Summary
고품질 총 RNA는 70% 에탄올에 Azure B로 척수 섹션을 염색한 후 레이저 포획 마이크로디스트섹션에 의해 마우스 척수 모터 뉴런의 세포체로부터 제조되었다. 충분한 RNA(~40-60 ng)는 RNA-seq 및 qRT-PCR에 의한 하류 RNA 분석을 허용하기 위해 3,000-4,000개의 모터 뉴런으로부터 회수된다.
Abstract
관심 있는 세포로부터 고품질 RNA의 준비는 세포 모형 사이 또는 건강과 질병에서 동일 세포 모형 사이 또는 약리학 처리를 따르는 전사 다름의 정확하고 의미 있는 분석에 중요합니다. 척수에서, 많은 신경학및 신경퇴행성 질병에 대한 관심의 대상인 운동 뉴런의 이러한 준비는 운동 뉴런이 전체 세포 인구의 <10%를 나타낸다는 사실에 의해 복잡합니다. 레이저 포획 마이크로절(LMD)은 이 문제를 해결하기 위해 개발되었습니다. 여기서는 내인성 및 외인성 RNases에 의한 RNA 손상을 피하기 위해 마우스 척수를 신속하게 복구, 동결 및 섹션 마우스 척수를 하는 프로토콜을 설명하고, 다음 70% 에탄올에서 Azure B로 염색하여 내인성 RNase억제를 유지하면서 운동 신경을 식별합니다. LMD는 그 때 RNA 무결성을 유지하면서 구아니딘 틸리오네이트 용해 완충안으로 직접 스테인드 뉴런을 포착하는 데 사용된다. 표준 기술은 총 RNA를 복구하고 무결성을 측정하는 데 사용됩니다. 이 물질은 RNA-seq 및 qRT-PCR에 의한 성적증명서의 다운스트림 분석에 사용될 수 있다.
Introduction
다중 상이한 세포 유형으로 구성된 포유류 조직에서, 레이저 포획 미세 절(LMD) 계측의 출현은 RNA 또는 단백질 수준에서 분석을 위한 특정 세포 유형을 선택할 수 있는 가능성을 부여했다. 현재, 증폭 및 차세대 염기서열기는 몇 천 개의 세포로부터 총 RNA 풀을 사용하여 RNA의 상대적 수준의 평가 및 다양한 접합 형태의 식별을 포함하여 전사의 비교적 철저한 재고를 얻을 수 있게 한다. 현재까지, 몇 천 세포의 proteomics 분석은 단지 더 풍부한 종을 통해 아래로 도달 할 것이다. 예를 들어, 3,000-4,000개의 운동 신경 세포 체(도시되지 않음)에서 가장 풍부한 단백질의 <1,000을 확인했으며, 주및 동료들은 최근 ~15,000종양 세포1에서2,665개의 단백질을 식별하는 것으로 보고하였다. 그러나 질량 분석의 추가 발전과 함께 이러한 분석은 훨씬 더 깊이까지 확장 될 가능성이 높습니다.
여기서는 마우스 척수에서 운동 신경 세포 체의 LMD에 사용되는 특정 프로토콜을 제시하고 RNA의 준비에 선행합니다. 이 프로토콜은 RNA-seq 및 qRT-PCR 유효성 검사2에의해 야생형 SOD1 형질화균으로부터 제조된 RNA를 가진 전증상 형 형질산성 돌연변이 염기산염(SOD)1 근위축성 측삭 경화증(ALS) 마우스의 운동 뉴런으로부터 RNA를 비교하는 맥락에서 사용되었다. 특히, 척수의 회색 물질의 전방 경적에서 모터 뉴런은 성상세포 의 바다로 둘러싸인 전체 세포 인구의 <10 %를 구성하며, 따라서 그들의 전사 프로필은 전체 코드의 연구에서 쉽게 감소 될 수 없습니다. 레이저 포획 접근법은 따라서 이 세포에 있는 RNA 발현을 분석하기 에 이상적입니다, 생리학은 짧은 심혈 내 식염수 관류에 따라 코드를 급속하게 절제하고 동결하여 보존됩니다. 모터 뉴런 소마타는 크고 따라서 쉽게 감지할 수 있으며, 여기서는 뉴런에 대한 강한 친화력을 가진 염료를 이용하여3. 또한, 이러한 크기로, 이들 세포는 상대적으로 많은 양의 RNA를 캡처한 세포당 제공한다. 아래에 자세히 설명된 바와 같이 사용되는 절차는 염색 기술이나 항체 염색에 의해 구체적으로 확인된 잠재적으로 다른 세포 유형뿐만 아니라 다른 세포 유형을 얻기 위해 쉽게 조정할 수 있습니다.
Protocol
여기에 설명된 절차는 예일 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인된 프로토콜에 따라 마우스의 마취, 안락사 및 심관류를 위해 수행되었습니다.
1. RNase 가 없는 계측기 및 솔루션 준비
- RNase는 벤치 탑, 마이크로 피펫 및 조사자를 포함한 모든 실험실 표면의 일반적인 오염 물질입니다.
- 장갑을 자주 또는 정기적으로 RNAe 오염 제거 용액으로 닦아.
- 스테인레스 스틸 해부 도구 및 유리 제품은 1 시간 이상 >200 ° C에서 가열하여 RNase가 없는 것으로 만들 수 있습니다. 참고: 증기 살균은 RNase를 파괴하지 않습니다. 또는 RNase 오염 제거 용액으로 닦은 다음 RNase가없는 70 % 에탄올과 공기 건조로 닦아냅니다.
- RNase 오염 제거 용액을 사용하여 벤치 탑, 다른 실험실 표면 및 마이크로 파이프를 닦은 다음 RNase가없는 70 % 에탄올로 닦아냅니다. RNA 복구 및 분석을 위해 특정 실험실 벤치 또는 작업 영역을 지정합니다. 참고: 파이펫터의 샤프트를 닦기 전에 팁 이젝터를 제거하고 가능하면 제거합니다.
- 제조업체에서 인증한 튜브, 미세심분리기 튜브, 파이펫 및 마이크로피펫 팁을 RNase 가 없는 것으로 사용하십시오. 매우 낮은 바인딩 팁과 마이크로 튜브의 사용을 권장합니다. 가능하면 이러한 구성 요소의 갓 열린 상자 나 가방을 사용하여 일반 실험실 공급과 분리하십시오.
- 상업용 공급원으로부터 RNase 프리 솔루션[덜베코의 칼슘 및 마그네슘 이없는 PBS(PBS), 에탄올, RNase 프리 70% 에탄올]을 상업적 출처로부터 획득하십시오. 각 실험에 새로 열린 병을 사용하십시오.
- Azure B 염료의 소스는 그대로 RNA를 성공적으로 복구하는 데 중요합니다. 염색 및 수집에 귀중한 샘플을 커밋하기 전에 각 염료 배치를 테스트합니다. 실험적이지 않은 동물로부터 수천 개의 뉴런을 수집하고 RNA를 준비하고, 8.5 이상의 RIN 수치를 일관되게 생성하는 것을 찾기 위해 아래에 설명된 바와 같이 RNA 무결성을 결정합니다.
- RNase 가없는 70 % 에탄올에 Azure B 염료 (1 %, wt /vol)를 녹여, 일반적으로 50ml 원심 분리 튜브에서 30 ml 에탄올에서 0.3 g. 하룻밤 동안 RT의 로커에 잘 섞거나 모든 입자가 용해될 때까지 잘 섞습니다. 이 솔루션의 한 튜브는 염색 강도에 영향을 주지 않고 여러 슬라이드를 염색하는 데 사용할 수 있습니다.
- 예방 조치로, 각 생물학적 복제에 대한 얼룩의 다른 튜브를 사용합니다.
- 크로졸드 및 O.C.T.를 사용하여 추가 치료 없이 코드 섹션을 포함하십시오.
- -20 ~ -24°C에서 저온을 유지합니다. 단면 후, 충분한 숫자가 준비될 때까지 슬라이드를 -80°C 냉동고에 놓습니다. 슬라이드가 만들어진 후 가능한 한 빨리 RNA 준비를 시작합니다. 장기 저장의 경우 슬라이드가 아닌 섹션해제 또는 부분적으로 단면된 OCT 블록을 80°C로 유지합니다.
- RNA 제제 키트 제조업체가 제공하는 솔루션을 사용하여 해부된 운동 뉴런으로부터 RNA 준비를 위한 구아니딘 틸리오네이트 버퍼를 확인하십시오.
2. 마우스에서 척수 섹션의 준비 (그림 1A)
- RNase 오염 제거 용액으로 베이킹 또는 닦아 모든 해부 도구, 유리 슬라이드, 면도날 및 해부 플랫폼을 청소하고 RNase가없는 70 % 에탄올이 있습니다. 2 분 동안 건조하십시오. 실험실 물티슈로 덮어 모든 것을 먼지가 없는 상태로 유지하십시오.
- 마취, 심장 관류 및 안락사를 포함한 동물 취급 절차는 현지 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 요구 사항에 따라 수행되어야하며, 척수 해부 지점으로 동물을 신속하게 데려 오는 것을 목표로합니다.
- 케타민의 치명적인 복용량의 인트라피토날 (ip) 주사에 의해 마우스를 마취 (450 mg/kg).
- 발가락 핀치 반응의 부족으로 심층 마취가 달성되고 확인되면 마우스 복부 면을 해부 플랫폼 (예 : 스티로폼 보드)에 올려 놓고 가슴 구멍을 열어 심장을 노출시키고 왼쪽 심실에 주입의 27 G 나비 바늘을 삽입하십시오 (조사자의 오른쪽에 있음). 날카로운 집게로 오른쪽 아트리움을 닉하고, 연동 펌프를 사용하여 약 2 분 동안 5-7 ml / 분의 속도로 PBS와 perfuse. 아트리움에서 흐르는 액체는 이 시점에서 혈액이 크게 없어야 합니다.
- 관류 바늘을 제거하고 마우스를 참수하고 해부 보드에 뒤집습니다. 피부를 열어 척추를 드러내고, 작은 가위와 집게를 사용하여 척추를 제거하고, 날카로운 집게로 신경 뿌리를 끊으면서 척수를 들어 올립니다. 속도와 연습은 관류의 시작에서 코드 제거로 이동하는 데 필수적입니다. 이 7 분 이상 걸리지 않아야합니다.
- RNase가 없는 물에서 10초 동안 코드를 헹구어 잔류 혈액을 씻어내십시오. 척수를 RNase 가 없는 유리 슬라이드에 놓고 매우 부드럽고 빠르게 구부러진 집게를 놓습니다. 깨끗한 면도날을 사용하여 척수를 9-10개로 나눕니다.
- 동일한 포셉을 사용하여 O.C.T.로 채워진 극저온에 조각을 놓고 깨끗한 바늘을 사용하여 수직으로 정렬합니다. 액체 질소로 미리 냉각된 2-메틸부탄을 포함하는 얕은 트레이에 금형을 놓은 다음 트레이를 액체 질소 욕조에 넣고 RNA 분해를 피하기 위해 척수 조각을 빠르게 얼게팅합니다.
- 단면화 전에 최대 6개월 동안 -80°C에 OCT 임베디드 블록을 저장합니다. 동결을 통해 코드의 검색에서 프로세스는 RNA 무결성을 유지하기 위해 5 분 이내에 수행해야합니다.
- 저온섹션은 -20°C의 O.C.T.-embedded 블록과 극저온으로 20μm 슬라이스를 생성하며, 각각 9-10 척수 횡단면을 함유하고 있으며, RNase 가 없는 PEN 멤브레인 2 μm 슬라이드에서 섹션이 슬라이드에 부착되도록 하였다. 즉시 극저온 내부 -20 °C 표면에 섹션을 다시 고정합니다. 슬라이드를 사용할 때까지 -80°C로 유지합니다.
3. 척수 부분의 염색 (그림 1A)
- 깨끗한 랙에 6 개의 50ml 원식 튜브를 준비하십시오. 25-30ml의 RNase 프리 70% 에탄올로 모두 채우고, 슬라이드가 침지될 때 슬라이드의 모든 섹션을 덮을 수 있도록 깊이가 충분하도록 합니다. 앞에서 설명한 대로 30-35ml의 Azure B 솔루션을 1% Azure B 솔루션으로 만들고 세척 또는 염색 중에 변경되는 솔루션 사이의 시간을 최소화하기 위해 동일한 랙에 보관하십시오. 랙 앞에 서너 개의 실험실 물티슈를 보관하여 추가 솔루션을 신속하게 배출하십시오.
- -80°C 냉동고에서 슬라이드를 드라이 아이스로 가져 가라. 장갑을 낀 손바닥에 놓아 슬라이드 하나를 해동합니다. 실험실 닦아로 닦아 슬라이드의 수분과 응축의 대부분을 제거, 섹션을 만지지 않도록주의. 신선한 실리카 젤 데시칸트에 30-40초 동안 완전히 건조시십시오. 실험실 습도가 높으면 진공 청정기에서 간단한 처리를 사용하여 슬라이드를 더 빨리 건조시킬 수 있습니다.
- 세탁 및 염색.
- 말린 슬라이드를 RNase 가 없는 70% 에탄올의 첫 번째 튜브에 담급드세요. 슬라이드를 30초 동안 담근 다음 슬라이드를 세척하여 45-60초 동안 위아래로 찍어 10월을 제거합니다. 슬라이드를 용액에서 꺼내 실험실 물티슈에 여분의 액체를 배출하십시오. 70% 에탄올의 제2 튜브에 슬라이드를 찍어 동일한 과정을 반복합니다. 척수 섹션 주변의 OCT가 완전히 사라지지 않으면 세 번째 튜브에서 세척을 반복하십시오.
- 여분의 액체를 배출 한 후, 30-45 초 동안 70 % RNase 프리 에탄올에 1 % Azure B 솔루션에 슬라이드를 잠급. 랩 지우기에서 과도한 Azure B를 빼냅니다. 이 시점에서 전체 슬라이드는 파란색이 됩니다.
- 70% 에탄올의 다음 튜브에 슬라이드를 잠급하고, 3-4x를 빠르게 위아래로 찍어 과도한 염료를 제거하고 특정 모터 뉴런 염색을 볼 수 있도록 합니다. 섹션이 매우 어둡게 얼룩진 것처럼 보이면 70 %의 에탄올의 신선한 튜브에서 타락단계를 반복하십시오. 염색이 너무 밝아 보이는 경우 슬라이드를 Azure B 솔루션으로 30초 간 반환하고 디스타닝을 반복합니다. 여분의 에탄올을 닦아 공기는 모든 액체가 사라질 때까지 ~ 40 초 동안 슬라이드를 건조. 회색 물질은 밝은 파란색이 될 것이고, 모터 뉴런은 쉽게 볼 수있는 깊은 파란색으로 얼룩질 것입니다. 해부를 즉시 시작합니다.
4. 레이저 포획 미세 절 (LMD) (그림 1B)
- 현미경을 켜고 튜브 홀더를 내리고 샘플 수집을 위해 0.6 ml 마이크로 퍼지 튜브의 캡을 부착합니다. 30 μl guanidine 티오세이네이트 리시스 버퍼를 0.6 ml 마이크로퍼지 튜브의 캡에 넣습니다. 파이펫 팁을 사용하여 용액을 퍼뜨리면 캡 표면을 액체로 덮습니다. 이러한 방식으로 수집된 모든 뉴런은 해부될 때 용해도 용액에 용해됩니다. 캡을 구멍과 목표와 현미경 소프트웨어로 정렬합니다. 레이저 캡처를 시작할 때까지 캡을 덮인 위치에 유지합니다.
- LMD 현미경의 단계에 공기 건조 슬라이드를 거꾸로 놓고 PEN 슬라이드의 멤브레인이 아래로 향합니다. 섹션이있는 멤브레인은 구멍에 직면해야하며, 그 아래에는 수집 튜브가 있습니다.
- 슬라이드 준비를 시작하기 전에 레이저를 10 분 켜십시오. 5X 목표를 가진 척수 섹션에 집중하십시오. 해부에 대한 20X 목표로 이동합니다.
- 라이트 펜으로 "더미"영역을 표시하고 레이저가 수집하지 않고 잘라 낼 수 있도록합니다. 이렇게 하면 PEN 멤브레인이 완화되고 여러 영역을 연속적으로 표시하고 절단할 수 있습니다.
- 다시 초점을 맞추고 복부 뿔 영역에서 모터 뉴런을 식별합니다. 이 뉴런은 그들의 위치, 피라미드 형태, 큰 크기 및 Azure B(그림 2)로어두운 파란색 염색으로 인식 할 수 있습니다.
- 라이트 펜을 사용하여 도면 도구를 선택하고 모터 뉴런의 가장자리를 따라 표시하여 전체 윤곽선을 만듭니다. 운동 뉴런 이외의 세포에서 오염을 피하기 위해 운동 뉴런에 가능한 한 가까운 윤곽을 만들려고 합니다. (레이저 컷 라인이 얼마나 넓은지 미리 테스트하고 필요에 따라 클리어런스를 조정합니다.) 절단하기 전에 여러 셀을 표시; 소프트웨어는 위치를 기억할 것입니다.
- 캡 위치를 클릭하여 캡을 절단 위치 아래에 가져옵니다. 시작 버튼을 클릭하여 레이저로 운동 뉴런 해부를 시작합니다. 하나의 마이크로 퍼지 튜브의 캡에 하나의 슬라이드에 모든 섹션에서 모든 모터 뉴런을 수집합니다.
- 수집이 완료되면 트레이를 내리고 튜브를 부드럽게 풀어 주어 마이크로퍼지 튜브를 홀더에서 꺼냅니다. 용액을 위아래로 피펫팅하여 버퍼의 모터 뉴런을 완전히 용해합니다. 4°C에서 2분 동안 14,000 x g에서 원심분리하여 용액을 튜브 본체로 이동합니다. 샘플을 즉시 드라이 아이스에 동결하고 -80 °C에 보관하십시오. 이 과정은, 모터 뉴런 수집을 통해 슬라이드 염색에서, RNA 분해를 최소화하기 위해 하나의 슬라이드에 대해 30 분 이내에 수행해야합니다.
5. 모터 뉴런에서 RNA 준비
한 동물에서 수집 된 모든 뉴런을 해동하 고 RNA를 추출 하기 위해 함께 그들을 풀. 샘플은 모터 뉴런(Azure B로 염색)의 수에 따라 옅은 파란색으로 보일 수 있습니다. LMD 조직에 제공된 프로토콜에 따라 적합한 키트를 사용하여 RNA를 추출하여 최소한의 부피를 가능한 것으로 용출한다. 1 μl을 사용하여 샘플의 수량과 무결성을 확인합니다. 마른 얼음에 남아있는 RNA를 빨리 동결하고 -80 ° C에 저장합니다.
6. RNA 품질 및 수량 의 결정
제조업체의 프로토콜에 따라 모세관 전기 포근 미세 유체 균 칩에 1 μl 샘플로 RNA 품질을 결정합니다. RNA 무결성 번호(RIN)를 8.5 이상으로 사용한 총 RNA 제제는 RNA-seq 및 qRT-PCR에 사용될 수 있다. 데이터 출력은 또한 일반적으로 샘플의 대략적인 농도를 포함한다.
Representative Results
상기 와 도 1에서 설명된 프로토콜은 약 20PEN 슬라이드에 9-10 20 μm 슬라이스에서 해부된 3,000-4,000척수중전지 신경세포 체로부터 >8.5의 RIN로 총 RNA의 50 ng 이상을 생성해야 한다. 이러한 슬라이드 수는 마우스 척수의 O.C.T.임베디드 블록의 10% 미만을 나타내기 때문에 -80°C에 저장된 블록으로 돌아가 RNA 제제의 또 다른 라운드를 통과하기 위해 더 많은 슬라이스를 절단할 수 있다. 분석을 위해 더 많은 양의 RNA가 필요한 경우, 며칠 안에 해부 및 RNA 준비를 통해 처리 될 수있는 한 번에 슬라이드(예를 들어 20)의 수만 만드는 것이 좋습니다, 다음 두 번째 라운드에 대한 더 많은 슬라이드를 하고 제품을 결합. 좋은 것을 나쁜 것과 결합하지 않도록 먼저 각 준비의 RIN을 확인하십시오. RNA-seq 방법은 점점 더 민감해지고 있으며 새로운 PCR 기술은 현재보다 더 높은 감도를 유망하고 있습니다. 따라서, 적은 신경 세포 바디에서 더 적은 RNA가 요구될 것입니다, 더 중대한 시퀀싱 깊이 및 흥미로운 안타의 더 포괄적인 검증을 허용합니다. 한편, qRT-PCR 분석 및 유효성 검사4에 대한 MIQE 권장 사항을 완전히 준수하려면 저풍부 RNA에 필요한 제어 반응을 허용하기 위해 더 많은 양이 필요할 수 있습니다.
도 2는 Azure B 염색 및 해부 후 척수 복부 경적 섹션의 일부의 일반적인 일련의 이미지를 보여 주어 있습니다. 패널 A에서, 크고 어두운 염색된 세포 체는 운동 뉴런이며, 안티-채팅 항체 염색2에의해 확인되고, 더 작은 이웃 세포로부터 쉽게 분화된다. 패널 B는 광펜으로 윤곽을 드러내고 현미경 소프트웨어에 의해 번호가 매겨진 개별 세포 체와 동일한 영역을 나타낸다. 윤곽선은 레이저의 절단 폭에 대한 작은 수당으로 셀 바디의 여백을 밀접하게 따릅니다. 이 간격은 모터 뉴런 사이토솔의 손실을 피하면서 외부 물질의 포함을 최소화하기 위해 각 레이저 전원 설정에 대해 결정되어야 합니다. 패널 C와 D는 레이저가 절단된 후 섹션을 표시하고 개별 세포 체가 수집 캡에 떨어졌다. 절삭 여백이 패널 C의 라이트 펜 윤곽선을 정확히 따르지는 않지만 대부분 외부에 머물러 있습니다. 이 불규칙성은 패널 D에서 명백하며, 각 절단 주위의 어두운 영역과 마찬가지로 레이저로 인한 조직에 대한 열 손상을 반영합니다. 이 때문에, 두 개의 세포 체가 서로 매우 가까운 경우, 단일 컷에 대 한 그들을 설명 하는 것이 좋습니다., 그들을 별도로 잘라 하려고 하 고 거의 접촉의 그들의 지역에서 열 손상에 일부 RNA를 잃고 보다는.
도 3은 LMD에 의해 수집된 ~4,000마우스 모터 뉴런 세포 체로부터 제조된 RNA 샘플의 RNA 무결성의 전기전구 분석의 전형적인 결과를 나타낸다. 상부 패널은 전체 RNA의 1 μl에 의해 생성된 전기페로그램; 오른쪽의 인셋은 젤의 이미지입니다. 둘 다, 눈에 띄는 리보소말 RNA 봉우리에 주의하십시오. 하부 패널은 RNA 크기 표준을 포함하는 차선의 전극기법이다. 분석 소프트웨어는 4.9 ng/μl의 농도로 이 샘플에 대해 9.8의 RIN을 계산했습니다. 이 용액의 총 13 μl은 분석 후 사용할 수 있었고, 성적증명서 양의 다운스트림 qRT-PCR 유효성 검사를 위해 64 ng의 RNA를 제공했다. 적당히 풍부한 성적증명서의 전형적인 qRT-PCR 분석을 위해, 총 RNA의 0.15-0.20 ng는 정확한수량을생성하기에 충분하므로, 이 제제로부터 사용할 수 있는 RNA의 양은 권장되는4와같이 여러 프라이머 세트를 가진 다수의 성적증명서를 검증하기에 충분하다. 물론, 더 많은 양의 입력 RNA를 사용하여 희귀 한 성적 증명서의 유효성 검사를 허용할 수 있습니다. 이 양은 또한 도서관 준비 및 차세대 RNA-seq를 허용하기에 충분합니다.
그림 1. 척수 슬라이스 생산 및 레이저 캡처 척수 모터 뉴런 세포 체의 미세 절제의 개요. A)슬라이스 생산 및 염색의 주요 단계. B)척수 섹션과 레이저 해부의 만화 보기. 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. Azure B 염색 운동 뉴런 세포 체의 레이저 해부의 전후 이미지. A)염색 된 섹션의 복부 뿔의 일부. 어둡게 얼룩진 4개의 큰 세포를 기록합니다. 또한 몇 가지 가볍게 염색 하 고 다소 작은 세포, 모터 뉴런 되지 않습니다 (안티 채팅 안티 채팅 항체 염색에 의해 확인; 표시 되지 않은, 하지만 반디파디아이참조 2)그리고 이는 해부에 대 한 선택 되지 않습니다. 많은 작은, 어두운 반점은 아마 신경 과정 (점선및 축), 그러나 이것은 확인되지 않았습니다. B)라이트 펜으로 윤곽을 가진 4개의 셀 바디. 윤곽선은 셀의 여백을 밀접하게 따르며, 그 사이의 최소 거리입니다. 이 간격은 각 현미경 및 레이저에 대해 경험적으로 확립되어야 합니다. 이 소프트웨어는 개별 뉴런을 숫자로 기록하여 수집된 수의 추적을 단순화합니다. C 와 D)레이저가 절단하고 세포 체체를 포함하는 조각이 수집 캡에 떨어졌다 후. 뒤에 남겨진 구멍은 윤곽선보다 다소 크고 불규칙합니다. 이것은 조직의 국부 적 조성에 따라 레이저 빔의 폭과 약간 가변 절단 효율을 반영합니다. 또한 레이저로 인한 국소 가열 손상으로 인해 각 구멍을 둘러싼 어두운 조직의 테두리가 명백하다.
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그림 3. LMD 샘플에서 제조된 RNA의 무결성에 대한 전기전광 분석. A)상기 프로토콜에 의해 ~4,000모터 뉴런 세포 체로부터 제조된 RNA의 1 μl 알리쿼트가 미세유체화 칩상에서 미세모세혈관 전기포아증에 의해 분석되었다. 전기 페로그램은 눈에 띄는 리보소말 RNA 봉우리와 함께 표시됩니다. 오른쪽에는 젤 자체의 이미지가 있습니다. B)크기 표준의 전극체그램이 오른쪽에 해당 젤 레인과 함께 표시됩니다. 계측기 소프트웨어는 이 샘플에 대해 9.8의 RIN과 4.9 ng/μl의 농도를 계산했습니다.
Discussion
척수 슬라이스의 레이저 미세 절에 의해 총 RNA를 생산하기위한이 프로토콜의 성공의 가장 중요한 척도는 RIN 값5입니다. 더 높은 진핵생물에서 RNA 견본을 위해, 8.5 이상의 값은 정기적으로 고품질 염기서열 분석 및 qRT-PCR 데이터를 산출합니다. 수율이 낮지만 품질이 높으면 준비를 반복하십시오. 그러나 무결성이 낮은 경우 (심지어 7.5-8), 그러나, 문제의 원인을 찾아 다시 시도하는 것이 좋습니다. 뭔가 잘못 될 수 있는 많은 단계가 있다, 하지만 정말 문제의 두 소스-내 인 성 RNase 오염 또는 외 인 RNase 오염. 첫 번째는 연습으로 해결될 수 있으므로 마우스 희생에서 O.C.T 임베디드 코드를 동결하는 시간을 최소화할 수 있습니다. 내인성 RNase가 나쁜 결과에 기여할 수 있는 프로토콜의 다른 점은 슬라이스를 준비하는 동안입니다. 각 슬라이스는 실온 PEN 슬라이드를 빠르게 부착해야 하지만 녹아요(O.C.T가 명확해집니다). 슬라이스를 더 빨리 재고정할수록 더 좋습니다. 우리가 사용하는 냉동고스트는 -20 °C에있는 챔버 내부의 평평한 표면을 가지고 있으며, 슬라이스를 신속하게 재고정하는 데 사용합니다. 사용된 극저온에서 비슷한 지점을 찾아 슬라이스가 다시 빠르게 불투명해지는지 확인합니다.
너무 많은 가능성이 있기 때문에 외인성 RNase의 근원을 추적하는 것은 어려울 수 있습니다. 명시적으로 RNase가 없는 유일한 시약은 O.C.T. 및 Azure B입니다. Azure B가 이전에 만족스럽게 수행한 경우 이 시약이 문제가 되지 않았지만 O.C.T.의 새 병을 시도해 보십시오. RNase 가없는 시약은 다른 공급 업체에서도 교체 할 수 있습니다. 훨씬 더 가능성이 소스는 조사자입니다. 작업 영역의 철저한 정리 외에도 다른 랩 멤버가 따라가서 절차의 모든 단계를 관찰하는 것이 종종 유용합니다. 이 절차를 일상적으로 수행 하지 않는 사람이 더라도, 눈의 신선한 세트 오염의 그렇지 않으면 주목 소스를 선택할 수 있습니다.
다른 척수 세포에서 RNA를 복구하는 이 프로토콜을 확장, 다른 종에서 척수 세포에서, 또는 다른 장기의 특정 세포 유형에서 외설하는 동안 관심세포의 명확한 식별을 달성하기위한 여러 영역에서 수정이 필요합니다, 또는 적어도 최소화, 내인성 RNase의 영향. 여기서 프로토콜에서, 70% 에탄올에 있는 Azure B 염색과 결합된 코드의 급속한 제거 및 동결은, RNA 분해의 최소화 및 운동 신경 세포 바디의 쉬운 식별을 둘 다 허용했습니다. Azure B는 RNA3에 결합하는 것처럼 보이는 뉴런을 위한 잘 확립된 히스토케미컬 얼룩으로, 신경퇴행성 질환 환자로부터 뇌 조직의 부검 샘플에서 뉴런의 RNA 함량을 평가하는 데 사용되어 왔다6. 특히 Azure B 염색은 정제된 RNA의 무결성 또는 역전사 및 분석기능에 영향을 미치지 않았습니다. 크레실 바이올렛7 및 톨루이딘 블루8과 같은 다른 염료는 유사한 LMD 프로토콜에 사용되어 왔다. 그(것)들이 해부된 으로 구아니딘 thiocyanate 용액으로 직접 세포 바디를 수집하는 것은 그대로 RNA의 일상적인 복구귀착되는 마지막 단계를 제공했습니다.
유사한 접근법은 다른 세포와 장기를 위해 구상될 수 있고, 내인성 RNases에 의한 RNA 분해를 방지하는 동안 관심 있는 세포를 식별하는 것이 성공적인 분석을 위한 중요한 요구 사항임을 인식할 수 있다. 췌장과 같은 RNase의 높은 수준을 갖는 조직에서, 급속한 취급 및 저온은 시각화를 위한 그들의 자연적인 자동 형광을 이용하여, β 세포에서 RNA의 복구를 허용하기 위하여 결합되었습니다9. 신원 확인을 위해 항체 염색을 이용한 절차도10을보고되었지만, 우리의 손에 완전히 성공하지는 못했습니다. 마지막으로, 많은 마우스 모델은 LMD 현미경의 조직 섹션에서 이를 식별하는 데 사용될 수 있는 관심 있는 세포에서 형광 융합단백질(즉, GFP, YFP, RFP)을 발현하는 것을 사용할 수 있다. 사실, 우리가 이 프로토콜로 분석한 마우스 긴장은 SOD1과 YFP11사이의 융합 단백질을 발현하고, 그들의 척수 모터 뉴런은 높게 형광이다. 그러나 O.C.T.를 동시에 제거하고, RNase 활동을 억제하고, LMD에 의한 운동 뉴런의 시각화와 회복을 가능하게 하는 충분한 YFP 형광을 일관되게 유지하는 에탄올 세차및/또는 탈수 조건 세트를 찾을 수 없었습니다. 아마도 새로운 형광 단백질 또는 유기 용매에서 형광을 유지하는 사용 가능한 것들의 변이체는 이러한 한계를 극복하기 위해 발견 될 수있다.
Disclosures
저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 도움이 토론을 조지 파와 호지 연구실의 구성원에게 감사드립니다. 이 작품은 하워드 휴즈 의학 연구소에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Webster Veterinary | 26637041101 | Any source approved by the institutional veterinary service |
| Dissection tools (scissors, forceps, etc.) | Any convenient source of high-quality dissection instruments | ||
| Cryostat | Leica Microsystem | CM3050S | Other cryostats should be suitable |
| LMD6000 B | Leica Microsystem | Other LMD systems have not been tested | |
| RNase-free PEN-membrane 2 μm slides | Leica Microsystem | 11505189 | Other slide types have been tested and do not perform well |
| RNeasy Micro kit (50) | Qiagen | 74004 | Any kit that uses guanidine thiocyanate lysis buffer and has been tested for recovering small quantities of RNA can be used |
| Agilent 2100 BioAnalyzer | Agilent Technologies | G2939A | |
| Azure B Certified | MP Biomedicals | 190520 | Critical! Product from any source has to be tested before use for its ability to maintain RNA integrity |
| PBS | Sigma Life Science | D8537 | Any reliable source of RNase-free PBS |
| RNA Ethanol 70% (made with DEPC treated water) | American Bioanalytical | AB04010-00500 | Any reliable source, can be lab-made |
| Water, RNase-free, Endotoxin tested (treated with DEPC to eliminate RNase) | American Bioanalytical | AB02128-00500 | Any reliable source, can be lab-made |
| RNase AWAY | Invitrogen Life Technologies | 10328-011 | Other similar RNase removal reagents, such as RNaseZAP (also from Invitrogen) can be used |
| 2-Methylbutane | Electron Microscopy Sciences | 78-78-4 | Any source |
| Maxymum Recovery microfuge tubes (0.6 and 1.5 ml) and pipette tips | Axygen | 311-03-051 & 311-09-051 | Ultra-low retention, RNase free tubes and tips; test other manufacturer's products before using |
| O.C.T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryomold Intermediate Size | Tissue-Tek | 4566 | |
| Lab wipes (Kimwipes) | KIMTECH | 34155 |
References
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