدناه، يمكن تعديلها بسهولة للحصول على أنواع الخلايا العصبية الأخرى، فضلا عن أنواع الخلايا الأخرى المحتملة، التي تم تحديدها على وجه التحديد إما عن طريق تقنيات صبغ تلطيخ أو عن طريق تلطيخ الأجسام المضادة.
Protocol
تم تنفيذ الإجراءات الموصوفة هنا للتخدير والقتل الرحيم والتشويش القلبي للفئران بموجب بروتوكول وافقت عليه اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة ييل.
1. إعداد الآلات والحلول الخالية من RNase
- RNase هو ملوث شائع لجميع أسطح المختبرات ، بما في ذلك قمم مقاعد البدلاء ، micropipettes ، والمحقق.
- تغيير القفازات في كثير من الأحيان أو مسح بانتظام مع حل إزالة التلوث RNAse.
- يمكن جعل أدوات تشريح الفولاذ المقاوم للصدأ والأواني الزجاجية خالية من RNase عن طريق التدفئة عند >200 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة أو أكثر. ملاحظة: التعقيم بالبخار لا يدمر RNase. بدلا من ذلك، مسح مع محلول إزالة التلوث RNase، ثم مع RNase خالية من الإيثانول 70٪ والهواء الجاف.
- مسح قمم مقاعد البدلاء، أسطح المختبر الأخرى وmicropipettors مع RNase حل إزالة التلوث، ثم مع الإيثانول RNase خالية 70٪. تعيين مقعد مختبر محدد أو منطقة عمل لاسترداد الحمض النووي الريبي وتحليله. ملاحظة: قم بإزالة محاقن البقشيش قبل مسح مهاوي المواسير واتركها، إن أمكن.
- استخدام أنابيب، أنابيب الطرد المركزي الدقيق، ماصة، ونصائح micropipette التي يتم اعتمادها من قبل الشركة المصنعة لتكون خالية من RNase. ينصح باستخدام نصائح ملزمة منخفضة جدا وmicrotubes. إذا كان ذلك ممكنا، استخدم صناديق أو أكياس من هذه المكونات مفتوحة حديثا والاحتفاظ بها منفصلة عن العرض مختبر عامة.
- الحصول على حلول خالية من RNase [دولبيكو الكالسيوم والمغنيسيوم خالية من برنامج تلفزيوني (PBS)، الإيثانول، RNase خالية من 70٪ الإيثانول] من مصادر تجارية. استخدام زجاجات فتحت حديثا لكل تجربة.
- مصدر صبغة أزور B أمر بالغ الأهمية للتعافي الناجح من الحمض النووي الريبي سليمة. اختبار كل دفعة من الصبغة قبل ارتكاب عينات ثمينة لتلطيخ وجمع. جمع بضعة آلاف من الخلايا العصبية من غير تجريبي، وإعداد الحمض النووي الريبي، وتحديد سلامة الحمض النووي الريبي على النحو المبين أدناه للعثور على واحد أن تنتج باستمرار أرقام رين فوق 8.5.
- حل أزور B صبغ (1٪، wt/vol) في RNase خالية من الإيثانول 70٪، وعادة 0.3 غرام في الإيثانول 30 مل في أنبوب الطرد المركزي 50 مل. تخلط جيدا على الروك في RT بين عشية وضحاها أو حتى تذوب جميع الجسيمات. يمكن استخدام أنبوب واحد من هذا الحل لتلطيخ شرائح متعددة دون التأثير على كثافة التلطيخ.
- كإجراء وقائي، استخدم أنبوب مختلف من وصمة عار لكل تكرار البيولوجية.
- استخدم التبريد وO.C.T. لتضمين أقسام الحبل السري دون مزيد من العلاج.
- الحفاظ على cryostat في -20 إلى -24 درجة مئوية. بعد تقسيم، ضع الشرائح في ثلاجة -80 درجة مئوية حتى يتم إعداد عدد كاف. بدء إعداد الحمض النووي الريبي في أقرب وقت ممكن بعد أن تم إجراء الشرائح. للتخزين على المدى الطويل، والحفاظ على كتل أكتوبر غير مقطعة أو مقطعة جزئيا، بدلا من الشرائح، في 80 درجة مئوية.
- جعل العازلة thiocyanate guanidine لإعداد الحمض النووي الريبي من الخلايا العصبية الحركية تشريح باستخدام الحلول التي تقدمها الشركة المصنعة لمجموعة إعداد الجيش الملكي النيبالي وفقا لتوجيهاتها.
2. إعداد أقسام الحبل الشوكي من الفئران (الشكل 1A)
- تنظيف جميع أدوات تشريح، والشرائح الزجاجية، وشفرات الحلاقة، ومنصة تشريح عن طريق الخبز أو المسح مع حل إزالة التلوث RNase، تليها RNase خالية من الإيثانول 70٪. يترك لتجف لمدة 2 دقيقة. حافظ على كل شيء خاليا من الغبار من خلال التغطية بمناديل المختبر.
- يجب تنفيذ إجراءات التعامل مع الحيوانات ، بما في ذلك التخدير ، وتشويش القلب ، والقتل الرحيم ، وفقا لمتطلبات لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية المحلية للحيوانات (IACUC) ، بهدف الوصول بالحيوان بسرعة إلى نقطة تشريح الحبل الشوكي.
- تخدير الماوس عن طريق الحقن داخل الصفاق (IP) من جرعة قاتلة من الكيتامين (450 ملغم /كغ).
- بمجرد تحقيق مستوى عميق من التخدير وتأكيده من خلال عدم وجود استجابة لقرصة إصبع القدم ، ضع الجانب البطني للفأر على منصة تشريح (لوحة الستايروفوم ، على سبيل المثال) ، افتح تجويف الصدر لفضح القلب ، وأدخل إبرة الفراشة 27 G من التسريب المحدد في البطين الأيسر (الذي هو على يمين المحقق). الأذين الأيمن مع ملقط حاد، و perfuse مع برنامج تلفزيوني بمعدل 5-7 مل / دقيقة لمدة 2 دقيقة باستخدام مضخة التجبير. يجب أن يكون السائل المتدفق من الأذين خاليا إلى حد كبير من الدم في هذه المرحلة.
- إزالة إبرة التشوه، وقطع رأس الماوس، وتحويله على لوحة تشريح. افتح الجلد لكشف العمود الفقري، واستخدم مقصا صغيرا وملقطا لإزالة الفقرات، واخرج الحبل الشوكي أثناء قطع جذور الأعصاب بملقط حاد. السرعة والممارسة ضرورية في الانتقال من بداية التشوه إلى إزالة الحبل؛ هذا ينبغي أن يستغرق أكثر من 7 دقائق.
- شطف الحبل لمدة 10 ثانية في المياه الخالية من RNase لغسل أي دم المتبقية. وضع الحبل الشوكي على شريحة زجاجية خالية من RNase مع ملقط منحني بلطف شديد ولكن بسرعة. تقسيم الحبل الشوكي عرضية باستخدام شفرة حلاقة نظيفة إلى 9-10 قطع.
- ضع القطع في cryomold مليئة O.C.T. باستخدام نفس ملقط، ومحاذاتها عموديا باستخدام إبرة نظيفة. ضع القالب في صينية ضحلة تحتوي على 2-ميثيلبوتان مبردة مسبقا بالنيتروجين السائل ، ثم ضع الصينية في حمام النيتروجين السائل لتجميد قطع الحبل الشوكي بسرعة لتجنب تدهور الحمض النووي الريبي.
- قم بتخزين الكتلة المضمنة في OCT عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر قبل القسمة. وينبغي أن تتم العملية من استرجاع الحبل من خلال تجميد في غضون 5 دقائق للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي.
- Cryosection كتلة O.C.T.المضمنة في -20 درجة مئوية مع cryostat لإنتاج شرائح 20 ميكرومتر، كل منها يحتوي على 9-10 أقسام الصليب الحبل الشوكي، على RNase خالية من القلم غشاء 2 ميكرومتر الشرائح أبقى في البداية في درجة حرارة الغرفة لضمان أن الأقسام تلتزم الشريحة. على الفور إعادة تجميد القسم على سطح -20 درجة مئوية داخل cryostat. احتفظ بالشرائح عند -80 درجة مئوية حتى يتم استخدامها.
3. تلطيخ أقسام الحبل الشوكي (الشكل 1A)
- على رف نظيف، ترتيب ستة أنابيب مخروطية 50 مل. ملء كل منهم مع 25-30 مل من الإيثانول RNase خالية من 70٪، بحيث عمق يكفي لتغطية جميع المقاطع على الشريحة عندما يتم غمر الشريحة. جعل 30-35 مل من 1٪ حل أزور B كما هو موضح سابقا والاحتفاظ بها على نفس الرف لتقليل الوقت بين تغيير الحلول أثناء الغسيل أو تلطيخ. احتفظ بثلاث أو أربع مناديل معملية أمام الحامل لاستنزاف محلول إضافي بسرعة.
- أخرج الشرائح من الفريزر -80 درجة مئوية على الثلج الجاف. تذوب شريحة واحدة عن طريق وضعها على كف قفاز. إزالة معظم الرطوبة والتكثيف على الشريحة عن طريق مسح تشغيله مع مسح المختبر، مع الحرص على عدم لمس المقاطع. وضع الشريحة على هلام السيليكا الطازجة المجففة في طبق بيتري لمدة 30-40 ثانية لتجف تماما. إذا كانت رطوبة المختبر عالية ، يمكن استخدام علاج قصير في مزيل فراغ لتجفيف الشريحة بسرعة أكبر.
- الغسيل والتلطيخ.
- تراجع الشريحة المجففة في الأنبوب الأول من الإيثانول خالية من RNase 70٪. نقع الشريحة لمدة 30 ثانية، ثم غسل الشريحة لإزالة أكتوبر عن طريق غمس صعودا وهبوطا لمدة 45-60 ثانية . أخرج الشريحة من المحلول واستنزف السائل الزائد على مناديل المختبر. كرر نفس العملية عن طريق غمس الشريحة في الأنبوب الثاني من الإيثانول 70٪. إذا لم يتم الإصابة ب OCT حول أقسام الحبل الشوكي تماما، كرر الغسيل في الأنبوب الثالث.
- بعد استنزاف السائل الزائد، غمر الشريحة في محلول Azure B بنسبة 1٪ في الإيثانول الخالي من RNase بنسبة 70٪ لمدة 30-45 ثانية. استنزاف زائدة أزور B على مسح مختبر; عند هذه النقطة، الشريحة بأكملها ستكون زرقاء.
- غمر الشريحة في الأنبوب التالي من الإيثانول 70٪، وتراجع صعودا وهبوطا بسرعة 3-4x لإزالة الصبغة الزائدة وجعل تلطيخ الخلايا العصبية الحركية محددة مرئية. إذا كانت المقاطع تبدو ملطخة بشكل مظلم جدا ، كرر خطوة إزالة التين في أنبوب جديد من الإيثانول بنسبة 70٪. إذا كان تلطيخ يبدو خفيفا جدا، العودة الشريحة إلى الحل أزور B لمدة 30 ثانية أخرى وتكرار destaining. مسح قبالة الايثانول الزائد والهواء الجاف الشريحة لمدة 40 ثانية ~ حتى يختفي كل السائل. المادة الرمادية ستكون زرقاء فاتحة ، في حين أن الخلايا العصبية الحركية ستكون ملطخة باللون الأزرق العميق ، والذي يمكن رؤيته بسهولة. بدء تشريح فورا.
4. الليزر التقاط الالتصاط الدقيق (LMD) (الشكل 1B)
- قم بتشغيل المجهر وتفريغ حامل الأنبوب لإرفاق غطاء أنبوب ميكروفوج 0.6 مل لجمع العينات. وضع 30 ميكرولتر جوانيدين ثيوسيانات تحلل العازلة في غطاء أنبوب ميكروفوج 0.6 مل. قم بتغطية سطح الغطاء بالسائل عن طريق نشر المحلول باستخدام طرف ماصة. وبهذه الطريقة، سيتم حل جميع الخلايا العصبية التي تم جمعها في محلول solubilizing كما يتم تشريحها. محاذاة الغطاء مع ثقب والهدف مع برنامج المجهر. احتفظ بالغطاء في الوضع المغطى حتى بدء التقاط الليزر.
- ضع الشريحة المجففة الهواء على خشبة المسرح من المجهر LMD رأسا على عقب، بحيث غشاء الشريحة القلم يواجه أسفل. يجب أن يواجه الغشاء ذو المقاطع الثقب ، تحته أنبوب التجميع.
- تشغيل الليزر 10 دقيقة قبل البدء في إعداد الشريحة. التركيز على قسم الحبل الشوكي مع الهدف 5X. الانتقال إلى الهدف 20X للتشريح.
- وضع علامة على منطقة "وهمية" مع القلم الخفيف والسماح لليزر لقطع بها دون جمعها. هذا يرتاح غشاء القلم ويجعل من الممكن للاحتفال وقطع مناطق متعددة على التوالي.
- إعادة تركيز وتحديد الخلايا العصبية الحركية في منطقة القرن البطني. هذه الخلايا العصبية يمكن التعرف عليها من خلال موقعها، مورفولوجيا هرمية، حجمها الكبير، وتلطيخها الأزرق الداكن مع أزور B (الشكل 2).
- باستخدام القلم الخفيف، حدد أداة الرسم ووضع علامة على طول حافة الخلايا العصبية الحركية، مما يجعل مخطط كامل. في محاولة لجعل المخطط أقرب ما يمكن إلى الخلايا العصبية الحركية لتجنب التلوث من خلايا أخرى غير الخلايا العصبية الحركية. (اختبار بعض المقاطع مسبقا لمعرفة مدى اتساع خط قطع الليزر وضبط إزالة حسب الضرورة.) وضع علامة على خلايا متعددة قبل القطع؛ البرنامج سوف نتذكر المواقف.
- جلب الغطاء تحت موقف القطع عن طريق النقر على موقف الغطاء. انقر فوق زر البدء لبدء تشريح الخلايا العصبية الحركية باستخدام الليزر. جمع جميع الخلايا العصبية الحركية من جميع المقاطع على شريحة واحدة في غطاء أنبوب واحد microfuge.
- بعد اكتمال عملية التجميع، أخرج أنبوب الميكروفون من الحامل عن طريق تفريغ الدرج وإزاحة الأنبوب برفق. حل تماما الخلايا العصبية الحركية في المخزن المؤقت عن طريق pipetting الحل صعودا وهبوطا. نقل الحل إلى جسم الأنبوب عن طريق الطرد المركزي في 14000 x ز لمدة 2 دقيقة في 4 درجة مئوية. تجميد العينة فورا في الثلج الجاف وتخزينها في -80 درجة مئوية. هذه العملية، من تلطيخ الشريحة من خلال جمع الخلايا العصبية الحركية، ينبغي أن يتم في غضون 30 دقيقة لشريحة واحدة للحد من تدهور الحمض النووي الريبي.
5. إعداد الحمض النووي الريبي من الخلايا العصبية الحركية
تذوب كل من الخلايا العصبية التي تم جمعها من واحد وتجمع لهم معا لاستخراج الحمض النووي الريبي. قد تبدو العينات زرقاء شاحبة اعتمادا على عدد الخلايا العصبية الحركية (ملطخة أزور B) في نفوسهم. استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة مناسبة وفقا للبروتوكول المنصوص عليها لأنسجة LMD، eluting في الحد الأدنى من حجم ممكن. خذ 1 ميكرولتر للتحقق من كمية العينة وسلامتها. تجميد سريع الحمض النووي الريبي المتبقية على الجليد الجاف وتخزينها في -80 درجة مئوية.
6. تحديد نوعية الحمض النووي الريبي والكمية
تحديد جودة الحمض النووي الريبي مع عينة 1 ميكرولتر على رقاقة الفلوريات الدقيقة الكهروفلوريسي الشعرية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. يمكن استخدام إجمالي الاستعدادات الحمض النووي الريبي مع رقم النزاهة الجيش الملكي النيبالي (رين) فوق 8.5 لرنا-seq وqRT-PCR. كما يتضمن ناتج البيانات عادة التركيز التقريبي للعينة.
Representative Results
يجب أن ينتج البروتوكول المبين أعلاه وفي الشكل 1 50 نانوغرام أو أكثر من إجمالي الحمض النووي الريبي مع RIN من 8.5 > من 3000-4000 جسم خلايا الخلايا العصبية الحركية في الحبل الشوكي التي تم تشريحها من شرائح 9-10 20 ميكرومتر على حوالي 20 شرائح PEN. لأن هذا العدد من الشرائح يمثل أقل من 10٪ من كتلة O.C.T.المضمنة من الحبل الشوكي الماوس، فمن الممكن العودة إلى الكتلة، التي تم تخزينها في -80 درجة مئوية، وقطع المزيد من شرائح للذهاب من خلال جولة أخرى من إعداد الحمض النووي الريبي. إذا كانت هناك حاجة إلى كميات أكبر من الحمض النووي الريبي لتحليل، فمن الأفضل لجعل فقط عدد الشرائح(على سبيل المثال 20) في وقت واحد التي يمكن معالجتها من خلال تشريح وإعداد الحمض النووي الريبي في غضون أيام قليلة، ثم جعل المزيد من الشرائح لجولة ثانية والجمع بين المنتجات. تأكد من التحقق من RIN من كل إعداد أولا لتجنب الجمع بين واحدة جيدة مع سيئة. أصبحت أساليب RNA-seq أكثر حساسية وتعد تقنيات PCR الجديدة بحساسية أعلى من التقنيات الحالية. وبالتالي، سوف تكون هناك حاجة أقل الجيش الملكي النيبالي من عدد أقل من أجسام الخلايا العصبية، مما يسمح بمزيد من عمق التسلسل والتحقق من صحة أكثر شمولا من يضرب مثيرة للاهتمام. ومن ناحية أخرى، قد يتطلب الالتزام الكامل بتوصيات MIQE لتحليل التحقق من صحة كمية الكمية4 من إعادة الإعمار والتحقق من الصحة كميات أكبر للسماح بتفاعلات المراقبة اللازمة لرناس منخفض الوفرة.
يظهر الشكل 2 سلسلة نموذجية من الصور لجزء من قسم القرن البطني في الحبل الشوكي بعد تلطيخ Azure B وتشريحه. في لوحة A, الكبيرة, الهيئات الخلية ملطخة بظلام هي الخلايا العصبية الحركية, وأكد من قبل الأجسام المضادة المضادة للدردشةتلطيخ 2, ويتم تمييزها بسهولة من الخلايا المجاورة أصغر. تظهر اللوحة B نفس المنطقة مع أجسام الخلايا الفردية الموضحة بالقلم الخفيف والمرقمة بواسطة برنامج المجهر. الخطوط العريضة تتبع عن كثب هوامش الهيئات الخلية، مع بدل صغير لعرض القطع من الليزر. يجب تحديد هذه المباعدة لكل إعداد طاقة ليزر لتقليل إدراج المواد الدخيلة مع تجنب فقدان الخلايا العصبية الحركية cytosol. لوحات C و D تظهر القسم بعد الليزر قد قطع والهيئات الخلية الفردية قد انخفض في غطاء جمع. لاحظ أن هامش القطع لا يتبع بالضبط مخطط القلم الخفيف في اللوحة C ، ولكنه يبقى خارجه إلى حد كبير. هذه المخالفة واضحة في اللوحة D ، وكذلك المنطقة المظلمة حول كل قطع ، والتي تعكس تلف الحرارة في الأنسجة الناجم عن الليزر. وبسبب هذا، إذا كانت جثتا الخلية قريبة جدا من بعضها البعض، فمن الأفضل أن تحدد لهم لقطع واحد، بدلا من محاولة لقطع لهم بشكل منفصل وفقدان بعض الحمض النووي الريبي لتسخين الضرر في منطقتهم من شبه الاتصال.
ويبين الشكل 3 النتائج النموذجية لتحليل كهربائي لسلامة الحمض النووي الريبي لعينة من الحمض النووي الريبي أعدت من ~ 4000 جسم خلايا الخلايا العصبية الحركية الماوس التي جمعتها LMD. اللوحة العلوية هي الفيروجرام الكهربائي الناتج عن 1 ميكرولتر من إجمالي الحمض النووي الريبي؛ في الداخل على اليمين هو صورة من هلام. في كل من, لاحظ قمم الحمض النووي الريبي ريبوسومال بارزة. اللوحة السفلية هي الفيروغرام الكهربائي للممر الذي يحتوي على معايير حجم الحمض النووي الريبي. وحسب برنامج التحليل RIN 9.8 لهذه العينة، بتركيز 4.9 نانوغرام/ميكرولتر. وكان ما مجموعه 13 ميكرولتر من هذا الحل متاحا بعد التحليل، مما يوفر 64 نانوغراما من الحمض النووي الريبي للتحقق من صحة كميات النسخ من QRT-PCR في المصب. لتحليل qRT-PCR نموذجي من النصوص وفيرة معتدلة، 0.15-0.20 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي كافية لإنتاج كمية دقيقة2،وبالتالي فإن كمية الحمض النووي الريبي المتاحة من هذا الإعداد كافية للتحقق من صحة عدد من النصوص مع مجموعات التمهيدي متعددة، على النحو الموصى به4. وبطبيعة الحال، يمكن استخدام كميات أكبر من الحمض النووي الريبي المدخلات للسماح التحقق من صحة النصوص النادرة. هذا المبلغ هو أيضا أكثر من كافية للسماح إعداد المكتبة والجيل القادم من الحمض النووي الريبي- seq.
الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 نظرة عامة على إنتاج شريحة الحبل الشوكي والتقاط الليزر الالتصاع الدقيق لأجسام خلايا الخلايا العصبية الحركية في الحبل الشوكي. أ) خطوات رئيسية في إنتاج شرائح وتلطيخ. ب)عرض الرسوم المتحركة لقسم الحبل الشوكي وتشريح الليزر. انقر هنا لعرض صورة أكبر.
الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم قبل وبعد صور تشريح الليزر من أزور B الهيئات خلايا الخلايا العصبية الحركية الملطخة. أ)جزء من القرن البطني لقسم ملطخة. لاحظ الخلايا الأربع الكبيرة الملطخة بظلام دامس. وهناك أيضا عدد قليل من الخلايا الملطخة طفيفة وأصغر إلى حد ما، والتي ليست الخلايا العصبية الحركية (وأكد من قبل تلطيخ الأجسام المضادة المضادة للدردشة؛ لا تظهر، ولكن انظر Bandyopadhyay2)والتي لن يتم اختيارها لتشريح. العديد من البقع الصغيرة الداكنة هي على الأرجح عمليات الخلايا العصبية (التشعبات والم أكسونات)، ولكن هذا لم يتم تأكيده. ب)الأجسام الأربعة الخلية المبينة مع القلم الخفيف. لاحظ أن المخططات التفصيلية تتبع عن كثب هوامش الخلايا، مع الحد الأدنى من المسافة بينها. وينبغي تحديد هذه المباعدة تجريبيا لكل مجهر وليزر. البرنامج أرقام الخلايا العصبية الفردية، مما يبسط تتبع كم تم جمعها. ج و د)بعد قطع الليزر والقطع التي تحتوي على الهيئات الخلية قد انخفض في غطاء جمع. لاحظ أن الثقب الذي خلفة هو أكبر إلى حد ما من المخطط التفصيلي وغير منتظم. وهذا يعكس عرض شعاع الليزر وكفاءته القطع متغير قليلا اعتمادا على التكوين المحلي للأنسجة. كما هو واضح حافة الأنسجة المظلمة المحيطة كل حفرة بسبب أضرار التدفئة المحلية الناجمة عن الليزر.
انقر هنا لعرض صورة أكبر.
الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن التحليل الكهروفوري لسلامة الحمض النووي الريبي المعد من عينات LMD. أ)A 1 ميكرولتر aliquot من الجيش الملكي النيبالي أعدت من ~ 4000 الهيئات الخلية العصبية الحركية من قبل البروتوكول أعلاه تم تحليلها من قبل الكهربائي الميكروفورية الصغيرة على رقاقة microfluidics. يظهر الرسم الكهربائي، مع قمم الحمض النووي الريبي الريبوسومي البارزة. على اليمين توجد صورة للجل نفسه. ب)يظهر مخطط كهربية معايير الحجم، مع ممر الجل المقابل إلى اليمين. قام برنامج الأجهزة بحساب رين 9.8 لهذه العينة وتركيز 4.9 نانوغرام/ميكرولتر.
Discussion
أهم مقياس لنجاح هذا البروتوكول لإنتاج الحمض النووي الريبي الإجمالي عن طريق التشريح الدقيق بالليزر لشرائح الحبل الشوكي هو قيمة RIN5. بالنسبة لعينات الحمض النووي الريبي من النوى الأعلى، فإن القيم التي تزيد عن 8.5 تنتج بانتظام تسلسلا عالي الجودة وبيانات qRT-PCR. إذا كان العائد منخفضا ولكن الجودة عالية ، كرر التحضير. إذا كانت السلامة أقل (حتى 7.5-8) ، فمن الأفضل العثور على مصدر المشكلة والمحاولة مرة أخرى. هناك العديد من الخطوات التي يمكن أن يحدث فيها شيء خاطئ ، ولكن في الحقيقة مصدرين فقط للمشكلة - تلوث RNase الداخلي أو تلوث RNase الخارجي. يمكن معالجة الأول عن طريق الممارسة ، بحيث يتم تقليل الوقت من تضحية الماوس إلى تجميد الحبل المدمج O.C.T. النقطة الأخرى في البروتوكول حيث RNase الذاتية يمكن أن تسهم في نتيجة سيئة أثناء إعداد شرائح. يجب أن تلتزم كل شريحة بشريحة PEN لدرجة حرارة الغرفة بسرعة ، ولكنها ستذوب (O.C.T تصبح واضحة). أسرع شريحة يمكن إعادة تجميد كلما كان ذلك أفضل. يحتوي نظام التبريد الذي نستخدمه على أسطح مسطحة داخل الغرفة عند -20 درجة مئوية ، والتي نستخدمها لإعادة تجميد الشريحة بسرعة. العثور على بقعة مماثلة في cryostat المستخدمة وتأكد من شريحة يصبح مبهمة مرة أخرى بسرعة.
تعقب مصادر RNase الخارجية يمكن أن يكون صعبا، لأن هناك الكثير من الاحتمالات. الكواشف الوحيدة المستخدمة التي ليست خالية صراحة RNase هي O.C.T. وB Azure. إذا كان أداء Azure B مرضيا من قبل، فجرب زجاجة جديدة من O.C.T. على الرغم من أن هذا الكاشف لم يكن مشكلة أبدا. كما يمكن استبدال الكواشف الخالية من RNase، حتى من مورد مختلف. مصدر أكثر احتمالا هو المحقق. بالإضافة إلى تنظيف شامل لمنطقة العمل، فإنه غالبا ما يكون من المفيد أن يكون عضو مختبر آخر متابعة على طول ومراقبة جميع الخطوات في الإجراء. حتى لو كان هذا هو الشخص الذي لا يؤدي هذا الإجراء بشكل روتيني، مجموعة جديدة من العيون قد تلتقط مصدر التلوث دون أن يلاحظها أحد.
إن توسيع نطاق هذا البروتوكول ليشمل استعادة الحمض النووي الريبي من خلايا الحبل الشوكي الأخرى، أو من خلايا الحبل الشوكي من أنواع أخرى، أو من أنواع خلايا محددة في أعضاء أخرى سيتطلب تعديلات في عدة مجالات تهدف إلى تحقيق تحديد واضح للخلايا ذات الأهمية مع تجنب، أو على الأقل التقليل من تأثير RNase الذاتية. في البروتوكول هنا ، سمحت الإزالة السريعة وتجميد الحبل ، إلى جانب تلطيخ Azure B في الإيثانول بنسبة 70٪ ، بالتقليل من تدهور الحمض النووي الريبي وسهولة تحديد أجسام خلايا الخلايا العصبية الحركية. أزور B هو وصمة عار الهسوتشيماكيميائية راسخة للخلايا العصبية التي يبدو أن ربط الحمض النووي الريبي3 وقد استخدمت لتقييم محتوى الحمض النووي الريبي من الخلايا العصبية في عينات تشريح أنسجة الدماغ من المرضى الذين يعانون من مرض تنكسي عصبي6. وتجدر الإشارة إلى أن تلطيخ Azure B لم يؤثر على سلامة الحمض النووي الريبي المنقى أو قدرته على أن يتم نسخه وتحليله عكسيا. وقد استخدمت الأصباغ الأخرى، مثل كريسيل البنفسجي7 والأزرق تولويدين8 في بروتوكولات LMD مماثلة. جمع جثث الخلية مباشرة في محلول ثيوسيانات guanidine كما تم تشريحها قدمت الخطوة الأخيرة التي أسفرت عن الانتعاش الروتيني للجيش الملكي النيبالي سليمة.
ويمكن تصور نهج مماثلة للخلايا والأعضاء الأخرى، مع الاعتراف بأن تحديد الخلايا ذات الأهمية مع التقليل إلى أدنى حد ممكن، أو، ويفضل، منع تدهور الحمض النووي الريبي عن طريق RNases الذاتية هو الشرط الحاسم للتحليل الناجح. في الأنسجة التي لديها مستويات عالية من RNase، مثل البنكرياس، وقد تم الجمع بين التعامل السريع وانخفاض درجة الحرارة للسماح باستعادة الحمض النووي الريبي من β الخلايا، والاستفادة من autofluorescence الطبيعية للتصور9. كما تم الإبلاغ عن الإجراءات التي تستخدم تلطيخ الأجسام المضادة لتحديدالهوية 10، ولكن لم تكن ناجحة تماما في أيدينا. وأخيرا، تتوفر العديد من نماذج الماوس التي تعبر عن بروتينات الانصهار الفلورية(أي GFP، YFP، RFP) في الخلايا ذات الاهتمام، والتي يمكن استخدامها لتحديدها في أقسام الأنسجة على المجهر LMD. في الواقع، سلالات الماوس قمنا بتحليل مع هذا البروتوكول التعبير عن بروتين الانصهار بين SOD1 و YFP11،والخلايا العصبية الحركية الحبل الشوكي هي الفلورسنت للغاية. لم نتمكن، مع ذلك، من العثور على مجموعة من يغسل الإيثانول و / أو ظروف الجفاف التي من شأنها أن تزيل في وقت واحد O.C.T.، وتمنع نشاط RNase، والحفاظ باستمرار على ما يكفي من فلورية YFP للسماح تصور الخلايا العصبية الحركية وشفائها من قبل LMD. ربما يمكن العثور على بروتين فلوري جديد أو متغير من تلك المتاحة التي تحافظ على الفلورسينس في المذيبات العضوية للتغلب على هذا القيد.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
ويود المؤلفون أن يشكروا جورج فار وأعضاء مختبر هورويتش على المناقشات المفيدة. وقد دعم هذا العمل معهد هوارد هيوز الطبي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Webster Veterinary | 26637041101 | Any source approved by the institutional veterinary service |
| Dissection tools (scissors, forceps, etc.) | Any convenient source of high-quality dissection instruments | ||
| Cryostat | Leica Microsystem | CM3050S | Other cryostats should be suitable |
| LMD6000 B | Leica Microsystem | Other LMD systems have not been tested | |
| RNase-free PEN-membrane 2 μm slides | Leica Microsystem | 11505189 | Other slide types have been tested and do not perform well |
| RNeasy Micro kit (50) | Qiagen | 74004 | Any kit that uses guanidine thiocyanate lysis buffer and has been tested for recovering small quantities of RNA can be used |
| Agilent 2100 BioAnalyzer | Agilent Technologies | G2939A | |
| Azure B Certified | MP Biomedicals | 190520 | Critical! Product from any source has to be tested before use for its ability to maintain RNA integrity |
| PBS | Sigma Life Science | D8537 | Any reliable source of RNase-free PBS |
| RNA Ethanol 70% (made with DEPC treated water) | American Bioanalytical | AB04010-00500 | Any reliable source, can be lab-made |
| Water, RNase-free, Endotoxin tested (treated with DEPC to eliminate RNase) | American Bioanalytical | AB02128-00500 | Any reliable source, can be lab-made |
| RNase AWAY | Invitrogen Life Technologies | 10328-011 | Other similar RNase removal reagents, such as RNaseZAP (also from Invitrogen) can be used |
| 2-Methylbutane | Electron Microscopy Sciences | 78-78-4 | Any source |
| Maxymum Recovery microfuge tubes (0.6 and 1.5 ml) and pipette tips | Axygen | 311-03-051 & 311-09-051 | Ultra-low retention, RNase free tubes and tips; test other manufacturer's products before using |
| O.C.T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryomold Intermediate Size | Tissue-Tek | 4566 | |
| Lab wipes (Kimwipes) | KIMTECH | 34155 |
References
- Zhu, J., Nie, S., Wu, J., Lubman, D. M. Target proteomic profiling of frozen pancreatic CD24+ adenocarcinoma tissues by immuno-laser capture microdissection and nano-LC-MS/MS. J. Proteome. Res. , (2013).
- Bandyopadhyay, U., et al. RNA-Seq profiling of spinal cord motor neurons from a presymptomatic SOD1 ALS mouse. PLoS ONE. 8 (1), 10-1371 (2013).
- Shea, J. R. A method for in situ cytophotometric estimation of absolute amount of ribonucleic acid using azure B1. J. Histochem. Cytochem. 18 (2), 143-152 (1970).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin. Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol. Biol. 7, (2006).
- Doebler, J. A., Rhoads, R. E., Anthony, A. Neuronal RNA in Pick's and Alzheimer's diseases. Comparison of disease-susceptible and disease-resistant cortical areas. Arch. Neurol. 46 (2), 134-137 (1989).
- Lobsiger, C. S., Boillée, S., Cleveland, D. W. Toxicity from different SOD1 mutants dysregulates the complement system and the neuronal regenerative response in ALS motor neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (18), (2007).
- Ferraiuolo, L., et al. Microarray analysis of the cellular pathways involved in the adaptation to and progression of motor neuron injury in the SOD1 G93A mouse model of familial ALS. J. Neurosci. 27 (34), 9201-9219 (2007).
- Sturm, D., et al. Improved protocol for laser microdissection of human pancreatic islets from surgical specimens. J. Vis. Exp. 6 (71), (2013).
- Burbach, G. J., Dehn, D., Nagel, B., Del Turco, D., Deller, T. Laser microdissection of immunolabeled astrocytes allows quantification of astrocytic gene expression. J. Neurosci. Methods. 138 (1-2), 141-148 (2004).
- Wang, J., et al. Progressive aggregation despite chaperone associations of a mutant SOD1-YFP in transgenic mice that develop ALS. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (5), 1392-1397 (2009).
