Summary
Hochwertige Gesamt-RNA wurde aus Zellkörpern von Maus-Spinalmark-Motorneuronen mittels Lasercapture-Mikrodissektion hergestellt, nachdem Rückenmarksabschnitte mit Azure B in 70% Ethanol gefärbt wurden. Ausreichende RNA (ca. 40-60 ng) wird aus 3.000-4.000 motorischen Neuronen zurückgewonnen, um eine nachgeschaltete RNA-Analyse durch RNA-seq und qRT-PCR zu ermöglichen.
Abstract
Die Herstellung hochwertiger RNA aus von Interesse entosteilen Zellen ist entscheidend für eine präzise und aussagekräftige Analyse der Transkriptionsunterschiede zwischen Zelltypen oder zwischen demselben Zelltyp in Gesundheit und Krankheit oder nach pharmakologischen Behandlungen. Im Rückenmark wird eine solche Vorbereitung aus motorischen Neuronen, dem Ziel von Interesse an vielen neurologischen und neurodegenerativen Erkrankungen, durch die Tatsache erschwert, dass motorische Neuronen <10% der gesamten Zellpopulation ausmachen. Lasercapture Microdissection (LMD) wurde entwickelt, um dieses Problem zu lösen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur schnellen Wiederherstellung, Einfrierung und Schnittmaus Rückenmarks, um RNA-Schäden durch endogene und exogene RNasen zu vermeiden, gefolgt von Färbung mit Azure B in 70% Ethanol, um die motorischen Neuronen zu identifizieren, während endogene RNase gehemmt. LMD wird dann verwendet, um die gefärbten Neuronen direkt in Guanidin-Thiocyanat-Lyse-Puffer zu erfassen, die Integrität der RNA zu erhalten. Standardtechniken werden verwendet, um die gesamte RNA zurückzugewinnen und ihre Integrität zu messen. Dieses Material kann dann für die nachgelagerte Analyse der Transkripte durch RNA-seq und qRT-PCR verwendet werden.
Introduction
In Säugetiergeweben, die aus mehreren verschiedenen Zelltypen bestehen, hat das Aufkommen der Lasercapture Microdissection (LMD)-Instrumentierung die Möglichkeit, einen bestimmten Zelltyp für die Analyse auf RNA- oder Proteinebene auszuwählen. Derzeit ermöglichen Amplifikations- und Next-Gen-Sequenzierungstechniken die Verwendung eines Pools von RNA insgesamt aus einigen tausend Zellen, um eine relativ gründliche Bestandsaufnahme des Transkriptoms zu erhalten, einschließlich der Bewertung der relativen Konzentrationen von RNAs und der Identifizierung verschiedener gespleißter Formen. Bis heute werden Proteomik-Analysen von ein paar tausend Zellen nur durch mehr reichliche Arten reichen. Zum Beispiel haben wir <1.000 der am häufigsten vorkommenden Proteine aus 3.000-4.000 motorischen Neuronenkörpern identifiziert (nicht gezeigt), und Zhu und Kollegen haben kürzlich berichtet, dass sie 2.665 Proteine aus 15.000 Tumorzellen1identifiziert haben. Mit der weiteren Entwicklung der Massenspektrometrie ist es jedoch wahrscheinlich, dass sich solche Analysen bis weit in die Tiefe ausdehnen werden.
Hier stellen wir ein spezifisches Protokoll für LMD von motorischen Neuronenzellkörpern aus dem Rückenmark von Mäusen vor, gefolgt von der Vorbereitung von RNA. Dieses Protokoll wurde im Zusammenhang mit dem Vergleich von RNAs aus motorischen Neuronen präsymptomatischer transgener mutagener Superoxiddismutase (SOD)1 amyotrophe Lateralsklerose (ALS)-Mäuse mit RNAs verwendet, die aus einem wildtypen SOD1-Transgenstamm sowohl durch RNA-seq- als auch durch qRT-PCR-Validierung2hergestellt wurden. Insbesondere machen motorische Neuronen im vorderen Horn der grauen Substanz im Rückenmark <10% der gesamten Zellpopulation aus, umgeben von einem Meer von Astrozyten, und als solches lässt sich ihr Transkriptionsprofil nicht ohne weiteres aus Studien der gesamten Schnur entkrüsten. Ein Laser-Capture-Ansatz ist daher ideal für die Analyse der RNA-Expression in diesen Zellen, wobei die Physiologie durch schnelles Aus- und Einfrieren der Schnur nach kurzer intrakardialer Saline-Perfusion erhalten bleibt. Motorneuron somata sind groß und sind daher leicht nachweisbar, hier mit einem Farbstoff, der eine starke Affinität zu Neuronenhat 3. Darüber hinaus bieten diese Zellen bei einer solchen Größe eine relativ große Menge an RNA pro erfasster Zelle. Das verfahren, wie unten beschrieben, könnte leicht angepasst werden, um andere neuronale Zelltypen sowie potenziell andere Zelltypen zu erhalten, die speziell entweder durch Farbstofffärbungstechniken oder durch Antikörperfärbung identifiziert werden.
Protocol
Die hier beschriebenen Verfahren für Anästhesie, Euthanasie und Herzdurchblutung von Mäusen wurden im Rahmen eines Protokolls durchgeführt, das vom Institutionellen Tierpflege- und Gebrauchsausschuss der Yale University genehmigt wurde.
1. Vorbereitung von RNase-freien Instrumenten und Lösungen
- RNase ist eine häufige Verunreinigung aller Laboroberflächen, einschließlich Tischplatten, Mikropipetten und des Prüfers.
- Wechseln Sie die Handschuhe häufig oder regelmäßig mit einer RNAse-Dekontaminationslösung ab.
- Edelstahl-Sezierwerkzeuge und Glaswaren können Durch Erhitzen bei >200 °C für 1 Stunde oder mehr rNase-frei gemacht werden. Hinweis: Die Dampfsterilisation zerstört RNase nicht. Alternativ mit einer RNase-Dekontaminationslösung abwischen, dann mit RNase-freiem 70% Ethanol und lufttrocken.
- Wischen Sie Tischplatten, andere Laboroberflächen und Mikropipettoren mit RNase-Dekontaminationslösung, dann mit RNase-freiem 70% Ethanol. Legen Sie einen bestimmten Labortisch oder Arbeitsbereich für die RNA-Wiederherstellung und -Analyse fest. Hinweis: Entfernen Sie die Spitzenauswerfer, bevor Sie die Wellen der Pipettierer abwischen, und lassen Sie sie nach Möglichkeit ab.
- Verwenden Sie Rohre, Mikrozentrifugenrohre, Pipetten und Mikropipettenspitzen, die vom Hersteller als RNase-frei zertifiziert sind. Die Verwendung von sehr niedrigen Bindungsspitzen und Mikrorohren wird empfohlen. Verwenden Sie nach Möglichkeit frisch geöffnete Kisten oder Beutel dieser Komponenten und halten Sie sie von der allgemeinen Laborversorgung getrennt.
- Erhalten Sie RNase-freie Lösungen [Dulbeccos Calcium- und Magnesium-freies PBS (PBS), Ethanol, RNase-freies 70% Ethanol] aus kommerziellen Quellen. Verwenden Sie für jedes Experiment neu geöffnete Flaschen.
- Die Quelle des Azure B-Farbstoffs ist entscheidend für die erfolgreiche Wiederherstellung intakter RNA. Testen Sie jede Charge Farbstoff, bevor Sie wertvolle Proben zur Färbung und Sammlung verpflichten. Sammeln Sie ein paar tausend Neuronen von einem nicht-experimentellen Tier, bereiten Sie RNA vor und bestimmen Sie die RNA-Integrität, wie unten beschrieben, um eine zu finden, die konsistent RIN-Zahlen über 8,5 produziert.
- Azure B-Farbstoff (1%, wt/vol) in RNase-freiem 70% Ethanol auflösen, typischerweise 0,3 g in 30 ml Ethanol in einem 50 ml Zentrifugenrohr. Mischen Sie gut auf einer Wippe bei RT über Nacht oder bis alle Partikel gelöst haben. Ein Rohr dieser Lösung kann verwendet werden, um mehrere Dias zu färben, ohne die Färbeintensität zu beeinflussen.
- Verwenden Sie vorsorglich für jede biologische Vermehrung ein anderes Fleckrohr.
- Verwenden Sie die Kryomolde und O.C.T. zum Einbetten von Kabelabschnitten ohne weitere Behandlung.
- Halten Sie den Kryostat bei -20 bis -24 °C. Nach dem Schnitt die Dias in einen -80 °C-Gefrierschrank geben, bis eine ausreichende Anzahl vorbereitet ist. Beginnen Sie die RNA-Vorbereitung so schnell wie möglich, nachdem die Dias gemacht wurden. Für die Langzeitlagerung ungeschnittene oder teilweise geschnittene OCT-Blöcke statt Dias bei 80 °C aufbewahren.
- Machen Sie den Guanidin-Thiocyanat-Puffer für die RNA-Vorbereitung aus den sezierten motorischen Neuronen unter Verwendung der Vom Hersteller des RNA-Vorbereitungskits bereitgestellten Lösungen entsprechend seinen Anweisungen.
2. Vorbereitung von Rückenmarksabschnitten von Mäusen (Abbildung 1A)
- Reinigen Sie alle Sezierwerkzeuge, Glasgletten, Rasierklingen und Sezierplattformen durch Backen oder Wischen mit RNase-Dekontaminationslösung, gefolgt von RNase-freiem 70% Ethanol. 2 min trocknen lassen. Halten Sie alles staubfrei, indem Sie es mit Labortüchern bedecken.
- Tierbehandlungsverfahren, einschließlich Anästhesie, Herzperfusion und Euthanasie, sollten gemäß den Anforderungen des lokalen institutionellen Ausschusses für Tierpflege und -nutzung (IACUC) durchgeführt werden, mit dem Ziel, das Tier rasch an den Punkt der Rückenmarkssektion zu bringen.
- Anästhesisieren Sie die Maus durch intraperitoneale (ip) Injektion einer tödlichen Dosis Ketamin (450 mg/kg).
- Sobald ein tiefes Maß an Anästhesie erreicht und durch das Fehlen einer Zehen-Pinch-Reaktion bestätigt wird, positionieren Sie die Maus-Ventralseite auf einer Sezierplattform (z. B. ein Styropor-Board), öffnen Sie die Brusthöhle, um das Herz freizulegen, und setzen Sie die 27 G Schmetterlingsnadel einer Infusion in den linken Ventrikel (die sich auf der rechten Seite des Prüfers befindet). Nick das rechte Atrium mit einer scharfen Zange, und perfuse mit PBS mit einer Rate von 5-7 ml/min für etwa 2 min mit einer peristaltischen Pumpe. Die aus dem Atrium strömende Flüssigkeit sollte an dieser Stelle weitgehend blutfrei sein.
- Entfernen Sie die Perfusionsnadel, enthaupten Sie die Maus, und drehen Sie sie auf der Sezierplatte um. Öffnen Sie die Haut, um die Wirbelsäule freizulegen, verwenden Sie eine kleine Schere und Zange, um die Wirbel zu entfernen, und heben Sie das Rückenmark heraus, während Sie die Nervenwurzeln mit einer scharfen Zange trennen. Schnelligkeit und Übung sind wichtig, um sich vom Beginn der Perfusion bis zur Entfernung der Schnur zu bewegen; dies sollte nicht mehr als 7 min dauern.
- Spülen Sie die Schnur für 10 Sek. in RNase-freiem Wasser, um Restblut abzuwaschen. Legen Sie das Rückenmark mit einer gekrümmten Zange sehr sanft, aber schnell auf eine RNase-freie Glasrutsche. Teilen Sie das Rückenmark quer mit einer sauberen Rasierklinge in 9-10 Stück.
- Legen Sie die Stücke mit den gleichen Zangen in ein mit O.C.T. gefülltes Kryomold und richten Sie sie vertikal mit einer sauberen Nadel aus. Legen Sie die Form in eine flache Schale mit 2-Methylbutan, das mit flüssigem Stickstoff vorgekühlt ist, und legen Sie das Tablett dann in ein flüssiges Stickstoffbad, um die Rückenmarksstücke schnell einzufrieren, um einen RNA-Abbau zu vermeiden.
- Bewahren Sie den OCT-eingebetteten Block bis zu 6 Monate vor dem Schnitt bei -80 °C auf. Der Prozess vom Abruf der Schnur durch Einfrieren sollte innerhalb von 5 min durchgeführt werden, um die RNA-Integrität zu erhalten.
- Kryosektion des O.C.T.-eingebetteten Blocks bei -20 °C mit einem Kryostat, um 20 m Scheiben mit jeweils 9-10 Rückenmarksquerschnitten auf RNase-freien PEN-Membran-2-m-Dias zu erzeugen, die zunächst bei Raumtemperatur gehalten werden, um sicherzustellen, dass die Abschnitte am Schlitten haften. Den Abschnitt sofort auf einer -20 °C-Oberfläche im Inneren des Kryostats wieder einfrieren. Halten Sie die Dias bei -80 °C, bis sie verwendet werden.
3. Färbung von Rückenmarksabschnitten (Abbildung 1A)
- Auf einem sauberen Rack sechs 50 ml konische Schläuche anordnen. Füllen Sie sie alle mit 25-30 ml RNase-freiem 70% Ethanol, so dass die Tiefe ausreicht, um alle Abschnitte auf einem Dia abzudecken, wenn die Folie eingetaucht wird. Machen Sie 30-35 ml 1% Azure B-Lösung, wie zuvor beschrieben, und halten Sie es auf dem gleichen Rack, um die Zeit zwischen dem Wechsel von Lösungen während des Waschens oder Färbens zu minimieren. Bewahren Sie drei oder vier Labortücher vor dem Rack auf, um die zusätzliche Lösung schnell zu entleeren.
- Die Rutschen aus dem -80 °C-Gefrierschrank auf Trockeneis bringen. Tauen Sie eine Rutsche, indem Sie sie auf eine geliebte Handfläche legen. Entfernen Sie den größten Teil der Feuchtigkeit und Kondensation auf der Folie, indem Sie sie mit einem Laborwisch abwischen, wobei Sie darauf achten, die Abschnitte nicht zu berühren. Die Rutsche auf frischekieselige Gel-Trockenmittel in eine Petrischale für 30-40 Sek. zum vollständigen Trocknen geben. Wenn die Luftfeuchtigkeit im Labor hoch ist, kann eine kurze Behandlung in einem Vakuum-Dessikator verwendet werden, um den Schlitten schneller zu trocknen.
- Waschen und Färben.
- Tauchen Sie das getrocknete Dia in die erste Röhre von RNase-freiem 70% Ethanol. Die Folie 30 Sek. einweichen und dann das OK waschen, um es zu entfernen, indem Sie es 45-60 Sek. nach oben und unten tauchen. Nehmen Sie die Rutsche aus der Lösung und entleeren Sie die überschüssige Flüssigkeit auf Labortücher. Wiederholen Sie den gleichen Vorgang, indem Sie den Schlitten in die zweite Röhre mit 70% Ethanol tauchen. Wenn das OCT um die Rückenmarksabschnitte nicht vollständig verschwunden ist, wiederholen Sie die Wäsche im dritten Rohr.
- Nach dem Ablassen der überschüssigen Flüssigkeit, tauchen Sie die Folie in 1% Azure B-Lösung in 70% RNase-freies Ethanol für 30-45 Sek. Entleeren Sie den überschüssigen Azure B auf einem Lab-Wischvorgang; an dieser Stelle wird die gesamte Folie blau sein.
- Tauchen Sie die Rutsche in der nächsten Röhre von 70% Ethanol, und tauchen Sie schnell auf und ab 3-4x, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen und die spezifische motorische Neuronfärbung sichtbar zu machen. Wenn die Abschnitte sehr dunkel gefärbt aussehen, wiederholen Sie den Entsalzungsschritt in einem frischen Rohr mit 70% Ethanol. Wenn die Färbung zu leicht erscheint, kehren Sie die Folie für weitere 30 Sek. zur Azure B-Lösung zurück, und wiederholen Sie die Detainierung. Wischen Sie das überschüssige Ethanol ab und trocknen Sie den Schlitten 40 Sek. lang an der Luft, bis die gesamte Flüssigkeit weg ist. Die graue Materie wird hellblau sein, während die motorischen Neuronen tiefblau gefärbt werden, was gut sichtbar ist. Starten Sie die Sezierung sofort.
4. Laser Capture Microdissection (LMD) (Abbildung 1B)
- Schalten Sie das Mikroskop ein und entladen Sie den Rohrhalter, um die Kappe eines 0,6 ml Mikrofuge-Rohrs für die Probenentnahme zu befestigen. Legen Sie 30 l Guanidinthiocyanat-Lysepuffer in die Kappe eines 0,6 ml Mikrofuge-Röhrchens. Bedecken Sie die Oberfläche der Kappe mit Flüssigkeit, indem Sie die Lösung mit einer Pipettenspitze verteilen. Auf diese Weise werden alle gesammelten Neuronen in löslicher Lösung gelöst, wie sie seziert werden. Richten Sie die Kappe mit dem Loch und das Objektiv mit der Mikroskop-Software aus. Halten Sie die Kappe in der abgedeckten Position, bis Sie mit der Laseraufnahme beginnen.
- Stellen Sie den luftgetrockneten Schlitten auf die Bühne des LMD-Mikroskops auf den Kopf, so dass die Membran des PEN-Dias nach unten zeigt. Die Membran mit Abschnitten sollte dem Loch gegenüberstehen, darunter das Sammelrohr.
- Schalten Sie den Laser 10 min ein, bevor Sie mit der Folienvorbereitung beginnen. Konzentrieren Sie sich auf einen Rückenmarksabschnitt mit dem 5X Objektiv. Wechseln Sie zum 20X-Ziel für die Zerlegung.
- Markieren Sie einen "dummen" Bereich mit dem Lichtstift und lassen Sie den Laser ausschneiden, ohne ihn zu sammeln. Dies entspannt die PEN-Membran und ermöglicht es, mehrere Regionen nacheinander zu markieren und zu schneiden.
- Neuausrichtung und Identifizierung von motorischen Neuronen im ventralen Hornbereich. Diese Neuronen sind erkennbar an ihrer Lage, ihrer pyramidenförmigen Morphologie, ihrer Größe und ihrer dunkelblauen Färbung mit Azure B (Abbildung 2).
- Wählen Sie mit dem Lichtstift das Zeichenwerkzeug aus und markieren Sie am Rand der Motorneuronen, um einen vollständigen Umriss zu erstellen. Versuchen Sie, die Umrisse so nah wie möglich an das motorische Neuron zu bringen, um eine Kontamination durch andere Zellen als das motorische Neuron zu vermeiden. (Testen Sie einige Abschnitte im Voraus, um zu sehen, wie breit die Laser-Cut-Line ist, und passen Sie den Abstand nach Bedarf an.) Markieren Sie mehrere Zellen vor dem Schneiden; die Software wird sich die Positionen merken.
- Bringen Sie die Kappe unter die Schnittposition, indem Sie auf die Kappenposition klicken. Klicken Sie auf die Starttaste, um die motorische Neuronensektion mit dem Laser zu initiieren. Sammeln Sie alle motorischen Neuronen aus allen Abschnitten auf einem Dia in die Kappe eines Mikrofugerohrs.
- Nach der Abholung nehmen Sie das Mikrofugenrohr aus dem Halter, indem Sie das Fach entladen und das Rohr vorsichtig auslagern. Lösen Sie die Motorneuronen im Puffer vollständig auf, indem Sie die Lösung nach oben und unten pfeifen. Bewegen Sie die Lösung in den Körper des Rohres durch Zentrifugieren bei 14.000 x g für 2 min bei 4 °C. Die Probe sofort in Trockeneis einfrieren und bei -80 °C aufbewahren. Dieser Prozess, von der Gleitfärbung bis zur motorischen Neuronensammlung, sollte innerhalb von 30 min für einen Dia durchgeführt werden, um den RNA-Abbau zu minimieren.
5. RNA-Vorbereitung aus Motorneuronen
Alle gesammelten Neuronen eines Tieres auftauen und bündeln sie zusammen, um RNA zu extrahieren. Die Proben können hellblau aussehen, abhängig von der Anzahl der Motorneuronen (mit Azure B) darin. Extrahieren Sie RNA mit einem geeigneten Kit nach dem Protokoll für LMD-Gewebe vorgesehen, Eluing in dem minimalen Volumen möglich. Nehmen Sie 1 l, um die Menge und Integrität der Probe zu überprüfen. Die restliche RNA auf Trockeneis schnell einfrieren und bei -80 °C lagern.
6. Bestimmung der RNA-Qualität und -Menge
Bestimmen Sie die RNA-Qualität mit der 1-l-Probe auf einem kapillaren Elektrophorese-Mikrofluidik-Chip gemäß dem Herstellerprotokoll. Für RNA-seq und qRT-PCR können insgesamt RNA-Präparate mit einer RNA-Integritätsnummer (RIN) über 8,5 verwendet werden. Die Datenausgabe umfasst in der Regel auch die ungefähre Konzentration der Stichprobe.
Representative Results
Das oben und in Abbildung 1 beschriebene Protokoll sollte 50 ng oder mehr der gesamten RNA mit einer RIN von >8,5 von 3.000-4.000 Spinalmarkmotor-Neuronenkörpern erzeugen, die aus den 9-10 20-m-Scheiben auf etwa 20 PEN-Dias seziert werden. Da diese Anzahl von Dias weniger als 10% eines O.C.T.-eingebetteten Blocks eines Mausrückenmarks darstellt, ist es möglich, zum Block zurückzukehren, der bei -80 °C gespeichert wurde, und mehr Scheiben zu schneiden, um eine weitere Runde der RNA-Vorbereitung zu durchlaufen. Wenn größere Mengen rna für eine Analyse benötigt werden, ist es besser, nur die Anzahl der Dias(z.B. 20) gleichzeitig zu machen, die durch Sezieren und RNA-Vorbereitung in wenigen Tagen verarbeitet werden können, dann mehr Dias für eine zweite Runde zu machen und die Produkte zu kombinieren. Achten Sie darauf, die RIN jeder Zubereitung zuerst zu überprüfen, um zu vermeiden, dass eine gute mit einer schlechten kombiniert wird. RNA-seq-Methoden werden immer empfindlicher und neue PCR-Technologien versprechen eine höhere Empfindlichkeit als aktuelle. Daher wird weniger RNA aus weniger Neuronenkörpern benötigt, was eine höhere Sequenzierungstiefe und eine umfassendere Validierung interessanter Treffer ermöglicht. Andererseits kann die vollständige Einhaltung der MIQE-Empfehlungen für die qRT-PCR-Analyse und Validierung4 größere Mengen erfordern, um die notwendigen Kontrollreaktionen für RNAs mit geringer Häufigkeit zu ermöglichen.
Abbildung 2 zeigt eine typische Serie von Bildern eines Teils eines Spinalband-Ventralhornabschnitts nach Azure B-Färbung und -Sektion. In Panel A sind die großen, dunkel gefärbten Zellkörper motorische Neuronen, die durch Anti-Chat-Antikörperfärbung2bestätigt werden und leicht von kleineren benachbarten Zellen unterschieden werden können. Panel B zeigt den gleichen Bereich mit einzelnen Zellkörpern, die mit dem Lichtstift umrissen und von der Mikroskopsoftware nummeriert werden. Die Umrisse folgen genau den Rändern der Zellkörper, mit einer kleinen Zugabe für die Schnittbreite des Lasers. Dieser Abstand muss für jede Laserleistungseinstellung festgelegt werden, um die Aufnahme von Fremdmaterial zu minimieren und gleichzeitig den Verlust des motorischen Neuronzytosols zu vermeiden. Die Panels C und D zeigen den Abschnitt nach dem Laserschnitt und die einzelnen Zellkörper sind in die Sammelkappe gefallen. Beachten Sie, dass die Schnittmarge nicht genau der Lichtstiftumrisslinie in Panel C folgt, sondern weitgehend außerhalb davon bleibt. Diese Unregelmäßigkeit zeigt sich in Panel D ebenso wie der abgedunkelte Bereich um jeden Schnitt, der die durch den Laser verursachten Wärmeschäden am Gewebe widerspiegelt. Aus diesem Grund, wenn zwei Zellkörper sehr nah beieinander sind, ist es besser, sie für einen einzigen Schnitt zu skizzieren, anstatt zu versuchen, sie getrennt zu schneiden und etwas RNA zu verlieren, um Schäden an ihrer Region des Nahkontakts zu verursachen.
Abbildung 3 zeigt typische Ergebnisse einer elektrophoretischen Analyse der RNA-Integrität einer RNA-Probe, die aus 4.000 Mausmotor-Neuronenkörpern hergestellt wurde, die von LMD gesammelt wurden. Das obere Panel ist das Elektropherogramm, das von 1 l der gesamten RNA erzeugt wird; der Einset auf der rechten Seite ist ein Bild des Gels. Beachten Sie in beiden die markanten ribosomalen RNA-Spitzen. Die untere Platte ist das Elektropherogramm der Spur, die RNA-Größenstandards enthält. Die Analysesoftware berechnete für diese Probe eine RIN von 9,8 mit einer Konzentration von 4,9 ng/l. Nach der Analyse standen insgesamt 13 l dieser Lösung zur Verfügung, die 64 ng RNA für die nachgeschaltete qRT-PCR-Validierung von Transkriptsmengen bereitstellte. Für eine typische qRT-PCR-Analyse von mäßig reichlich Entrunter Transkripten reicht 0,15-0,20 ng der gesamten RNA aus, um eine genaue Quantifizierung2zu erzeugen, so dass die Menge an RNA, die aus dieser Zubereitung zur Verfügung steht, ausreicht, um eine Reihe von Transkripten mit mehreren Primersätzen zu validieren, wieempfohlen 4. Natürlich können größere Mengen an Input-RNA verwendet werden, um die Validierung seltener Transkripte zu ermöglichen. Dieser Betrag ist auch mehr als ausreichend, um die Bibliotheksvorbereitung und die RNA-Seq der nächsten Generation zu ermöglichen.
Abbildung 1. Überblick über die Herstellung von Rückenmarksscheiben und die Lasererfassungsmikrodissektion von Spinalmarkmotor-Neuronenkörpern. A) Wichtige Schritte in der Scheibenproduktion und Färbung. B) Cartoon-Ansicht des Rückenmarksabschnitts und der Lasersektion. Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.
Abbildung 2. Vorher-Nachher-Bilder einer Lasersektion von Azure B-gefärbten motorischen Neuronenkörpern. A) Ein Teil des ventralen Horns eines gebeizten Abschnitts. Beachten Sie die vier großen, dunkel gefärbten Zellen. Es gibt auch ein paar leicht gefärbte und etwas kleinere Zellen, die keine motorischen Neuronen sind (bestätigt durch Anti-Chat-Antikörperfärbung; nicht gezeigt, aber siehe Bandyopadhyay2) und die nicht für die Zerlegung ausgewählt werden. Die vielen kleinen, dunklen Flecken sind wahrscheinlich neuronale Prozesse (Dendriten und Axone), aber dies wurde nicht bestätigt. B) Die vier Zellkörper, die mit dem Lichtstift umrissen sind. Beachten Sie, dass die Umrisse den Rändern der Zellen mit einem Mindestabstand zwischen ihnen genau folgen. Dieser Abstand sollte empirisch für jedes Mikroskop und jeden Laser festgelegt werden. Die Software nummeriert die einzelnen Neuronen, was das Nachverfolgen der gesammelten Mengen vereinfacht. C und D) Nachdem der Laser geschnitten hat und die Stücke, die die Zellkörper enthalten, in die Sammelkappe gefallen sind. Beachten Sie, dass das zurückgelassene Loch etwas größer als die Umrisse ist und unregelmäßig ist. Dies spiegelt die Breite des Laserstrahls und seine leicht variable Schnitteffizienz in Abhängigkeit von der lokalen Zusammensetzung des Gewebes wider. Offensichtlich ist auch der Rand des abgedunkelten Gewebes, das jedes Loch aufgrund lokaler Heizschäden durch den Laser umgibt.
Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.
Abbildung 3. Elektrophoretische Analyse der Integrität von RNA, die aus LMD-Proben hergestellt wird. A) Ein 1-l-Aliquot der RNA, die aus 4.000 motorischen Neuronenkörpern nach dem obigen Protokoll hergestellt wurde, wurde durch mikrokapillare Elektrophorese auf einem mikrofluidischen Chip analysiert. Das Elektropherogramm wird mit markanten ribosomalen RNA-Spitzen gezeigt. Auf der rechten Seite ist ein Bild des Gels selbst. B) Das Elektropherogramm der Größennormen wird mit der entsprechenden Gelspur rechts angezeigt. Die Instrumentensoftware berechnete für diese Probe eine RIN von 9,8 und eine Konzentration von 4,9 ng/l. Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.
Discussion
Das bedeutendste Erfolgsmaß dieses Protokolls zur Herstellung von Gesamt-RNA durch Lasermikrodissektion von Rückenmarksscheiben ist der RIN-Wert5. Bei RNA-Proben aus höheren Eukaryoten liefern Werte über 8,5 regelmäßig qualitativ hochwertige Sequenzierungs- und qRT-PCR-Daten. Wenn die Ausbeute gering ist, aber die Qualität hoch ist, wiederholen Sie die Zubereitung. Wenn die Integrität niedriger ist (auch 7,5-8), ist es jedoch besser, die Ursache des Problems zu finden und es erneut zu versuchen. Es gibt viele Schritte, bei denen etwas schief gehen kann, aber wirklich nur zwei Ursachen des Problems - die endogene RNase-Kontamination oder die exogene RNase-Kontamination. Die erste kann durch die Praxis angegangen werden, so dass die Zeit vom Opfer der Maus bis zum Einfrieren der O.C.T-eingebetteten Schnur minimiert wird. Der andere Punkt im Protokoll, bei dem endogene RNase zu einem schlechten Ergebnis beitragen kann, ist die Vorbereitung der Scheiben. Jede Scheibe sollte schnell an einem PEN-Schiebeschlitten haften, aber es schmilzt (das O.C.T wird klar). Je schneller die Scheibe eingefroren werden kann, desto besser. Der Kryostat, den wir verwenden, hat flache Oberflächen in der Kammer, die bei -20 °C liegen, die wir verwenden, um die Scheibe schnell wieder einzufrieren. Finden Sie eine ähnliche Stelle in der kryostat verwendet und stellen Sie sicher, dass die Scheibe schnell wieder undurchsichtig wird.
Das Aufspüren von Quellen exogener RNase kann schwierig sein, weil es so viele Möglichkeiten gibt. Die einzigen Reagenzien, die nicht ausdrücklich RNase-frei sind, sind O.C.T. und Azure B. Wenn Azure B zuvor zufriedenstellend abgeschnitten hat, probieren Sie eine frische Flasche O.C.T. aus, obwohl dieses Reagenz nie ein Problem war. RNasefreie Reagenzien können auch von einem anderen Lieferanten ersetzt werden. Eine viel wahrscheinlichere Quelle ist der Ermittler. Neben einer gründlichen Bereinigung des Arbeitsbereichs ist es oft sinnvoll, dass ein anderes Labormitglied mitverfolgt und alle Schritte im Verfahren beobachtet. Selbst wenn dies jemand ist, der dieses Verfahren nicht routinemäßig durchführt, kann ein neuer Satz von Augen eine ansonsten unbemerkte Quelle der Kontamination aufnehmen.
Die Ausweitung dieses Protokolls auf die Wiederherstellung von RNA aus anderen Rückenmarkszellen, von Rückenmarkszellen anderer Arten oder von bestimmten Zelltypen in anderen Organen erfordert Änderungen in mehreren Bereichen, die darauf ausgerichtet sind, eine klare Identifizierung der gefährdeten Zellen zu erreichen, während die Auswirkungen der endogenen RNase verhindert oder zumindest minimiert werden. Im Protokoll hier ermöglichte das schnelle Entfernen und Einfrieren der Schnur, gekoppelt mit Azure B Färbung in 70% Ethanol, sowohl die Minimierung des RNA-Abbaus als auch die einfache Identifizierung von motorischen Neuronenkörpern. Azure B ist ein etablierter histochemischer Fleck für Neuronen, der an RNA3 zu binden scheint und zur Bewertung des RNA-Gehalts von Neuronen in Autopsieproben von Hirngewebe von Patienten mit neurodegenerativer Erkrankung6verwendet wurde. Insbesondere hat die Azure B-Färbung weder die Integrität der gereinigten RNA noch ihre Fähigkeit, umgekehrt transkribiert und analysiert zu werden, beeinträchtigt. Andere Farbstoffe, wie Cresylviolett7 und Toluidin blau8 wurden in ähnlichen LMD-Protokollen verwendet. Das Sammeln der Zellkörper direkt in Guanidin-Thiocyanat-Lösung, wie sie seziert wurden, lieferte den letzten Schritt, der in der routinemäßigen Wiederherstellung von intakter RNA führte.
Ähnliche Ansätze können für andere Zellen und Organe vorgesehen werden, wobei anerkannt wird, dass die Identifizierung der von Interesse sindden Zellen bei gleichzeitiger Minimierung oder vorzugsweise Verhinderung des RNA-Abbaus durch endogene RNasen die entscheidende Voraussetzung für eine erfolgreiche Analyse ist. In Geweben mit hohem RNase-Gehalt, wie Bauchspeicheldrüse, schnelle Handhabung und niedrige Temperatur wurden kombiniert, um die Rückgewinnung von RNA aus β-Zellen zu ermöglichen, unter Ausnutzung ihrer natürlichen Autofluoreszenz für die Visualisierung9. Verfahren mit Antikörperfärbung zur Identifizierung wurden ebenfalls10berichtet, waren aber in unseren Händen nicht vollständig erfolgreich. Schließlich stehen viele Mausmodelle zur Verfügung, die fluoreszierende Fusionsproteine(z. B. GFP, YFP, RFP) in von Interesse beauftragenden Zellen ausdrücken, die verwendet werden könnten, um sie in Gewebeabschnitten auf dem LMD-Mikroskop zu identifizieren. In der Tat, die Maus Stämme, die wir mit diesem Protokoll analysiert haben, drücken ein Fusionsprotein zwischen SOD1 und YFP11aus, und ihre Spinalmark-Motorneuronen sind hochfluoreszierend. Wir waren jedoch nicht in der Lage, eine Reihe von Ethanolspülungen und/oder Dehydrierungsbedingungen zu finden, die gleichzeitig die O.C.T. entfernen, die RNase-Aktivität hemmen und konsequent eine ausreichende YFP-Fluoreszenz beibehalten würden, um eine Visualisierung der motorischen Neuronen und ihre Erholung durch LMD zu ermöglichen. Vielleicht kann ein neues fluoreszierendes Protein oder eine Variante der verfügbaren, die die Fluoreszenz in organischen Lösungsmitteln aufrechterhält, gefunden werden, um diese Einschränkung zu überwinden.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Die Autoren danken George Farr und den Mitgliedern des Horwich-Labors für die hilfreichen Diskussionen. Diese Arbeit wurde vom Howard Hughes Medical Institute unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Webster Veterinary | 26637041101 | Any source approved by the institutional veterinary service |
| Dissection tools (scissors, forceps, etc.) | Any convenient source of high-quality dissection instruments | ||
| Cryostat | Leica Microsystem | CM3050S | Other cryostats should be suitable |
| LMD6000 B | Leica Microsystem | Other LMD systems have not been tested | |
| RNase-free PEN-membrane 2 μm slides | Leica Microsystem | 11505189 | Other slide types have been tested and do not perform well |
| RNeasy Micro kit (50) | Qiagen | 74004 | Any kit that uses guanidine thiocyanate lysis buffer and has been tested for recovering small quantities of RNA can be used |
| Agilent 2100 BioAnalyzer | Agilent Technologies | G2939A | |
| Azure B Certified | MP Biomedicals | 190520 | Critical! Product from any source has to be tested before use for its ability to maintain RNA integrity |
| PBS | Sigma Life Science | D8537 | Any reliable source of RNase-free PBS |
| RNA Ethanol 70% (made with DEPC treated water) | American Bioanalytical | AB04010-00500 | Any reliable source, can be lab-made |
| Water, RNase-free, Endotoxin tested (treated with DEPC to eliminate RNase) | American Bioanalytical | AB02128-00500 | Any reliable source, can be lab-made |
| RNase AWAY | Invitrogen Life Technologies | 10328-011 | Other similar RNase removal reagents, such as RNaseZAP (also from Invitrogen) can be used |
| 2-Methylbutane | Electron Microscopy Sciences | 78-78-4 | Any source |
| Maxymum Recovery microfuge tubes (0.6 and 1.5 ml) and pipette tips | Axygen | 311-03-051 & 311-09-051 | Ultra-low retention, RNase free tubes and tips; test other manufacturer's products before using |
| O.C.T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryomold Intermediate Size | Tissue-Tek | 4566 | |
| Lab wipes (Kimwipes) | KIMTECH | 34155 |
References
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