Summary
Высококачественная общая РНК была подготовлена из клеточных тел моторных нейронов спинного мозга мыши путем лазерного захвата микроперемида после окрашивания секций спинного мозга с Azure B в 70% этанола. Достаточное количество РНК (40-60 нг) восстанавливается у 3000-4000 моторных нейронов, чтобы позволить вниз по течению анализ РНК РНК-сек и qRT-PCR.
Abstract
Подготовка высококачественной РНК из клеток, представляющих интерес, имеет решающее значение для точного и содержательного анализа транскрипционных различий между типами клеток или между одним и тем же типом клеток в области здравоохранения и болезней или после фармакологического лечения. В спинном мозге, такой препарат от моторных нейронов, цель интереса во многих неврологических и нейродегенеративных заболеваний, осложняется тем, что двигательные нейроны составляют <10% от общей популяции клеток. Для решения этой проблемы была разработана микродиссеция лазерного захвата (LMD). Здесь мы описываем протокол для быстрого восстановления, замораживания и секции спинного мозга мыши, чтобы избежать повреждения РНК эндогенными и экзогенными RNases, а затем окрашивание с Azure B в 70% этанола для идентификации моторных нейронов при сохранении эндогенных RNase ингибируется. LMD затем используется для захвата окрашенных нейронов непосредственно в гуанидин тиоцианат лиза буфера, поддержание целостности РНК. Стандартные методы используются для восстановления общей РНК и измерения ее целостности. Этот материал может быть использован для анализа стенограмм РНК-сек и qRT-PCR ниже по течению.
Introduction
В тканях млекопитающих, состоящих из нескольких различных типов клеток, появление лазерного захвата микродиссекции (LMD) приборов предоставила возможность выбрать конкретный тип клеток для анализа на уровне РНК или белка. В настоящее время методы усиления и секвенирования следующего поколения позволяют использовать пул общей РНК из нескольких тысяч ячеек для получения относительно тщательной инвентаризации транскриптома, включая оценку относительных уровней РНК и идентификацию различных сращиваемых форм. На сегодняшний день протеомический анализ нескольких тысяч клеток будет достигать вниз через только более обильные виды. Например, мы определили < 1000 из наиболее распространенных белков из 3000-4000 моторных нейронов клеток тела (не показано), и Чжу и коллеги недавно сообщили выявления 2665 белков из 15000 опухолевыхклеток 1. Однако с дальнейшим развитием массовой спектрометрии, вероятно, такие анализы будут распространяться на гораздо большую глубину.
Здесь мы представляем специальный протокол, используемый для LMD моторных нейронных клеток органов из спинного мозга мышей, а затем препарат РНК. Этот протокол был использован в контексте сравнения РНК от моторных нейронов предсимптомных трансгенных трансгенных мутантов супероксид дисмутазы (SOD)1 боковой амиотрофический склероз (ALS) мышей с РНК, подготовленных из дикого типа SOD1 трансгенного штамма как РНК-сек и qRT-PCRпроверки 2. Примечательно, что моторные нейроны, в передней рог серого вещества в спинном мозге, составляют <10% от общей популяции клеток, окруженных морем астроцитов, и как таковой, их транскрипционные профиль не может быть легко деконволюционных исследований всего мозга. Таким образом, подход к лазерному захвату идеально подходит для анализа экспрессии РНК в этих клетках, при этом физиология сохраняется путем быстрого и замораживания шнура после краткой интракардиарной солевой перфузии. Моторные нейроны сомата являются большими и, таким образом, легко обнаружить, здесь с помощью красителя, который имеет сильное сродство кнейронам 3. Кроме того, при таком размере эти клетки обеспечивают относительно большое количество РНК на захваченную клетку. Процедура, используемая, как описано ниже, может быть легко скорректирована для получения других типов нейронных клеток, а также потенциально других типов клеток, специально определенных либо методы окрашивания красителя или окрашивания антителами.
Protocol
Процедуры, описанные здесь для анестезии, эвтаназии и сердечной перфузии мышей, были выполнены в соответствии с протоколом, утвержденным Комитетом по институциональному уходу за животными и использованию животных йельского университета.
1. Подготовка инструментов и решений без RNase
- RNase является общим загрязнителем всех лабораторных поверхностей, в том числе скамейки вершины, микропипетты, и исследователь.
- Часто меняют перчатки или регулярно протирают раствором для обеззараживания РНК.
- Инструменты для вскрытия из нержавеющей стали и стеклянная посуда могут быть сделаны без RNase путем нагрева при >200 градусов по Цельсию в течение 1 часа или более. Примечание: Паровая стерилизация не разрушает RNase. Кроме того, протрите раствором для обеззараживания RNase, затем без RNase 70% этанола и высушит воздуха.
- Протрите скамейки вершины, другие лабораторные поверхности и микропайпторы с RNase обеззараживающих раствор, а затем с RNase-бесплатно 70% этанола. Назначьте конкретную лабораторную скамейку или рабочую зону для восстановления и анализа РНК. Примечание: Удалите наконечники выбросов перед вытирая валы труб и оставить их, если это возможно.
- Используйте трубки, микроцентрифуговые трубки, пипетки и микропипютные наконечники, сертифицированные их производителем как без rNase. Рекомендуется использовать очень низкие связывающие советы и микротрубки. Если возможно, используйте недавно открытые коробки или мешки этих компонентов и держите их отдельно от общего лабораторного питания.
- Получите решения без RNase (без кальция и магния PBS от Dulbecco), этанол, без RNase 70% этанола из коммерческих источников. Используйте недавно открытые бутылки для каждого эксперимента.
- Источник красителя Azure B имеет решающее значение для успешного восстановления нетронутой РНК. Проверьте каждую партию красителя, прежде чем совершать драгоценные образцы для окрашивания и сбора. Соберите несколько тысяч нейронов из некспериментального животного, подготовить РНК, и определить целостность РНК, как описано ниже, чтобы найти тот, который последовательно производит RIN номера выше 8,5.
- Растворите краситель Azure B (1%, wt/vol) в RNase-свободном 70% этаноле, типично 0.3 g в 30 мл этанола в пробке центрифуги 50 мл. Хорошо смешайте на рокер на RT на ночь или до тех пор, пока все частицы растворились. Одна трубка этого решения может быть использована для окрашивания нескольких слайдов, не влияя на интенсивность окрашивания.
- В качестве меры предосторожности используйте различные трубки пятна для каждого биологического репликации.
- Используйте криомолдс и O.C.T. для встраивания секций шнура без дальнейшего лечения.
- Поддерживайте криостат при -20 до -24 градусов по Цельсию. После секции поместите горки в морозильную камеру -80 градусов по Цельсию до тех пор, пока не будет подготовлено достаточное количество. Начните подготовку РНК как можно скорее после того, как слайды были сделаны. Для длительного хранения держите неразделеные или частично секционые блоки OCT, а не слайды, при 80 градусах Цельсия.
- Сделать гуанидин тиоцианат буфер для подготовки РНК из расчлененных моторных нейронов с использованием решений, предоставляемых производителем комплекта подготовки РНК в соответствии с его направлениями.
2. Подготовка секций спинного мозга от мышей (рисунок 1A)
- Очистите все инструменты для вскрытия, стеклянные горки, лезвия бритвы и платформу для вскрытия, выпекая или вытирая раствором rNase для обеззараживания, за которым следует без rNase 70% этанола. Дайте высохнуть в течение 2 мин. Держите все без пыли, покрывая лабораторные салфетки.
- Процедуры обращения с животными, включая анестезию, перфузию сердца и эвтаназию, должны проводиться в соответствии с требованиями местного институционального комитета по уходу за животными и использованию (IACUC), с целью быстрого доведения животного до точки вскрытия спинного мозга.
- Обезболизовать мышь путем внутриперитонеальной (ip) инъекции смертельной дозы кетамина (450 мг/кг).
- После того, как глубокий уровень анестезии достигается и подтверждается отсутствием ответа на боль в ногу, положение мыши брюшной стороне вверх на платформу вскрытия (пенополистирола борту, например), открыть грудную полость, чтобы разоблачить сердце, и вставить 27 G бабочка иглы инфузии набор в левый желудочек (который находится справа от следователя). Ник правого атриума с острыми типсами, и perfuse с PBS со скоростью 5-7 мл/мин в течение 2 мин с помощью перистрального насоса. В этот момент жидкость, вытекающая из атриума, должна быть в значительной степени свободна от крови.
- Снимите перфузионные иглы, обезглавить мышь, и перевернуть его на доске для вскрытия. Откройте кожу, чтобы разоблачить позвоночник, использовать небольшие ножницы и миппы, чтобы удалить позвонки, и поднять спинной мозг при разрыве нервных корешей с острыми типсами. Скорость и практика имеют важное значение при переходе от начала перфузии к удалению шнура; это должно занять не более 7 минут.
- Промыть шнур в течение 10 сек в RNase свободной воды, чтобы смыть остатки крови. Положите спинной мозг на RNase свободной стеклянной слайд с изогнутыми миппами очень мягко, но быстро. Разделите спинной мозг поперечно с помощью чистого лезвия бритвы на 9-10 частей.
- Поместите кусочки в криомольд, наполненный O.C.T., используя те же типсы, и выровнять их вертикально с помощью чистой иглы. Поместите плесень в неглубокий лоток, содержащий 2-метилбутан, предварительно облазолированный жидким азотом, а затем положите лоток в ванну с жидким азотом, чтобы быстро заморозить части спинного мозга, чтобы избежать деградации РНК.
- Храните блок, встроенный в OCT, при -80 градусов по Цельсию в течение 6 месяцев до секции. Процесс от извлечения шнура до замораживания должен быть сделан в течение 5 минут для поддержания целостности РНК.
- Cryosection O.C.T.-встроенный блок при -20 градусов по Цельсию с криостаном для производства 20 мкм ломтиков, каждый из которых содержит 9-10 поперечных сечений спинного мозга, на RNase-бесплатно ПЕН-мембраны 2 мкм слайды хранятся первоначально при комнатной температуре, чтобы обеспечить, чтобы разделы придерживаться слайда. Немедленно заморозить секцию на поверхности -20 градусов по Цельсию внутри криостата. Держите слайды на -80 градусов по Цельсию до тех пор, пока используется.
3. Окрашивание секций спинного мозга (рисунок 1A)
- На чистой стойке устроят шесть 50 мл конических трубок. Заполните все из них 25-30 мл RNase-бесплатно 70% этанола, так что глубина достаточна, чтобы покрыть все разделы на слайде, когда слайд погружается. Сделайте 30-35 мл решения Azure B 1%, как описано ранее, и держите его на одной стойке, чтобы свести к минимуму время между изменением решений во время стирки или окрашивания. Держите три или четыре лабораторных салфетки перед стойкой, чтобы быстро слить дополнительное решение.
- Возьмите горки из морозильника -80 градусов по Цельсию на сухой лед. Оттепель один слайд, поставив его на ладонь в перчатках. Удалите большую часть влаги и конденсата на слайде, вытирая его с лабораторным протрите, будьте осторожны, чтобы не коснуться разделов. Положите слайд на свежий кремнезем гель desiccant в чашку Петри в течение 30-40 сек, чтобы высохнуть полностью. Если влажность в лаборатории высока, краткое лечение в вакууме dessicator может быть использован для сухой слайд быстрее.
- Мытье и окрашивание.
- Опустите высушенную горку в первую трубку без 70% этанола без RNase. Замочите слайд в течение 30 сек, а затем мыть слайд, чтобы удалить OCT, окунув его вверх и вниз в течение 45-60 сек . Возьмите слайд из раствора и слейте лишнюю жидкость на лабораторных салфетках. Повторите тот же процесс, окунув слайд во вторую трубку 70% этанола. Если ОКТ вокруг секций спинного мозга не полностью исчезла, повторите стирку в третьей трубке.
- После слива избыточной жидкости, погрузите слайд в 1% Azure B раствор в 70% RNase-бесплатный этанол в течение 30-45 сек. Слейте излишки Azure B на лабораторный салфетки; на этом этапе весь слайд будет синим.
- Погрузите слайд в следующей трубке 70% этанола, и окунуться вверх и вниз быстро 3-4x, чтобы удалить избыток красителя и сделать конкретные двигательные нейроны окрашивания видны. Если секции выглядят очень темно окрашенных, повторите destaining шаг в свежей трубке 70% этанола. Если окрашивание кажется слишком легким, верните слайд в решение Azure B еще на 30 сек и повторите destaining. Протрите избыток этанола и высушите слайд в течение 40 сек, пока вся жидкость не исчезнет. Серое вещество будет светло-голубым, в то время как моторные нейроны будут окрашены в темно-синий цвет, который легко виден. Немедленно начните вскрытие.
4. Лазерная захвата микродиссекции (LMD) (рисунок 1B)
- Включите микроскоп и выгрузите держатель трубки, чтобы прикрепить крышку 0,6 мл микрофуза трубки для сбора образцов. Положите 30 йл гуанидина тиоцианата лиза буфера в крышку 0,6 мл микрофузы трубки. Обложка поверхности крышки с жидкостью путем распространения раствора с помощью наконечника пипетки. Таким образом, все собранные нейроны будут растворяться в растворе раствора, как они вскрыты. Выровнять крышку с отверстием и цель с микроскопом программного обеспечения. Держите крышку в положении прикрытой до начала лазерного захвата.
- Поместите высушенную в воздухе горку на сцену микроскопа LMD вверх дном, так что мембрана слайда ПЕН-оболочки лицом вниз. Мембрана с секциями должна вы лицеть отверстие, под которым находится коллекторская трубка.
- Включите лазер за 10 минут до начала подготовки слайда. Сосредоточьтесь на секции спинного мозга с целью 5X. Переход к цели 20X для вскрытия.
- Отметьте «пустышка» областью с помощью легкой ручки и позвольте лазеру вырезать ее, не собирая ее. Это расслабляет пен-мембрану и позволяет последовательно отмечать и резать несколько областей.
- Переориентировать и определить моторные нейроны в области брюшного рога. Эти нейроны узнаваемы по их местоположению, их пирамидальной морфологии, их большого размера, и их темно-синего окрашивания с Azure B (Рисунок 2).
- Используя световую ручку, выберите инструмент рисования и отметь вдоль края моторных нейронов, делая полный контур. Попробуйте сделать контур как можно ближе к моторному нейрону, чтобы избежать загрязнения от клеток, кроме моторного нейрона. (Проверить некоторые разделы заранее, чтобы увидеть, насколько широка лазерная линия разреза и настроить клиренс по мере необходимости.) Отметь несколько ячеек перед резки; программное обеспечение будет помнить позиции.
- Принесите крышку под положение резки, нажав на положение крышки. Нажмите кнопку запуска, чтобы инициировать рассечение моторных нейронов с помощью лазера. Соберите все моторные нейроны из всех секций на одном слайде в крышку одной трубки микрофуза.
- После завершения сбора выньте трубку микротекут из держателя, разгрузив лоток и аккуратно выбив трубку. Полностью растворить моторные нейроны в буфере, трубя раствор вверх и вниз. Перемести раствор в корпус трубки, центрифугировать при 14 000 х г в течение 2 мин при 4 градусах Цельсия. Заморозить образец немедленно в сухом льду и хранить его при -80 градусов по Цельсию. Этот процесс, от слайда окрашивания через двигатель нейронов сбора, должно быть сделано в течение 30 минут для одного слайда, чтобы свести к минимуму деградацию РНК.
5. Подготовка РНК от моторных нейронов
Оттепель все собранные нейроны от одного животного и объединить их вместе, чтобы извлечь РНК. Образцы могут выглядеть бледно-голубыми в зависимости от количества моторных нейронов (окрашенных Лазурным цветом B) в них. Экстракт РНК с использованием подходящего комплекта в соответствии с протоколом, предусмотренным для ткани LMD, eluting в минимально возможном объеме. Возьмите 1 мкл, чтобы проверить количество и целостность образца. Быстро заморозить оставшуюся РНК на сухом льду и хранить при -80 градусов по Цельсию.
6. Определение качества и количества РНК
Определите качество РНК с помощью образца 1 мкл на чипе микрофлюиды капиллярного электрофориса в соответствии с протоколом производителя. Всего рнк препаратов с РНК Целостность номер (RIN) выше 8,5 могут быть использованы для РНК-сек и qRT-PCR. Выход данных также обычно включает примерную концентрацию выборки.
Representative Results
Протокол, изложенный выше, и на рисунке 1 должен производить 50 нг или более от общего количества РНК с RIN >8,5 от 3000-4000 спинного мозга двигательных нейронов органов, расчлененных из 9-10 20 мкм ломтиками около 20 ПЕН слайдов. Поскольку это количество слайдов составляет менее 10% от O.C.T.-встроенный блок спинного мозга мыши, можно вернуться в блок, который был сохранен при -80 градусов по Цельсию, и сократить больше ломтиков, чтобы пройти через еще один раунд подготовки РНК. Если для анализа требуется большее количество РНК, то лучше сделать только количество слайдов (например, 20) за один раз, которые могут быть обработаны путем вскрытия и подготовки РНК в течение нескольких дней, а затем сделать больше слайдов для второго раунда и объединить продукты. Не забудьте проверить RIN каждого препарата, чтобы избежать объединения хороший с плохим. Методы РНК-сек становятся все более чувствительными, а новые технологии ПЦР обещают более высокую чувствительность, чем нынешние. Таким образом, меньше РНК от меньшего количества нейронных клеток органов потребуется, что позволяет большую глубину последовательности и более полную проверку интересных хитов. С другой стороны, полное соблюдение рекомендаций МИЗЭ для анализа и проверки4 qRT-PCR может потребовать больших сумм для обеспечения необходимых контрольных реакций для низкоо изобилия РНК.
На рисунке 2 показана типичная серия изображений части брюшного рога спинного мозга после окрашивания и вскрытия Azure B. В панели А, большие, темно окрашенные тела клеток моторных нейронов, подтвержденных анти-Чатантитела окрашивания 2, и легко отличить от небольших соседних клеток. Панель B показывает ту же область с отдельными телами клеток, очерченными световой ручкой и проумеровано программным обеспечением микроскопа. Очертания внимательно следить за полями клеток органов, с небольшим пособием для резки шириной лазера. Это расстояние должно быть определено для каждого параметра мощности лазера, чтобы свести к минимуму включение посторонних материалов, избегая при этом потери цитозола моторных нейронов. Панели C и D показывают раздел после того, как лазер разрезается и отдельные тела клеток упали в крышку коллекции. Обратите внимание, что режущие поля точно не следовать свету контур пера в панели C, но в значительной степени остаться за его пределами. Эта неровностями очевидна в панели D, как и затемненная область вокруг каждого разреза, которая отражает тепловое повреждение ткани, вызванное лазером. Из-за этого, если два тела клеток очень близко друг к другу, лучше изложить их для одного разреза, а не пытаться сократить их отдельно и потерять некоторые РНК тепла повреждения в их области ближнего контакта.
На рисунке 3 показаны типичные результаты электрофоретического анализа целостности РНК образца РНК, подготовленного из 4000 тел моторных нейронов мыши, собранных LMD. Верхняя панель — это электроферограмма, вырабатываемая 1 мл общей РНК; вставка справа является изображением геля. В обоих, обратите внимание на видные рибосомные пики РНК. Нижняя панель является электроферограммой полосы, содержащей стандарты размера РНК. Программное обеспечение для анализа вычислило RIN 9,8 для этой выборки, с концентрацией 4,9 нг/дл. В общей сложности 13 зл этого решения было доступно после анализа, обеспечивая 64 нг РНК для вниз по течению qRT-PCR проверки суммы стенограммы. Для типичного анализа qRT-PCR умеренно обильные стенограммы, 0,15-0,20 нг от общего КОЛИЧЕСТВА достаточно для получения точнойколичественной оценки 2, так что количество РНК, доступных из этого препарата достаточно для проверки ряда стенограмм с несколькими наборами грунтовки,как рекомендуется 4. Конечно, большие объемы входной РНК могут быть использованы для проверки редких стенограмм. Эта сумма также более чем достаточна для подготовки библиотеки и РНК-сек следующего поколения.
Рисунок 1. Обзор производства ломтик спинного мозга и лазерного захвата микропересасывания спинного мозга двигательных нейронов клеток органов. A)Основные шаги в производстве ломтиков и окрашивания. B) Мультфильм зрения спинного мозга раздел и лазерного вскрытия. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
Рисунок 2. До и после изображения лазерного вскрытия Azure B окрашенных моторных нейронов клеток органов. A)Часть брюшного рога окрашенной секции. Обратите внимание на четыре больших, темно окрашенных клеток. Есть также несколько слегка окрашенных и несколько меньших клеток, которые не являются моторными нейронами (подтверждено анти-Чат антитела окрашивания; не показано, но см. Bandyopadhyay2) и которые не будут выбраны для вскрытия. Многие небольшие темные пятна, вероятно, являются нейронными процессами (дендриты и аксоны), но это не было подтверждено. B)Четыре тела клеток, очерченные световой ручкой. Обратите внимание, что контуры внимательно следуют за полями ячеек с минимальным расстоянием между ними. Это расстояние должно быть установлено эмпирически для каждого микроскопа и лазера. Программное обеспечение номера отдельных нейронов, что упрощает отслеживание того, сколько было собрано. C и D) После того, как лазер разрезается и части, содержащие тела клеток упали в крышку коллекции. Обратите внимание, что отверстие, оставленное позади, несколько больше контура и является нерегулярным. Это отражает ширину лазерного луча и его слегка переменную эффективность резки в зависимости от местного состава ткани. Также очевидным является край затемненной ткани, окружающей каждое отверстие из-за повреждения местного отопления, вызванного лазером.
Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
Рисунок 3. Электрофоретический анализ целостности РНК, подготовленный из образцов ЛМД. A) Алицит 1 мкл РНК, подготовленный из 4000 моторных нейронных клеток тела по вышеупомянутому протоколу, был проанализирован микрокапильярной электрофорезом на микрофлюиде чипа. Электроферограмма показана, с выдающимися рибосомных пиков РНК. Справа находится изображение самого геля. B) Показана электроферограмма стандартов размера с соответствующей полосой геля справа. Программное обеспечение прибора вычислило RIN 9.8 для этой выборки и концентрации 4.9 ng/l. Нажмите здесь, чтобы просмотреть большее изображение.
Discussion
Наиболее значительным показателем успеха этого протокола для производства общей РНК с помощью лазерного микропересасывания ломтиков спинного мозга является значение RIN5. Для образцов РНК из более высоких эукариот значения выше 8,5 регулярно дают высококачественное секвенирование и данные qRT-PCR. Если урожайность низкая, но качество высокое, повторите препарат. Если целостность ниже (даже 7,5-8), однако, лучше найти источник проблемы и попробовать еще раз. Есть много шагов, где что-то может пойти не так, но на самом деле только два источника проблемы - эндогенное загрязнение RNase или экзогенного загрязнения RNase. Первый из них может быть решен на практике, так что время от жертвоприношения мыши до замораживания его O.C.T-встроенный шнур сводится к минимуму. Другой момент в протоколе, где эндогенные RNase может способствовать плохой результат во время подготовки ломтиков. Каждый срез должен быстро прилипать к комнатной температуре ПЕН-слайда, но он будет таять (О.C.Т. становится ясно). Чем быстрее ломтик может быть перерезаны, тем лучше. Криостат, который мы используем, имеет плоские поверхности внутри камеры, которые находятся на -20 градусов по Цельсию, которые мы используем, чтобы быстро заморозить ломтик. Найти аналогичное место в криостат используется и убедитесь, что срез становится непрозрачным снова быстро.
Отслеживание источников экзогенных RNase может быть трудно, потому что Есть так много возможностей. Единственными реагентами, которые используются не только без RNase, являются O.C.T. и Azure B. Если Azure B раньше выполнялся удовлетворительно, попробуйте свежую бутылку O.C.T., хотя этот реагент никогда не был проблемой. Реагенты без RNase также могут быть заменены, даже у другого поставщика. Гораздо более вероятным источником является следователь. В дополнение к тщательной очистке рабочей зоны, часто полезно, чтобы другой член лаборатории следовать вместе и наблюдать все шаги в процедуре. Даже если это тот, кто обычно не выполняет эту процедуру, свежий набор глаз может забрать в противном случае незамеченным источником загрязнения.
Расширение этого протокола для восстановления РНК из других клеток спинного мозга, из клеток спинного мозга от других видов, или от конкретных типов клеток в других органах потребует изменений в нескольких областях, направленных на достижение четкой идентификации клеток, представляющих интерес при одновременном прекращении, или, по крайней мере, минимизации, влияние эндогенных RNase. В протоколе здесь, быстрое удаление и замораживание шнура, в сочетании с окрашиванием Azure B в 70% этанола, позволило как минимизации деградации РНК и легко идентификации моторных нейронов клеток органов. Azure B является устоявшимся гистохимическим пятном для нейронов, которое, как представляется, связываютсяс РНК 3 и был использован для оценки содержания РНК нейронов в образцах вскрытия тканей мозга у пациентов с нейродегенеративнымзаболеванием 6. Примечательно, что окрашивание Azure B не повлияло ни на целостность очищенной РНК, ни на ее способность быть обращенным вспять и проанализированным. Другие красители, такие как cresylфиолетовый 7 и толуидинсиний 8 были использованы в аналогичных протоколах LMD. Сбор тел клеток непосредственно в гуанидин тиоцианат решение, как они были вскрыты при условии, последний шаг, который привел к обычному восстановлению нетронутыми РНК.
Аналогичные подходы можно предусмотреть и для других клеток и органов, признавая, что определение клеток, представляющих интерес при минимизации или, желательно, предотвращение деградации РНК эндогенными РНК является критическим требованием для успешного анализа. В тканях, которые имеют высокий уровень RNase, таких как поджелудочная железа, быстрая обработка и низкая температура были объединены, чтобы позволить восстановление РНК из β-клеток, воспользовавшись их естественной аутофторесценции длявизуализации 9. Процедуры с использованием антител окрашивания для идентификации также былизарегистрированы 10, но не были полностью успешными в наших руках. Наконец, многие модели мыши доступны, которые выражают флуоресцентные белки синтеза(т.е. GFP, YFP, RFP) в клетках, представляющих интерес, которые могут быть использованы для их идентификации в тканях разделов на микроскоп LMD. В самом деле, штаммы мыши мы проанализировали с помощью этого протокола выразить синтез белка между SOD1 и YFP11, и их спинного мозга двигательных нейронов очень флуоресцентные. Мы не смогли, однако, найти набор этанола моет и / или обезвоживания условиях, которые будут одновременно удалить O.C.T., подавляют RNase деятельности, и последовательно поддерживать достаточную флуоресценцию YFP, чтобы визуализация моторных нейронов и их восстановления LMD. Возможно, новый флуоресцентный белок или вариант доступных, который поддерживает флуоресценцию в органических растворителей можно найти, чтобы преодолеть это ограничение.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Джорджа Фарра и членов лаборатории Хорвича за полезные дискуссии. Эта работа была поддержана Медицинским институтом Говарда Хьюза.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Webster Veterinary | 26637041101 | Any source approved by the institutional veterinary service |
| Dissection tools (scissors, forceps, etc.) | Any convenient source of high-quality dissection instruments | ||
| Cryostat | Leica Microsystem | CM3050S | Other cryostats should be suitable |
| LMD6000 B | Leica Microsystem | Other LMD systems have not been tested | |
| RNase-free PEN-membrane 2 μm slides | Leica Microsystem | 11505189 | Other slide types have been tested and do not perform well |
| RNeasy Micro kit (50) | Qiagen | 74004 | Any kit that uses guanidine thiocyanate lysis buffer and has been tested for recovering small quantities of RNA can be used |
| Agilent 2100 BioAnalyzer | Agilent Technologies | G2939A | |
| Azure B Certified | MP Biomedicals | 190520 | Critical! Product from any source has to be tested before use for its ability to maintain RNA integrity |
| PBS | Sigma Life Science | D8537 | Any reliable source of RNase-free PBS |
| RNA Ethanol 70% (made with DEPC treated water) | American Bioanalytical | AB04010-00500 | Any reliable source, can be lab-made |
| Water, RNase-free, Endotoxin tested (treated with DEPC to eliminate RNase) | American Bioanalytical | AB02128-00500 | Any reliable source, can be lab-made |
| RNase AWAY | Invitrogen Life Technologies | 10328-011 | Other similar RNase removal reagents, such as RNaseZAP (also from Invitrogen) can be used |
| 2-Methylbutane | Electron Microscopy Sciences | 78-78-4 | Any source |
| Maxymum Recovery microfuge tubes (0.6 and 1.5 ml) and pipette tips | Axygen | 311-03-051 & 311-09-051 | Ultra-low retention, RNase free tubes and tips; test other manufacturer's products before using |
| O.C.T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryomold Intermediate Size | Tissue-Tek | 4566 | |
| Lab wipes (Kimwipes) | KIMTECH | 34155 |
References
- Zhu, J., Nie, S., Wu, J., Lubman, D. M. Target proteomic profiling of frozen pancreatic CD24+ adenocarcinoma tissues by immuno-laser capture microdissection and nano-LC-MS/MS. J. Proteome. Res. , (2013).
- Bandyopadhyay, U., et al. RNA-Seq profiling of spinal cord motor neurons from a presymptomatic SOD1 ALS mouse. PLoS ONE. 8 (1), 10-1371 (2013).
- Shea, J. R. A method for in situ cytophotometric estimation of absolute amount of ribonucleic acid using azure B1. J. Histochem. Cytochem. 18 (2), 143-152 (1970).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin. Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol. Biol. 7, (2006).
- Doebler, J. A., Rhoads, R. E., Anthony, A. Neuronal RNA in Pick's and Alzheimer's diseases. Comparison of disease-susceptible and disease-resistant cortical areas. Arch. Neurol. 46 (2), 134-137 (1989).
- Lobsiger, C. S., Boillée, S., Cleveland, D. W. Toxicity from different SOD1 mutants dysregulates the complement system and the neuronal regenerative response in ALS motor neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (18), (2007).
- Ferraiuolo, L., et al. Microarray analysis of the cellular pathways involved in the adaptation to and progression of motor neuron injury in the SOD1 G93A mouse model of familial ALS. J. Neurosci. 27 (34), 9201-9219 (2007).
- Sturm, D., et al. Improved protocol for laser microdissection of human pancreatic islets from surgical specimens. J. Vis. Exp. 6 (71), (2013).
- Burbach, G. J., Dehn, D., Nagel, B., Del Turco, D., Deller, T. Laser microdissection of immunolabeled astrocytes allows quantification of astrocytic gene expression. J. Neurosci. Methods. 138 (1-2), 141-148 (2004).
- Wang, J., et al. Progressive aggregation despite chaperone associations of a mutant SOD1-YFP in transgenic mice that develop ALS. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (5), 1392-1397 (2009).
