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Neuroscience

BoTest मैट्रिक्स assays का उपयोग जटिल matrices से अलगाव और बोटुलिनम neurotoxin की मात्रा

doi: 10.3791/51170 Published: March 3, 2014

Summary

BoTest मैट्रिक्स बोटुलिनम neurotoxin (Bont) का पता लगाने assays तेजी से शुद्ध और नमूना matrices की एक सीमा से Bont यों. यहाँ, हम ठोस और तरल दोनों matrices से Bont का पता लगाने और मात्रा का ठहराव के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान और बोटोक्स, टमाटर, और दूध के साथ परख प्रदर्शित करता है.

Abstract

सटीक पता लगाने और जटिल matrices में बोटुलिनम neurotoxin (Bont) की मात्रा का ठहराव दवा, पर्यावरण, और खाद्य पदार्थ के नमूने परीक्षण के लिए आवश्यक है. सही शक्ति परीक्षण Bont आधारित दवा उत्पाद विनिर्माण और मरीज की सुरक्षा के लिए आवश्यक है, जबकि खाद्य पदार्थों की रैपिड Bont परीक्षण प्रकोप फोरेंसिक, रोगी निदान, और खाद्य सुरक्षा के परीक्षण के दौरान की जरूरत है. Bont परीक्षण के लिए व्यापक रूप से इस्तेमाल माउस bioassay अत्यधिक संवेदनशील है, लेकिन तेजी से और दिनचर्या Bont परीक्षण के लिए आवश्यक परिशुद्धता और throughput का अभाव है. इसके अलावा, पशुओं के bioassay का उपयोग Bont परीक्षण के लिए माउस bioassay बदलने के लिए अमेरिका में और विदेशों में दवा उत्पाद नियामक अधिकारियों और पशुओं के अधिकारों के समर्थकों द्वारा कॉल में हुई है. कई में इन विट्रो प्रतिस्थापन assays सरल बफ़र्स में शुद्ध Bont के साथ अच्छी तरह से काम करते हैं कि विकसित किया गया है, लेकिन सबसे अत्यधिक जटिल matrices में परीक्षण करने के लिए लागू होने के लिए नहीं दिखाया गया है. इधर, का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉलBoTest मैट्रिक्स assays का उपयोग जटिल matrices में Bont प्रस्तुत किया है. परख तीन हिस्से होते हैं: पहले भाग के परीक्षण के लिए नमूने की तैयारी शामिल है, दूसरे भाग मैट्रिक्स से Bont शुद्ध करने के लिए विरोधी Bont एंटीबॉडी में लिपटे समचुंबक मोती का उपयोग कर एक immunoprecipitation कदम है, और तीसरा हिस्सा अलग Bont के प्रोटियोलिटिक quantifies एक fluorogenic संवाददाता का उपयोग गतिविधि. प्रोटोकॉल तरल और ठोस दोनों matrices का उपयोग 96 अच्छी तरह प्लेटें में उच्च throughput परीक्षण के लिए लिखा है और 4-26 घंटे की कुल परख बार नमूना प्रकार, विष लोड, और वांछित संवेदनशीलता पर निर्भर करता है के साथ मैनुअल तैयार करने के बारे में 2 घंटे की आवश्यकता है. डाटा फॉस्फेट बफर खारा, एक दवा उत्पाद, संस्कृति पर तैरनेवाला, 2% दूध, और ताजा टमाटर के साथ Bont / एक परीक्षण के लिए प्रस्तुत किया है और परख की सफलता के लिए महत्वपूर्ण मापदंडों की चर्चा भी शामिल कर रहे हैं.

Introduction

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बोटुलिनम न्यूरोटोक्सिन (BoNTs) 1-3 एनजी का अनुमान नसों में मानव घातक खुराक के साथ ज्ञात घातक पदार्थ, कर रहे हैं / 1,2 किलो. Bont के सात structurally समान सीरमप्रकारों, प्रत्येक कोशिका एक जस्ता endopeptidase 3-5 encodes कि cytosol और एक प्रकाश श्रृंखला में, तेज, और स्थानान्तरण बाइंडिंग के लिए जिम्मेदार एक भारी श्रृंखला डोमेन से मिलकर मौजूद हैं, जी के माध्यम से एक लेबल. Bont के उत्तम विषाक्तता भाग में, से परिणाम, neuromuscular जंक्शन 6 में मोटर न्यूरॉन्स में अपनी विशिष्ट बाध्यकारी और प्रविष्टि. एक बार न्यूरॉन के अंदर, प्रकाश श्रृंखला endopeptidase विशेष रूप से cleaves घुलनशील एन ethylmaleimide संवेदनशील कारक लगाव प्रोटीन रिसेप्टर (जाल) पुटिका संलयन के लिए आवश्यक प्रोटीन की एक या अधिक, neurotransmitter रिहाई बाधा और झूलता हुआ पक्षाघात 7-14 के लिए अग्रणी. आमतौर पर बीमारी "बोटुलिज़्म," Bont से डायाफ्राम और पसलियों के बीच मांसपेशियों के पक्षाघात के रूप में जाना जाता है अंततः में परिणामशीघ्र निदान और उपचार जब तक सांस की विफलता और मृत्यु प्राप्त कर रहे हैं.

मानव खाद्य जनित बोटुलिज़्म सबसे अधिक Bont सीरमप्रकारों ए, बी, ई के साथ जुड़े थे, और आमतौर पर एफ (Bont / ए, Bont / बी, आदि) और दूषित खाद्य 15,16 की घूस का परिणाम है, हालांकि, घाव बोटुलिज़्म के कई मामलों नसों में नशा करने वालों 17,18 बीच सूचना मिली. संयुक्त राज्य अमेरिका में, एक साल की उम्र के तहत बच्चों द्वारा क्लोस्ट्रीडियम बीजाणुओं की घूस के परिणामस्वरूप शिशु बोटुलिज़्म बोटुलिज़्म 19-21 का सबसे आम रूप है. हालांकि, अनुचित घर कैनिंग और खाद्य प्रसंस्करण से उत्पन्न खाद्य जनित Bont प्रकोप विदेश में संयुक्त राज्य अमेरिका और दोनों में सूचना मिली. 2000-2009 के बीच, खाद्य जनित बोटुलिज़्म के कम से कम 338 मामलों में छह की मौत, 22 सहित दुनिया भर में सूचना मिली. तेजी से और संवेदनशीलता खाद्य जनित बोटुलिज़्म फैलने का पता लगाने की क्षमता जल्दी निदान में सहायता कर सकता है कि एक महत्वपूर्ण संकेत है 23,24. इसके अलावा, लागत प्रभावी और नियमित भोजन के परीक्षण की अनुमति है कि पता लगाने के तरीकों में सुधार खाद्य सुरक्षा को बढ़ावा मिलेगा.

Bont के neuronal विशिष्टता और लंबे जैविक आधा जीवन भी यह एक शक्तिशाली चिकित्सकीय बनाता है. संयुक्त राज्य अमेरिका में, Bont आधारित दवाओं कॉस्मेटिक शर्तों और glabellar लाइनों, गर्भाशय ग्रीवा dystonia, माइग्रेन सिर दर्द, अति मूत्राशय, और तिर्यकदृष्टि सहित neuromuscular संबंधी विकारों के इलाज के लिए खाद्य एवं औषधि प्रशासन द्वारा अनुमोदित कर रहे हैं. कई "बंद लेबल" अनुप्रयोगों गंभीर मांसपेशियों में शिथिलता 25-28 के लिए उच्च खुराक उपचार सहित, दस्तावेज हैं. Overdosing हानिकारक साइड इफेक्ट के जोखिम में रोगियों डालता है, जबकि underdosing अप्रभावी उपचार के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के रूप में सही विष मात्रा का ठहराव, सही खुराक के लिए महत्वपूर्ण है. दुर्भाग्य से, कोई मानकीकृत शक्ति परख प्रोटोकॉल Bont आधारित दवा उत्पादों होगा के बीच इकाई परिभाषा असमानताओं, जिसके परिणामस्वरूप निर्माताओं भर में साझा किया जाता हैसीटीएस 29-31.

Bont के लिए मानक टेस्ट Bont युक्त नमूने चूहों में intraperitoneally इंजेक्शन और मौतों की संख्या 1-7 दिनों से अधिक 16,32,33 दर्ज हैं जिसमें माउस bioassay है. माउस bioassay 5-10 पीजी Bont / ए 34 का पता लगाने की सीमा (लोद) के साथ बहुत ही संवेदनशील है, लेकिन, पशु इस्तेमाल को लेकर नैतिक चिंताओं, उच्च प्रशिक्षण कर्मियों की लागत और पशु सुविधाओं, लंबे परख बार, और कमी को बनाए रखने मानकीकृत प्रोटोकॉल मानकीकृत, पशु मुक्त Bont परीक्षण और मात्रा का ठहराव तरीकों 35-39 विकसित करने के लिए कॉल में हुई. हाल ही में, कई वैकल्पिक Bont मात्रा का ठहराव तरीकों माउस या निकट माउस bioassay संवेदनशीलता 40-49 प्रस्ताव है कि विकसित किए गए. इन विधियों आमतौर पर प्रतिदीप्ति, जन स्पेक्ट्रोमेट्री, या प्रतिरक्षा विधियों का उपयोग और पशुओं के उपयोग के बिना माउस bioassay की तुलना में काफी कम परख बार प्रदान करते हैं. जन स्पेक्ट्रोमेट्री प्रतिरक्षाविज्ञानी techniq के साथ संयुक्त दृष्टिकोणues का पता लगाने और Bont भोजन और अन्य जटिल नमूने में निहित यों को दिखाया गया है, लेकिन, कर्मियों को प्रशिक्षण आवश्यकताओं और विशेष उपकरणों की सीमा इन assays 50-55. अधिकांश अन्य वैकल्पिक assays जटिल नमूना परीक्षण के लिए आसानी से लागू नहीं कर रहे हैं या नियमित Bont परीक्षण के लिए आवश्यक throughput की कमी है. Bont की चरम शक्ति मैच के लिए संवेदनशीलता के साथ इन विट्रो परख के तरीकों को विकसित करने की कोशिश कर रहा है जब खाद्य नमूना चिपचिपापन, पीएच, नमक सामग्री, और मैट्रिक्स घटकों के उच्च चर प्रकृति एक विशेष रूप से कठिन चुनौती प्रस्तुत करता है. इसके अलावा, इस तरह के Bont आधारित दवा उत्पादों के मेजबान से उत्पन्न उन के रूप में भी सरल और अपेक्षाकृत सौम्य बफर सिस्टम, काफी इन विट्रो Bont शक्ति 56 प्रभाव है कि नमक, albumin, और चीनी स्टेबलाइजर्स (यानी excipients) होते हैं. विष शुद्धि नमूने 56-59 का सरलतम लेकिन सभी की सटीक गतिविधि के परीक्षण के लिए आवश्यक है.

BoTest मैट्रिक्स assays तेजी, उच्च throughput के लिए तैयार है, और आमतौर पर अनुसंधान प्रयोगशालाओं 56,60 में पाया उपकरणों का उपयोग अत्यधिक जटिल नमूनों से Bont के अनुरूप मात्रा का ठहराव किया गया. ये assays covalently बाँध और एक नमूना से बाहर Bont एकांत में रहना और फिर धोने से मैट्रिक्स यौगिकों दखल को दूर करने के सीरोटाइप विशेष विरोधी Bont एंटीबॉडी से जुड़ा हुआ समचुंबक मोती का उपयोग करें. धोने के बाद, बाध्य Bont proteolytic गतिविधि तो Bont सीरोटाइप परीक्षण किया जा रहा है के साथ संगत एक संवाददाता का उपयोग कर एक अनुकूलित प्रतिक्रिया बफर में मात्रा निर्धारित है. इन पत्रकारों को एक एन टर्मिनल सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (पी) आधा भाग और गठन एक Bont सब्सट्रेट, SNAP25 अवशेषों 141-206 या synaptobrevin अवशेषों 33-94 से जुड़े एक सी टर्मिनल पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्युत्पन्न (वीनस) आधा भाग से मिलकर fluorogenic प्रोटीन होते हैं BoTest ए / ई या बी / डी / एफ / जी संवाददाताओं से क्रमश: 45. Bont से रिपोर्टर दरार फोरस्टर प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) का उपयोग करते हुए नजर रखी है. जब टीवह पत्रकार रवांडा की उत्तेजना पाकिस्तानी उत्सर्जन और रोमांचक वीनस उत्सर्जन शमन, वीनस को झल्लाहट में यह परिणाम है, बरकरार है. Bont से रिपोर्टर के विखंडन पाकिस्तानी उत्सर्जन और वीनस उत्सर्जन में कमी में वृद्धि करने के लिए अग्रणी, झल्लाहट से बचाता है. Bont गतिविधि तो मात्रात्मक पाकिस्तानी और वीनस उत्सर्जन का अनुपात का उपयोग करके मापा जा सकता है. 3 पीजी नीचे लोद एक उच्च throughput 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप 56 का उपयोग खाद्य पदार्थों की एक विस्तृत श्रृंखला से संभव हो रहे हैं. परख मनका सतह पर विष की एकाग्रता की अनुमति देता है के बाद से वृद्धि की संवेदनशीलता बड़ा नमूना संस्करणों का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है.

BoNTs ए, बी, ई, एफ और के लिए BoTest मैट्रिक्स assays विकसित की है और भोजन, दवा, और पर्यावरण के नमूने 56,60 के साथ परीक्षण किया गया. यहाँ, हम (जैसे दवा, Bont बफर में) और उच्च जटिलता (जैसे भोजन, पर्यावरण) नमूने कम जटिलता में Bont का पता लगाने के लिए इन assays को क्रियान्वित करने के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन है. विशिष्ट प्रसंस्करण विधियोंकई नमूना प्रकार इस प्रोटोकॉल में संबोधित कर रहे हैं और यहां वर्णित नहीं नमूना प्रकार के आम तौर पर प्रस्तुत तरीकों का एक संयोजन का उपयोग कर अनुकूलित किया जा सकता है. प्रोटोकॉल विकसित और परीक्षण Bont / ए के साथ, लेकिन कहीं 56,60 प्रदर्शन के रूप में उनके संबंधित assays का उपयोग अन्य Bont सीरमप्रकारों के लिए अनुकूल हो गया है.

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Protocol

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1. परख अभिकर्मकों की तैयारी

  1. पिघलना 200x dithiothreitol (डीटीटी), 10x मैट्रिक्स बाध्यकारी बफर (10x बाध्यकारी बफर इसके बाद), 10x निराकरण बफर (भोजन या पीएच असंतुलित नमूने केवल), और 15 मिनट के लिए 10x BoTest प्रतिक्रिया बफर कमरे के तापमान पर (10x प्रतिक्रिया बफर इसके बाद) (आरटी) या जब तक पूरी तरह thawed. इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता buffers और अभिकर्मकों की एक सूची के लिए 1 टेबल देखें. इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक सामग्री और उपकरणों की एक सूची के लिए 2 टेबल देखें.
  2. मिश्रण करने के लिए 5 सेकंड के लिए thawed बफ़र्स भंवर. 10x बाध्यकारी बफर एक बादल उपस्थिति होगा जबकि 10x निराकरण बफर, 200xDTT, और 10x प्रतिक्रिया बफर स्पष्ट दिखाई देनी चाहिए. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 10x प्रतिक्रिया बफर गर्म और यह विगलन निम्नलिखित रूप से बादल दिखाई देता है अगर vortexing दोहराएँ.
  3. 1x प्रतिक्रिया बफर के 3.8 मिलीलीटर उत्पन्न करें.
    1. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब "1x प्रतिक्रिया बफर" लेबल और 3.42 मिलीग्राम आणविक जीव विज्ञान ग्रेड वाट जोड़ईआर, 380 μl 10x प्रतिक्रिया बफर, और 19 μl 200x डीटीटी. उलटा द्वारा बफर अच्छी तरह से मिलाएं.
    2. एक साफ रेजर ब्लेड का उपयोग क्वार्टर में एक भी EDTA मुक्त protease अवरोध गोली कट और 1x प्रतिक्रिया बफर (शेष गोली भाग बाद में उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है) करने के लिए गोली का एक चौथाई जोड़ें. नायब Protease inhibitors नहीं हो सकता शुद्ध विष और सरल बफ़र्स (जैसे दवा के नमूने) का उपयोग कर यदि आवश्यक हो.
    3. भंवर प्रोटीज गोली पूरी तरह से भंग कर दिया है जब तक 1x प्रतिक्रिया बफर.
  4. आरटी पर 20 मिनट के लिए मैट्रिक्स एक मोती (इसके बाद आईपी एक मोती) गर्म.
  5. प्रकाश से सुरक्षित आरटी पर BoTest ए / ई रिपोर्टर (ए / ई रिपोर्टर इसके बाद) पहले गला लें.
  6. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब "0.5 माइक्रोन ए / ई संवाददाता" लेबल और 1.8 एमएल 1x प्रतिक्रिया बफर करने के लिए 20 माइक्रोन ए / ई संवाददाता स्टॉक के 45 μl जोड़ें. Pipetting द्वारा अच्छी तरह मिक्स और प्रकाश से सुरक्षित बर्फ पर दुकान.

2. स्टैंडएआरडी वक्र नमूना पीढ़ी

यहाँ वर्णित मानक वक्र आधे लॉग dilutions (3 टेबल) में 10-30,000 एमएलडी 50 / जी खाना या मिलीलीटर बफर प्रति तक फैला है. अंत उपयोगकर्ता के रूप में लागू वैकल्पिक सांद्रता का उपयोग करने के लिए स्वतंत्र है.

  1. Spiking और संदर्भ सामग्री के साथ matrices incubating. यदि संभव हो तो मैट्रिक्स प्रभाव को कम करने के लिए, अज्ञात के रूप में एक ही मैट्रिक्स की एक मंदक का उपयोग कर मानक वक्र उत्पन्न करता है. अतिरिक्त, Bont नकारात्मक मैट्रिक्स (जैसे क्षेत्र या Bont प्रकोप नमूना परीक्षण) उपलब्ध नहीं है, तो एक मंदक के रूप में जिलेटिन फॉस्फेट बफर (GPB) या फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) का प्रयोग करें. नीचे उपयुक्त प्रोटोकॉल के बाद चुनाव के मैट्रिक्स में Bont / A spiking द्वारा मानक वक्र उत्पन्न करता है.
    1. कम जटिलता के नमूने (जैसे पीबीएस, GPB, या दवा)
      1. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब को उचित बफर के 10 मिलीलीटर जोड़ें और अलग निर्धारित करें. यह नमूना standar के लिए मंदक के रूप में इस्तेमाल किया जाएगाडी वक्र और अज्ञात dilutions (धारा 4).
      2. एक microcentrifuge ट्यूब 1.2 मिलीलीटर बफर जोड़ें.
      3. चेतावनी: यह कदम Bont का उपयोग करता है और हैंडलिंग और विष के साथ संपर्क में आने वाले किसी भी अभिकर्मकों और सामग्री के निपटान जब अत्यधिक सावधानी प्रयोग किया जाना चाहिए. व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण और सभी सामग्री के समुचित निपटान के इस्तेमाल की Bont के लिए श्रम OSHA दिशा निर्देशों (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) के अमेरिकी विभाग के अनुसार किया जाना चाहिए. अंतिम एकाग्रता 30,000 एमएलडी 50 / एमएल (36,000 एमएलडी 50 कुल) है कि इस तरह के 1.2 मिलीलीटर नमूने के Bont / A जोड़ें.
    2. तरल भोजन के नमूने (या अन्य जटिल तरल नमूने) नोट: प्रारंभिक परीक्षण तरल matrices में बात कण (. जैसे गूदा) के रूप में स्पष्ट किया नमूनों से बरामद सतह पर तैरनेवाला की मात्रा निर्धारित करने के लिए सिफारिश की है अलग अलग होंगे. इस प्रोटोकॉल एक 1.4 मिलीलीटर samp से बरामद किया जाएगा स्पष्ट सतह पर तैरनेवाला के कम से कम 1.2 मिलीलीटर हो जाती हैLe. यदि आवश्यक हो तो नमूने का आकार बढ़ाएँ.
      1. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 10 मिलीलीटर तरल खाद्य जोड़ें और इसे रद्द करना. यह नमूना मानक वक्र और अज्ञात dilutions (धारा 4) के लिए मंदक के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा.
      2. एक खाली 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब वजन और अपने जन रिकॉर्ड.
      3. तौला microcentrifuge ट्यूब तरल भोजन के 1.4 मिलीलीटर जोड़ें.
      4. Microcentrifuge ट्यूब Reweigh और खाली ट्यूब की जन घटाकर की गयी खाद्य नमूना के द्रव्यमान की गणना.
      5. चेतावनी: यह कदम Bont का उपयोग करता है और हैंडलिंग और विष के साथ संपर्क में आने वाले किसी भी अभिकर्मकों और सामग्री के निपटान जब अत्यधिक सावधानी प्रयोग किया जाना चाहिए. व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण और सभी सामग्री के समुचित निपटान के इस्तेमाल की Bont के लिए श्रम OSHA दिशा निर्देशों (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) के अमेरिकी विभाग के अनुसार किया जाना चाहिए. 30,000 एमएलडी 50 / जी भोजन की एक अंतिम एकाग्रता में 1.4 मिलीलीटर नमूने के Bont / A जोड़ें.
      6. Incubaमंदक ते और एक प्राकृतिक संदूषण की नकल उतार, खाद्य मैट्रिक्स के साथ बातचीत करने के लिए Bont समय देने के लिए 2 घंटे के लिए आर टी या 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने नुकीला.
    3. ठोस भोजन के नमूने (या अन्य ठोस नमूने) नोट: प्रारंभिक परीक्षण 1 मिलीलीटर GPB / जी भोजन के अलावा के बाद homogenized और स्पष्ट नमूनों से बरामद सतह पर तैरनेवाला की मात्रा निर्धारित करने के लिए सिफारिश की है. इस प्रोटोकॉल में कम से कम 1.2 मिलीलीटर सतह पर तैरनेवाला एक 2 जी नमूना से बरामद किया जाएगा स्पष्ट किया है कि मानता है. यदि आवश्यक हो तो नमूने का आकार बढ़ाएँ.
      1. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 10 ग्राम ठोस नमूना वजन और अलग निर्धारित करें. इस मंदक के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा.
      2. एक दूसरे 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 2 जी ठोस खाद्य पदार्थ के नमूने वजन.
      3. चेतावनी: यह कदम Bont का उपयोग करता है और हैंडलिंग और विष के साथ संपर्क में आने वाले किसी भी अभिकर्मकों और सामग्री के निपटान जब अत्यधिक सावधानी प्रयोग किया जाना चाहिए. व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण और सभी सामग्री के समुचित निपटान का प्रयोगएस (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) Bont के लिए श्रम OSHA दिशा निर्देशों के अमेरिकी विभाग के अनुसार किया जाना चाहिए. 30,000 एमएलडी 50 / जी भोजन (60,000 कुल एमएलडी 50) की अंतिम एकाग्रता के लिए 2 जी नमूना की सतह को Bont / A जोड़ें.
      4. एक प्राकृतिक संदूषण की नकल उतार, खाद्य मैट्रिक्स के साथ बातचीत करने के लिए Bont समय देने के लिए 2 घंटे के लिए आर टी या 4 डिग्री सेल्सियस पर मंदक और नुकीला नमूने सेते हैं.
  2. नमूना homogenization और बफर समायोजन. नमूना प्रकार के अनुसार ऊपर उत्पन्न नुकीला मानक वक्र नमूना और मंदक प्रक्रिया.
    1. कम जटिलता नमूने
      1. आगे कोई नमूना प्रसंस्करण आवश्यक है.
    2. तरल भोजन के नमूने (या अन्य जटिल तरल नमूने)
      1. कोई नमूना homogenization आवश्यक है.
      2. 1.4 मिलीलीटर के लिए 140 μl 10x निराकरण बफर जोड़ें नुकीला नमूना और 1 मिलीलीटर 10x Neutralizatआयन 10 मिलीलीटर मंदक नमूना के लिए बफर. अच्छी तरह से उलटा द्वारा नमूने मिलाएं.
      3. आंशिक रूप से 6000 XG और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए centrifuging द्वारा दोनों नमूनों को स्पष्ट तुरंत supernatants हटाने और नया ट्यूब को हस्तांतरण.
    3. ठोस भोजन के नमूने (या अन्य ठोस नमूने)
      1. 10 ग्राम मंदक नमूना करने के लिए 2 जी Bont / ए नुकीला ठोस खाद्य पदार्थ के नमूने और 10 मिलीलीटर GPB 2 मिलीलीटर GPB (1 मिलीलीटर GPB / छ खाद्य) जोड़ें.
      2. अच्छी तरह से जब तक मिति एक मूसल का उपयोग कर नमूने homogenize. नमूने की प्रकृति पर निर्भर करता है, स्वीकार्य है जो homogenized नहीं किया जा सकता कि सामग्री की छोटी मात्रा, हो सकता है. वैकल्पिक रूप से, यांत्रिक homogenization के तरीकों का इस्तेमाल किया जा सकता है. यह निष्क्रिय है और साथ ही विष aerosolize सकता है के रूप में एक ब्लेंडर में इस्तेमाल की सिफारिश नहीं है.
      3. (मात्रा 20 मिलीग्राम है, तो जैसे 2 मिलीलीटर) लगभग कुल मात्रा के आधार पर मंदक नमूना करने के लिए 10x निराकरण बफर के 1/10th मात्रा में जोड़ें. एक्सट्रपलेशन करनाकुल Bont / ए नुकीला नमूने की मात्रा और 10x निराकरण बफर के 1/10th मात्रा में जोड़ें. अच्छी तरह से उलटा द्वारा नमूने मिलाएं.
      4. आंशिक रूप से 6000 XG और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए centrifuging द्वारा दोनों नमूनों को स्पष्ट तुरंत supernatants हटाने और नया ट्यूब को हस्तांतरण.
  3. परीक्षण के लिए मानक वक्र धारावाहिक dilutions तैयार
    1. मंदक के रूप में डी 1 के रूप Bont / ए नुकीला मानक वक्र नमूना और nonspiked नमूना का प्रयोग, 3 टेबल के अनुसार 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में शेष मानक वक्र नमूने उत्पन्न करते हैं.

3. अज्ञात नमूने तैयार

यह खंड धारा 2 के समानांतर में पूरा किया जा सकता है.

  1. अज्ञात की संख्या और dilutions के निर्धारण करते हैं. यदि संभव हो तो तीन प्रतियों में अज्ञात का परीक्षण करें.
    1. गुणात्मक assays के लिए, descri के रूप में नमूना प्रक्रिया के लिए आवश्यक से किसी भी आगे कमजोर पड़ने के बिना अज्ञात चलानेनीचे बिस्तर.
    2. नीचे वर्णित के रूप में मात्रात्मक assays के लिए, एक या अधिक नमूने परख प्रतिक्रिया के रैखिक सीमा के भीतर गिर यह सुनिश्चित करने के लिए, कम से कम दो 1:10 कमजोर पड़ने के नमूने तैयार करते हैं. यदि संभव हो तो धारा 3 में वर्णित के रूप में मैट्रिक्स प्रभाव को कम करने के लिए, अज्ञात के रूप में एक ही मैट्रिक्स की एक मंदक का उपयोग dilutions उत्पन्न करें. अन्यथा, मंदक के रूप में पीबीएस या GPB का उपयोग करें.
  2. सृजन और नमूना प्रकार के अनुसार अज्ञात नमूने गिराए.
    1. कम जटिलता अज्ञात (जैसे पीबीएस, GPB, या दवा)
      1. अज्ञात कमजोर पड़ने 1 उत्पन्न करने के लिए एक microcentrifuge ट्यूब अज्ञात कम से कम 750 μl जोड़ें.
      2. अज्ञात कमजोर पड़ने 2 और 3 लेबल दो microcentrifuge ट्यूबों को 675 μl मंदक जोड़ें. मंदक मानक वक्र पीढ़ी के लिए इस्तेमाल एक ही सामग्री हो जाएगा.
      3. क्रमानुसार कमजोर पड़ने 2 ट्यूब में कमजोर पड़ने 1 की 75 μl हस्तांतरण और मिश्रण से कमजोर पड़ने 1 पतला.
      4. क्रमानुसार dilutकमजोर पड़ने 3 ट्यूब में कमजोर पड़ने 2 की 75 μl हस्तांतरण और मिश्रण से ई कमजोर पड़ने 2.
    2. तरल खाद्य अज्ञात (या अन्य जटिल तरल नमूने) नोट: प्रारंभिक परीक्षण धारा 3 में चर्चा के रूप में स्पष्ट किया नमूनों से बरामद सतह पर तैरनेवाला की मात्रा निर्धारित करने के लिए सिफारिश की है. यदि आवश्यक हो तो नमूने का आकार बढ़ाएँ.
      1. एक microcentrifuge ट्यूब तरल अज्ञात के ≥ 875 μl जोड़ें.
      2. नमूना (एक 875 μl नमूना के लिए जैसे 87.5 μl) को 10x निराकरण बफर के 1/10th मात्रा में जोड़ें.
      3. आंशिक रूप से 6000 XG और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए centrifuging द्वारा नमूना स्पष्ट तुरंत एक नया ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला. इस अज्ञात कमजोर पड़ने 1 है.
      4. अज्ञात कमजोर पड़ने 2 और 3 लेबल दो ट्यूबों को 675 μl मंदक जोड़ें. मंदक मानक वक्र पीढ़ी के लिए इस्तेमाल एक ही प्रसंस्कृत सामग्री हो जाएगा.
      5. क्रमानुसार हस्तांतरण से कमजोर पड़ने 1 पतलाअंगूठी 75 कमजोर पड़ने 2 ट्यूब और मिश्रण में कमजोर पड़ने 1 के μl.
      6. क्रमानुसार कमजोर पड़ने 3 ट्यूब में कमजोर पड़ने 2 की 75 μl हस्तांतरण और मिश्रण से कमजोर पड़ने 2 पतला.
    3. ठोस खाद्य अज्ञात (या अन्य ठोस नमूने) नोट: प्रारंभिक परीक्षण धारा 3 में चर्चा के रूप में स्पष्ट किया नमूनों से बरामद सतह पर तैरनेवाला की मात्रा निर्धारित करने के लिए सिफारिश की है. यदि आवश्यक हो तो नमूने का आकार बढ़ाएँ.
      1. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 2 जी ठोस अज्ञात नमूना वजन.
      2. 2 जी ठोस नमूना 2 मिलीलीटर GPB (1 मिलीलीटर GPB / छ खाद्य) जोड़ें.
      3. धारा 3.2.3.2 में वर्णित के रूप में नमूने homogenize.
      4. (मात्रा 4 मिलीग्राम है, तो जैसे 0.4 मिलीलीटर) लगभग कुल मात्रा के आधार पर नमूने के 10x निराकरण बफर के 1/10th मात्रा में जोड़ें. अच्छी तरह से उलटा द्वारा नमूने मिलाएं.
      5. आंशिक रूप से 6000 XG और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए centrifuging द्वारा नमूना स्पष्ट Immediatelएक microcentrifuge ट्यूब Y स्थानांतरण ≥ 750 μl सतह पर तैरनेवाला. इस अज्ञात कमजोर पड़ने 1 है.
      6. अज्ञात कमजोर पड़ने 2 और 3 लेबल दो ट्यूबों को 675 मिलीलीटर मंदक जोड़ें. मंदक मानक वक्र पीढ़ी के लिए इस्तेमाल एक ही प्रसंस्कृत सामग्री हो जाएगा.
      7. क्रमानुसार कमजोर पड़ने 2 ट्यूब में कमजोर पड़ने 1 की 75 μl हस्तांतरण और मिश्रण से कमजोर पड़ने 1 पतला.
      8. क्रमानुसार कमजोर पड़ने 3 ट्यूब में कमजोर पड़ने 2 की 75 μl हस्तांतरण और मिश्रण से कमजोर पड़ने 2 पतला.

4. अंतिम नमूना स्पष्टीकरण

परीक्षण तरल या ठोस भोजन के नमूने, एक microcentrifuge में ≥ 14,000 XG पर अपकेंद्रित्र 5 मिनट के लिए सभी नमूनों को पूरी तरह से नमूने स्पष्ट करने के लिए हैं. तुरंत supernatants हटाने और नया ट्यूब को हस्तांतरण.

5. प्लेट सेटअप और Bont / नीचे एक पुल

  1. विशिष्ट थाली लेआउट आवेदन निर्भर है, लेकिन, बाहर कुओं का उपयोग नहीं करते तोबढ़त के प्रभाव से बचने के लिए. नमूना D9 6 कुओं की आवश्यकता है, जबकि एक अज्ञात नमूना और मानक वक्र नमूना डी 1-D8 3 कुओं की आवश्यकता है. एक सुझाव दिया प्लेट लेआउट चित्र 1 में दिखाया गया है.
  2. प्रत्येक अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा करने के लिए 20 μl 10x बाध्यकारी बफर जोड़ें.
  3. 200 प्रत्येक स्पष्ट कमजोर पड़ने के μl और तीन प्रतियों के परीक्षण के लिए तीन कुओं (D9 के लिए छह कुओं) में से प्रत्येक के लिए अज्ञात जोड़ें. एक microplate मिक्सर पर 10 सेकंड के लिए थाली मिलाएं.
  4. आईपी ​​एक मोती जोड़ें.
    1. उच्चतम गति से 10 सेकंड के लिए भंवर आईपी एक मोती. मोती पूरी तरह resuspended और सजातीय नहीं हैं, तो vortexing जारी.
    2. पिपेट 20 μl आईपी ए प्रत्येक नमूने के मोती अच्छी तरह से.
    3. एक microplate मिक्सर पर 30 सेकंड के लिए थाली मिलाएं.
  5. 750 rpm पर 2 घंटा, 25 डिग्री सेल्सियस या आर टी के लिए एक घूर्णन थाली इनक्यूबेटर का उपयोग कर थाली सेते हैं. परख प्रदर्शन पैदा करने और सभी ऊष्मायन चरणों के दौरान आईपी एक मनका निलंबन को बनाए रखने पर निर्भर है. एक Microp साथ हमेशा resuspend मोतीसभी ऊष्मायन चरणों के दौरान एक कक्षीय microtiter प्लेट प्रकार के बरतन का उपयोग निलंबन pelleting और बनाए रखने के बाद देर मिक्सर.

6. प्लेट धोने और मनका मेजबान

  1. हाथ से या एक चुंबकीय मनका संगत स्वचालित प्लेट वॉशर का उपयोग करके या तो प्लेटें धो लें. चुंबकीय मोतियों के लिए विन्यस्त एक स्वचालित प्लेट वॉशर बहुत परख बढ़ जाती है throughput.
    1. मैनुअल धुलाई
      1. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब "1x धो बफर" और 45 मिलीलीटर आणविक जीव विज्ञान ग्रेड पानी और 5 एमएल 10x मैट्रिक्स धो बफर जोड़ लेबल. उलटा द्वारा बफर अच्छी तरह से मिलाएं.
      2. घूर्णन थाली इनक्यूबेटर से थाली निकालें.
      3. इसके तत्काल बाद 5 मिनट के लिए एक 96 अच्छी तरह चुंबकीय मनका जुदाई प्लेट पर थाली जगह.
      4. 96 अच्छी तरह चुंबकीय मनका जुदाई प्लेट पर थाली रखते हुए, धीरे हटाने और एक एकल या बहु चैनल पिपेट का उपयोग नमूना कुओं से supernatants त्यागें. महाप्राण न करेंमोती-नेत्रहीन आकस्मिक मनका हटाने के लिए पिपेट टिप में aspirated बफर निगरानी. हटाने देखा जाता है, तो धीरे खैर, reseparate को वापस टिप सामग्री जोड़ने, और हटाने दोहराएँ.
      5. अच्छी तरह से प्रत्येक नमूने के 300 μl 1x धो बफर जोड़ें.
      6. पूरी तरह से एक microplate मिक्सर पर 30 सेकंड के लिए थाली के मिश्रण से मोती resuspend.
      7. 2 मिनट के लिए 96 अच्छी तरह चुंबकीय मनका जुदाई प्लेट पर थाली सेते हैं.
      8. निकालें और पहले के रूप में नमूना कुओं से supernatants त्यागें.
      9. चरण 4 washes के एक कुल के लिए 6.1.1.5-6.1.1.8 तीन बार दोहराएँ.
      10. 96 अच्छी तरह चुंबकीय मनका जुदाई प्लेट पर थाली के साथ, नेत्रहीन भी सतह पर तैरनेवाला हटाने की पुष्टि करने के कुओं का निरीक्षण किया, आवश्यक के रूप में अतिरिक्त अवशिष्ट बफर दूर करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें. कुछ बफर कुओं में रहेगा और देखभाल मनका हटाने या मनका सुखाने से बचने के लिए लिया जाना चाहिए.
      11. प्रत्येक नमूने अच्छी तरह से करने के लिए 50 μl 1x प्रतिक्रिया बफर जोड़ें और 30 एसई के लिए थाली मिश्रणसी एक microplate मिक्सर पर पूरी तरह से मोती resuspend. यदि आवश्यक हो, पूरी तरह से मोती resuspend के लिए एक पिपेट का उपयोग करें.
    2. स्वचालित प्लेट धोने
      1. तालिका 4 के अनुसार सेटअप और कार्यक्रम वॉशर. उच्च गुणवत्ता वाले (जैसे nanopure) पानी के साथ स्वच्छ और फ्लश वॉशर.
      2. प्रधानमंत्री के कार्यक्रम "प्रधानमंत्री" चलाकर वॉशर.
      3. घूर्णन थाली इनक्यूबेटर से थाली निकालें.
      4. तुरंत प्लेट वॉशर पर 96 अच्छी तरह चुंबकीय मनका जुदाई प्लेट पर थाली जगह.
      5. कड़ी कार्यक्रम "मास्टर धो" भागो. पहला कार्यक्रम कदम वॉशर स्थिर हो जाएगा, जहां एक 5 मिनट ऊष्मायन कदम है.
      6. कार्यक्रम पूरा होने के बाद, वॉशर से थाली हटाने अच्छी तरह से प्रत्येक नमूने के 50 μl 1x प्रतिक्रिया बफर जोड़ने, और पूरी तरह से मोती resuspend के लिए एक microplate मिक्सर पर 30 सेकंड के लिए थाली मिश्रण. यदि आवश्यक हो, पूरी तरह से मोती resuspend के लिए एक पिपेट का उपयोग करें.

    7. परख दीक्षा और ऊष्मायन

    1. प्रत्येक नमूने अच्छी तरह से करने के लिए 50 μl 0.5 माइक्रोन ए / ई रिपोर्टर (खंड 1 देखें) जोड़ें और पूरी तरह से मोती resuspend के लिए एक microplate मिक्सर पर 30 सेकंड के लिए मिश्रण.
    2. बढ़त के प्रभाव को रोकने के लिए थाली पर प्रत्येक अप्रयुक्त अच्छी तरह से करने के लिए 100 μl पानी जोड़ें.
    3. थाली सील टेप के साथ प्लेट को सील करने और 25 डिग्री सेल्सियस या आरटी, 750 rpm पर एक घूर्णन थाली इनक्यूबेटर का उपयोग कर थाली सेते हैं. ऊष्मायन के दौरान प्रकाश से थाली को सुरक्षित रखें.

    8. डेटा संग्रह और विश्लेषण

    नोट: यह परख वांछित संवेदनशीलता प्राप्त होने तक कई बार मापा जा सकता है कि एक वास्तविक समय परख है, कोई आवश्यक स्टॉप अभिकर्मकों कर रहे हैं. अनुशंसित प्रारंभिक पढ़ें गुना 2, 4 हैं, और परख संवेदनशीलता के साथ 24 घंटे ऊष्मायन समय ऊष्मायन समय के साथ बढ़ रही है.

    1. डेटा संग्रह
      1. प्रत्येक पढ़ने के समय, घूर्णन थाली इनक्यूबेटर से थाली हटाने, सील हटानेटेप आईएनजी, और तुरंत 96 अच्छी तरह चुंबकीय मनका जुदाई प्लेट पर थाली जगह. मोती 2 मिनट के लिए अलग करने की अनुमति दें.
      2. Microplate रीडर में थाली प्लेस और ~ 470 पर उत्सर्जन को मापने और ~ 434 एनएम पर उत्तेजना के तहत ~ 526 एनएम.
      3. अतिरिक्त पठन बार यात्रा कर रहे हैं,, microplate मिक्सर पर 30 सेकंड के लिए मोती resuspend प्लेट reseal, और घूर्णन थाली इनक्यूबेटर थाली वापसी.
    2. डेटा विश्लेषण
      1. 470 एनएम पर RFU मूल्य से 526 एनएम पर रिश्तेदार प्रतिदीप्ति इकाई (RFU) मूल्य विभाजित करके प्रत्येक नमूने के लिए उत्सर्जन अनुपात की गणना.
      2. मानक वक्र डेटा बिंदुओं के लिए प्रवेश [Bont / ए] बनाम उत्सर्जन अनुपात साजिश है. परीक्षण किया Bont / एक शक्ति सीमा पर निर्भर करता है, एक sigmoidal खुराक प्रतिक्रिया वक्र (प्रतिनिधि परिणाम देखें) प्राप्त हो जाएगा.
      3. चर ढलान खुराक प्रतिक्रिया वक्र वाई = नीचे + (ऊपर से नीचे) / साथ मानक वक्र डेटा फ़िट (1 +10 ^ ((logEC 50-X) * Hillslope)) जहां एक्स हैएकाग्रता का लघुगणक, वाई प्रतिक्रिया है, और वाई निचला पर शुरू होता है और एक sigmoidal आकार के साथ शीर्ष पर चला जाता है.
      4. पता लगाने की सीमा (लोद) निर्धारित मात्रा का ठहराव (LOQ), और आधा अधिक से अधिक प्रभावी एकाग्रता (ईसी 50) की सीमा. पता लगाने की सीमा रिक्त नियंत्रण नीचे एक उत्सर्जन अनुपात कम से कम 3 मानक विचलन (एसडीएस) होने के एक नमूने के रूप में परिभाषित कर रहे हैं (n = 6). मात्रा का ठहराव की सीमाएं एक नमूना कम से कम 10 एसडीएस रिक्त नियंत्रण नीचे एक उत्सर्जन अनुपात होने के रूप में परिभाषित कर रहे हैं (n = 6). चुनाव आयोग 50 sigmoidal खुराक प्रतिक्रिया वक्र फिट से निर्धारित होता है.
      5. Sigmoidal खुराक प्रतिक्रिया मानक वक्र के खिलाफ किसी भी अज्ञात नमूनों की शक्ति बैठाना.
        1. मात्रात्मक परिणामों के लिए, अज्ञात नमूना आदर्श मानक वक्र के रैखिक हिस्से के भीतर गिर चाहिए. (20-80% कुल परख प्रतिक्रिया खिड़की की गणना के द्वारा मानक वक्र के रैखिक भाग लगभग जैसे यदि मानक वक्र आर के उत्सर्जन अनुपातAnges 0.5-2.5, रैखिक सीमा) 0.9-2.1 कि सीमाओं मानक वक्र का भाग होगा.
        2. गुणात्मक परिणाम के लिए, मानक वक्र की लोद और LOQ के खिलाफ अज्ञात नमूना की तुलना करें.
        3. मानक वक्र की सीमाओं से परे अज्ञात नमूने एक्सट्रपलेशन मत करो.

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Representative Results

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वर्णित प्रोटोकॉल में कदम सारांश आरेख चित्रा 2 में दिखाया गया है. परख नमूना प्रकार और वांछित परख संवेदनशीलता के आधार पर पूरा करने के लिए 4-26 घंटे के बीच की आवश्यकता है, लेकिन केवल ~ 2 घंटा समय हाथ पर. परख 96 अच्छी तरह प्लेटें में प्रदर्शन किया और परीक्षण किया जा रहा है के प्रकार पर निर्भर करता है, प्रति प्लेट मानकों सहित ऊपर से 20 नमूनों में से तीन प्रतियों के परीक्षण की अनुमति देता है.

चित्रा 3 Bont का उपयोग प्रतिनिधि परख परिणामों से पता चलता है / एक holotoxin पीबीएस में नुकीला और एक / ई पत्रकार के साथ 2, 4, और 24 घंटे ऊष्मायन के बाद वर्णित प्रोटोकॉल के साथ परीक्षण किया गया. शुद्ध Bont / A holotoxin ~ 150 केडीए के अपने परिभाषित आणविक वजन, विष परिसर के लिए और अधिक मोटे तौर पर परिभाषित 700-900 केडीए की तुलना क्योंकि इस प्रयोग के लिए चुना है, और पवित्रता सटीक सांद्रता में बहुत सटीक spiking की अनुमति गया था. उत्सर्जन अनुपात, 470 एनएम पर है कि 526 एनएम उत्सर्जन का अनुपात 434 पर उत्तेजना निम्नलिखितएनएम, हर समय बिंदु पर Bont / A एकाग्रता (एमएलडी 50 मूल्य Bont / एक निर्माता के शक्ति परीक्षण पर आधारित है) बनाम साजिश रची है. Bont से रिपोर्टर के विखंडन हमारी थाली पाठक के साथ पूरी तरह से cleaved संवाददाता के बारे में 0.7 बरकरार संवाददाता के बारे में 2.7 के बीच है, जो उत्सर्जन अनुपात में कमी के रूप में मापा जाता है. यह RFUs में प्रत्येक प्लेट रीडर उपायों प्रतिदीप्ति के बाद से, उत्सर्जन अनुपात के वास्तविक मूल्य का इस्तेमाल प्लेट रीडर पर निर्भर हो जाएगा, कि नोट करना महत्वपूर्ण है. वक्र में बाई ओर शिफ्ट द्वारा देखा के रूप में वृद्धि संवाददाता दरार में संवाददाता परिणामों के साथ ऊष्मायन समय लम्बे समय तक. तीन प्रतियों में परीक्षण डेटा अंक,, मतलब की कम एसडी प्रदर्शित और कमी आई विष लोड के साथ बढ़ उत्सर्जन अनुपात की उम्मीद प्रवृत्ति का अनुसरण करें. यह उम्मीद की प्रवृत्ति का पालन करने की परख की विफलता कमजोर पड़ने पीढ़ी या डेटा की साजिश रचने के दौरान किसी त्रुटि का संकेत हो सकता. कोई Bont / ए युक्त नियंत्रण का उत्सर्जन अनुपात भी ड्यूरिन स्थिर रहनाअविशिष्ट protease गतिविधि की कमी का संकेत है जी ऊष्मायन (चित्रा 3, इनसेट),.

दवा Bont / ए नमूने यों तो इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने का एक उदाहरण चित्रा 4 में दिखाया गया है. एक मानक वक्र शुद्ध Bont / A holotoxin साथ पीबीएस में उत्पन्न होता है और 0.9% खारा में rehydrated lyophilized बोटोक्स का एक भी 100 यू शीशी से उत्पन्न दवा उत्पाद के dilutions के साथ समानांतर में संसाधित किया गया था. (आदर्श रूप में, मानक वक्र बोटोक्स के संदर्भ बहुत से बना दिया जाएगा लेकिन इस तरह की सामग्री आसानी से उपलब्ध नहीं था.) नमूने 50 μl नमूने 10x बाध्यकारी बफर के उपयोग के बिना दो प्रतियों में परीक्षण किया गया है कि अपवाद के साथ वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर परीक्षण किया गया. मानक वक्र ए / ई पत्रकार के साथ 24 घंटे ऊष्मायन के बाद Bont / एक एकाग्रता के एक समारोह के रूप में साजिश रची गई थी. प्रत्येक अज्ञात नमूना के उत्सर्जन अनुपात तो मानक वक्र भर में अपनी चौराहे की साजिश रचने के द्वारा कल्पना की गई थी. इस परख में, लाइनमानक वक्र (20-80% परख प्रतिक्रिया विंडो) की गिरफ्तारी भाग 2.11-1.05 के एक उत्सर्जन अनुपात के बीच गिर जाता है और चित्रा में धराशायी बॉक्स ने संकेत दिया है. इस रैखिक सीमा के भीतर गिर कि तीन अज्ञात की सांद्रता तो मानक वक्र (चित्रा 4, इनसेट) से interpolated थे. यह उदाहरण एक मानक वक्र के खिलाफ किसी भी अज्ञात नमूना का पता लगाने या यों इस्तेमाल किया जाएगा कि सामान्य कार्यप्रणाली को दर्शाता है.

ताजा टमाटर और 2% दूध प्रोटोकॉल का प्रदर्शन और एक ठोस (टमाटर) और तरल भोजन (2% दूध) मैट्रिक्स दोनों का उपयोग कर संवेदनशीलता प्रदर्शित करने के लिए चुने गए हैं. इस तैयारी एक प्राकृतिक क्लोस्ट्रीडियम संदूषण के दौरान उत्पादन विष जैसा दिखता है क्योंकि कोर holotoxin और neurotoxin जुड़े प्रोटीन (NAPs) के शामिल Bont / एक जटिल इन प्रयोगों के लिए चुना गया था. चित्रा 5 ए, ए / ई रिपोर्टर की दरार के रूप में मापा Bont / ए, की वसूली में दिखाया गया है, ख के साथ मनाया जाता हैअन्य संगठनों के matrices. पत्रकार के साथ वृद्धि हुई ऊष्मायन समय परख संवेदनशीलता बढ़ जाती है, लेकिन में भोजन से ले Bont / ए से मनाया दरार के परिणाम और अविशिष्ट नहीं प्रोटीज का संकेत है, कोई विष नियंत्रण (चित्रा 5 ए, insets) के लिए कम उत्सर्जन अनुपात में परिणाम नहीं करता परख. की उम्मीद की प्रवृत्ति के साथ संवाददाता दरार कमी आई चित्रा 3, डेटा प्रदर्शित करता है कम परिवर्तनशीलता के साथ के रूप में और इस प्रकार है विष एकाग्रता की कमी हुई.

Bont / A लोद, LOQ, और दिखाया हर समय बिंदु पर दोनों खाद्य पदार्थों के लिए चुनाव आयोग 50 5 तालिका में संक्षेप हैं. लोद और LOQ कम से कम तीन और दस एसडीएस क्रमशः पृष्ठभूमि (कोई Bont / ए युक्त नमूने), नीचे एक उत्सर्जन अनुपात के साथ सबसे कम एकाग्रता नमूना के रूप में परिभाषित कर रहे हैं. Sigmoidal खुराक प्रतिक्रिया वक्र करने के लिए प्रक्षेप कम सैद्धांतिक सीमा की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि ये सीमाएं, परीक्षण किया गया डेटा अंक तक ही सीमित हैं. कुछ मैट्रिक्स कोमैट्रिक्स प्रभाव माला और धोने के दौरान मोतियों की वसूली के लिए विष के बंधन को प्रभावित कर सकते के रूप में लोद और LOQ में मैट्रिक्स परिवर्तनशीलता, उम्मीद है. यह इस फर्क इतना GPB में टमाटर के नमूने homogenize करने के लिए आवश्यक अतिरिक्त कमजोर पड़ने से परिणाम चित्रा 5 ए, में डेटा से टमाटर की तुलना में 2% दूध से अधिक विष वसूली था कि वहाँ प्रकट होता है.

एक ठोस आहार मैट्रिक्स होने के अलावा, टमाटर 10x निराकरण बफर के अलावा द्वारा हासिल की पीएच और ईओण ताकत समायोजन, परख सफलता के लिए महत्वपूर्ण है, जहां एक उल्लेखनीय नमूना प्रकार के होते हैं. के शामिल किए जाने के साथ या बिना टमाटर जब परीक्षण चित्रा 5 ब परख प्रतिक्रियाओं दिखाता है 10x निराकरण बफर. नमूनों से Bont / ए के गरीब वसूली में 10x निराकरण बफर परिणाम जोड़ने के लिए और सभी परीक्षण Bont / A सांद्रता भर में एक निरंतर उत्सर्जन अनुपात द्वारा प्रदर्शन किया है विफलता. 10x निराकरण बफर के अलावा, हालांकि, आरविष के संवेदनशील पता लगाने में esults.

Bont अलावा अन्य proteases ए / ई संवाददाता फोड़ना सकता है के बाद से संबोधित नहीं अगर जटिल matrices में निहित nonspecific proteases झूठी सकारात्मक हो सकता है. अविशिष्ट proteases खाद्य पदार्थ के नमूने लिए अंतर्जात या ऐसे क्लोस्ट्रीडियम संस्कृति supernatants रूप nonpurified Bont तैयारियों का उपयोग करते समय पेश किया जा सकता है. पूरी तरह से मनका धोने सबसे अविशिष्ट proteases निकाल देंगे, लेकिन, प्रतिक्रिया बफर करने के लिए प्रोटीज inhibitors के अलावा महत्वपूर्ण है 6 एक संशोधित ए / ई संवाददाता, BoTest KO (को संवाददाता का उपयोग क्लोस्ट्रीडियम Bont / A संस्कृति supernatants में पाया अविशिष्ट प्रोटीज गतिविधि को दर्शाता चित्रा. ). KO संवाददाता Bont / A दरार साइट उत्परिवर्तित गया है कि अपवाद के साथ एक ई / पत्रकार के रूप में ही है यह अब Bont / ए द्वारा cleaved है कि इस तरह के इसलिए, किसी भी मनाया संवाददाता दरार अविशिष्ट protease गतिविधि का परिणाम है. KO संवाददाता CLE के उच्च स्तर परavage संस्कृति पर तैरनेवाला प्रोटीज गतिविधि के एक उच्च स्तर होता है इंगित करता है, लेकिन उस गतिविधि को प्रभावी ढंग से protease inhibitors के अलावा द्वारा नकार दिया गया है.

नमूना डेटा सरल buffers और खाद्य matrices में उच्च throughput Bont / एक का पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल की उपयोगिता प्रदर्शित करता है. कुछ खाद्य पदार्थों छोटा सा परख समायोजन आवश्यकता हो सकती है, लेकिन वर्णित प्रोटोकॉल खाना प्रकार के बहुमत के साथ अच्छा परिणाम उपज चाहिए.

चित्रा 1
चित्रा 1. सुझाव थाली लेआउट. नमूने संभव बढ़त प्रभाव से बचने के लिए थाली के भीतर 60 कुओं के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं. वांछित के रूप में अज्ञात या मानक वक्र नमूने जोड़ा जा सकता है. सभी अप्रयुक्त कुओं संवाददाता ऊष्मायन के दौरान 100 μl पानी से भरा जाना चाहिए. Cliबड़ी छवि को देखने के लिए यहां सी.के..

चित्रा 2
चित्रा 2. वर्णित प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध सिंहावलोकन. प्रोटोकॉल में एक प्रमुख कदम के लिए एक लेबल बॉक्स ने संकेत दिया और अगले एक अनुमान के अनुसार परख समय (पैमाने पर नहीं) के लिए गठबंधन किया है. Nonfood नमूने नमूना प्रसंस्करण की आवश्यकता होती है और इसलिए खाद्य पदार्थों के नमूनों के बहाव के प्रोटोकॉल में प्रवेश नहीं करते. अज्ञात के लिए धारावाहिक कमजोर पड़ने पीढ़ी के आसपास धराशायी बॉक्स यह एक वैकल्पिक है इंगित करता है, लेकिन सिफारिश की, कदम. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
Bont / वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग पीबीएस में एक holotoxin की चित्रा 3. जांच.शुद्ध Bont / A holotoxin पीबीएस में नुकीला और 1 एनएम की एक ऊपरी Bont / एकाग्रता के साथ वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर परीक्षण किया गया था. सभी नमूनों तीन प्रतियों में परीक्षण किया गया और त्रुटि सलाखों के मतलब की मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं. रिपोर्टेड शक्ति विष के निर्माता के माउस bioassay परीक्षण पर आधारित है. मानक वक्र के उत्सर्जन अनुपात (434 एनएम उत्तेजना पर 470 एनएम के लिए 526 एनएम उत्सर्जन का अनुपात) ए / ई पत्रकार के साथ 2, 4, और 24 घंटे ऊष्मायन के बाद मापा और Bont / एक एकाग्रता के एक समारोह के रूप में साजिश रची गई थी . बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग बोटोक्स दवा उत्पाद के चित्रा 4. मात्रा. Lyophilized बोटोक्स दवा उत्पाद की एक एकल 100 यू शीशी resuspe था nded 220 μl 0.9% खारा में, क्रमानुसार पतला, और शुद्ध Bont / A holotoxin का उपयोग पीबीएस में किए गए एक मानक वक्र के खिलाफ अज्ञात के रूप में परीक्षण किया गया. नमूने कि 50 μl नमूने दो प्रतियों में 10x बाध्यकारी बफर के बिना परीक्षण किया गया सिवाय वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार परीक्षण किया गया. मानक वक्र चर ढलान sigmoidal खुराक प्रतिक्रिया समीकरण को मानक वक्र नमूने के उत्सर्जन अनुपात फिटिंग और Bont / एक एकाग्रता के एक समारोह के रूप में साजिश रची है द्वारा गणना की गई. यह एक / ई संवाददाता के साथ एक 24 घंटे ऊष्मायन के बाद मानक वक्र के साथ intersects जहां एक अज्ञात नमूना दिखाया गया है. रैखिक सीमा (धराशायी छायांकित बॉक्स) के भीतर गिरने अज्ञात नमूनों की सांद्रता मानक वक्र से interpolated थे. प्रत्येक बोटोक्स अज्ञात के लिए लेबल लेबल शक्ति पर आधारित नमूने में मौजूद इकाइयों की संख्या है. त्रुटि सलाखों के मतलब की मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं.टी = "_blank"> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग Bont / ए नुकीला 2% दूध और ताजा टमाटर परीक्षण की चित्रा 5. वसूली. 2% दूध और ताजा टमाटर के नमूने शुद्ध Bont / एक परिसर के साथ नुकीला और वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर परीक्षण किया गया. सभी नमूनों तीन प्रतियों में परीक्षण किया गया और त्रुटि सलाखों के मतलब की मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं. (ए) 2% दूध और ताजा टमाटर मानक घटता के उत्सर्जन अनुपात, 2 निम्नलिखित 4 मापा, और ए / ई पत्रकार के साथ 24 घंटे ऊष्मायन गया और Bont / एक शक्ति के रूप में एक समारोह साजिश रची. परख विफलता में टमाटर परीक्षण के परिणाम के दौरान 10x निराकरण बफर शामिल करने के लिए (बी) में विफलता. ताजा टमाटर के नमूनों के साथ या तटस्थ 10x के अलावा बिना या तो वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार परीक्षण किया गयाization बफर. दिखाया गया डेटा 4 घंटा समय बिंदु के लिए है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 6
जटिल matrices जब परीक्षण चित्रा 6. Protease inhibitors के लिए आवश्यक हैं. क्लोस्ट्रीडियम Bont / ए (तनाव हॉल ए) संस्कृति पर तैरनेवाला क्रमानुसार पीबीएस में पतला और साथ या protease inhibitors के बिना प्रतिक्रिया बफर करने के लिए जोड़ा गया है और दोनों एक साथ या तो वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर परीक्षण किया गया था / ई और को संवाददाताओं से. उत्सर्जन अनुपात ए / ई या KO संवाददाताओं दोनों के साथ 24 घंटे ऊष्मायन के बाद मापा और Bont / एक शक्ति के रूप में एक समारोह साजिश रची गई थी. KO रिपोर्टर के महत्वपूर्ण दरार protease inhibitors के अलावा बिना देखा गया था लेकिन उनके शामिल किए जाने से नकार दिया था. सभी नमूनों तीन प्रतियों और त्रुटि बी में परीक्षण किया गयाएआरएस मतलब की मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

बफर रचना भंडारण तापमान स्थिरता नोट्स
10x मैट्रिक्स बंधन बफर 500 मिमी HEPES-NaOH, पीएच 7.1, 250 मिमी NaCl, 1% बीच 20, 5% कैसिइन, 0.05% NaN 3 -20 या -80 डिग्री सेल्सियस विगलन पर 4 डिग्री सेल्सियस पर पांच दिनों की एक न्यूनतम के लिए स्थिर BoTest मैट्रिक्स एक बोटुलिनम डिटेक्शन किट के साथ आपूर्ति
10x मैट्रिक्स धो बफर 119 मिमी फॉस्फेट, पीएच 7.4, 1,370 मिमी NaCl, 27 मिमी KCl, 1% बीच 20 -20 या -80 डिग्री सेल्सियस विगलन पर 4 डिग्री सेल्सियस पर पांच दिनों की एक न्यूनतम के लिए स्थिर BoTest मैट्रिक्स एक बोटुलिनम डिटेक्शन किट के साथ आपूर्ति
10x निराकरण बफर 1 एम HEPES-NaOH, पीएच 8.0, 1 एम NaCl 4 डिग्री सेल्सियस 4 डिग्री सेल्सियस पर अप करने के लिए छह महीने के लिए स्थिर
10x BoTest प्रतिक्रिया बफर 500 मिमी HEPES-NaOH, पीएच 7.1, 50 मिमी NaCl, 1% बीच 20, 100 माइक्रोन ZnCl 2 -20 या -80 डिग्री सेल्सियस विगलन पर 4 डिग्री सेल्सियस पर पांच दिनों की एक न्यूनतम के लिए स्थिर BoTest मैट्रिक्स एक बोटुलिनम डिटेक्शन किट के साथ आपूर्ति
BoTest ए / ई रिपोर्टर 50 मिमी HEPES-NaOH, 10 मिमी NaCl, 15% ग्लिसरॉल में 20 माइक्रोन -80 डिग्री सेल्सियस छोटे aliquots में स्टोर. विगलन पर 4 डिग्री सेल्सियस पर पांच दिनों की एक न्यूनतम के लिए स्थिर. BoTest मैट्रिक्स एक बोटुलिनम डिटेक्शन किट के साथ आपूर्ति
जिलेटिन फॉस्फेट बफर (GPB) 33.3 मिमी नाह 2 4 पीओ, पीएच 6.2, 2 ग्राम / एल जिलेटिन 4 डिग्री सेल्सियस 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 1 महीने के लिए स्थिर
200x dithiothreitol (डीटीटी) 1 एम डीटीटी -20 डिग्री सेल्सियस -20 डिग्री सेल्सियस पर अप करने के लिए 6 महीने के लिए स्थिर बनाओ और छोटे (100 μl) aliquots की दुकान
1x पीबीएस आयकर 11.9 मिमी फॉस्फेट, 7.4 पीएच, 137 मिमी NaCl, 2.7 मिमी KCl, 0.1% बीच 20 4 डिग्री सेल्सियस 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 1 महीने के लिए स्थिर 10x फिशर से पीबीएस (BP399-1) का उपयोग किया जा सकता है
मैट्रिक्स एक मोती (आईपी एक मोती) चुंबकीय मोती covalently पीबीएस में चिकन विरोधी Bont / A प्रतिरक्षी संयुग्मित. 0.1% बीच 20, 0,05% सोडियम, 0.25% कैसिइन, और 50% ग्लिसरॉल -20 डिग्री सेल्सियस -20 डिग्री सेल्सियस से हटाने पर 4 डिग्री सेल्सियस पर पांच दिनों की एक न्यूनतम के लिए स्थिर -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज नहीं है

तालिका 1. वर्णित प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक बफ़र. 10x निराकरणबफर केवल अत्यधिक जटिल (जैसे भोजन) नमूने के लिए है और assayed किया जा रहा नमूनों की प्रकृति के आधार पर आवश्यक नहीं किया जा सकता है.

सामग्री / उपकरण के नाम कंपनी सूची संख्या टिप्पणियाँ / वर्णन
BoTest मैट्रिक्स एक बोटुलिनम neurotoxin जांच किट BioSentinel A1015 Bont / बी और एफ पता लगाने के लिए किट भी उपलब्ध हैं.
Varioskan फ्लैश प्रतिदीप्ति microplate रीडर थर्मो फिशर साइंटिफिक 5250040 434 एनएम उत्तेजना और 470 एनएम और 526 एनएम उत्सर्जन क्षमता के साथ सबसे monochromator या फिल्टर आधारित इकाइयों में इस्तेमाल किया जा सकता है.
96 अच्छी तरह चुंबकीय मनका पृथक्करण प्लेट वी एंड पी वैज्ञानिक VP771H अन्य चुंबकीय प्लेटों का इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन थाली बी अलग करने के लिए डिजाइन किया जाना चाहिएअच्छी तरह से पक्ष को ईएडीएस.
चुंबकीय मनका संगत प्लेट वॉशर बायोटेक ELx405 VSRM वैकल्पिक, केवल स्वचालित प्लेट धोने के लिए जरूरी है. अन्य चुंबकीय मनका संगत थाली वाशर भी इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन उपयोग करने से पहले परीक्षण किया जाना चाहिए.
Microcentrifuge विभिन्न N / A वैकल्पिक, केवल centrifugation जरूरत के नमूने के लिए जरूरी है.
MixMate थाली मिक्सर Eppendorf 22674200
कक्षीय शेखर विभिन्न N / A तापमान नियंत्रण उपलब्ध है, तो आरटी पर या 25 डिग्री सेल्सियस पर प्रयुक्त
EDTA मुक्त protease अवरोध करनेवाला गोलियाँ रॉश 4693132001 केवल खाना या पर्यावरणीय परीक्षण के लिए आवश्यक. Protease inhibitors EDTA से मुक्त होना चाहिए.
Bont / A Metabiologics N / A वैकल्पिक, केवल मानकीकरण और मात्रा का ठहराव प्रयोजनों के लिए आवश्यक
काले, फ्लैट तली 96 अच्छी तरह प्लेटें NUNC 237,105 प्लेट्स नहीं माना जाना चाहिए
96 अच्छी तरह से थाली सील टेप थर्मो वैज्ञानिक 15,036

तालिका 2. सामग्री और वर्णित प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक उपकरण. कुछ सामग्री और उपकरण वैकल्पिक हैं या उपलब्ध उपकरणों के आधार पर प्रतिस्थापित किया जा सकता है. अतिरिक्त उपयुक्तता परीक्षण और अनुकूलन वैकल्पिक उपकरण का उपयोग कर यदि आवश्यक हो सकता है.

</ Tr>
नमूना नाम वॉल्यूम विष वॉल्यूम मंदक [Bont / ए] (एमएलडी 50 / एमएल) या (एमएलडी 50 / जी भोजन) लॉग इन करें [Bont / ए] (एमएलडी 50 / एमएल) या (एमएलडी 50 / जी भोजन) डी 1 1,200 μl शेयर N / A 30,000 4.48
डी 2 300 μl डी 1 600 μl 10,000 4
डी 3 90 μl डी 1 810 μl 3,000 3.48
D4 90 μl डी 2 810 μl 1,000 3
D5 90 μl डी 3 810 μl 300 2.48
डी 6 90 μl D4 810 μl 100 2
D7 90 μl D5 810 μl 30 1.48
D8 90 μl डी 6 810 μl 10 1
D9 N / A 1400 μl N / A N / A

तालिका 3:. मानक वक्र के नमूने लिए कमजोर पड़ने तालिका को तालिका परिमाण के 3.5 आदेश पर आधा लॉग dilutions में एक मानक वक्र उत्पन्न करता है. पर्याप्त नहीं Bont खाली नमूना (D9) = 6 एक एन चलाने के लिए उत्पन्न होता है. अगर वांछित अतिरिक्त dilutions जोड़ा जा सकता है.

<टीडी> 0
प्रोग्राम नाम परिवर्तनशील मूल्य टिप्पणियां
प्रधान अभिकर्मक बोतल एक
प्रधानमंत्री वॉल्यूम 400
प्रधानमंत्री फ्लो दर 7
प्रधानमंत्री के बाद लेना? एन
मैट्रिक्स धो अभिकर्मक बोतल एक अवशिष्ट प्रोटीज गतिविधि मनाया जाता है washes की संख्या बढ़ाई जा सकती है.
विधि
4
/ शेक लेना वाई
अवधि लेना 180
भिगोएँ से पहले हिला? एन
प्रधानमंत्री के बाद लेना? एन
Disp
वॉल्यूम बांटना 300
फ्लो दर बांटना 5
लंबाई बांटना 130
होर. स्थिति बांटना. 0
महाप्राण अक्षम करें? वाई
नीचे धो पहले? एन
शुरू होने से पहले प्रधानमंत्री? एन
Aspir
आकांक्षा लंबाई 40
होर. महाप्राण स्थिति. 0
आकांक्षा दर 5
आकांक्षा विलंब
आड़े महाप्राण? एन
आकांक्षा अंतिम? वाई
अंतिम आकांक्षा विलंब 0
मैट्रिक्स लेना अवधि लेना 300 बढ़ी हुई सोख अवधि अधिक चिपचिपा खाद्य पदार्थों से मनका वसूली में वृद्धि हो सकती है.
भिगोएँ से पहले हिला? एन
मास्टर धो मैट्रिक्स लेना इस मैट्रिक्स लेना चलाने के लिए एक 'लिंक' कार्यक्रम है और एक साथ मैट्रिक्स धो कार्यक्रम.
मैट्रिक्स धो

तालिका 4. चुंबकीय मनका संगत स्वचालित प्लेट वॉशर प्रोग्राम सेटिंग्स. निम्नलिखित कार्यक्रमों प्लेट वॉशर वेल्स की ओर करने के लिए और कहा कि मोती खींचती है कि एक चुंबक के साथ सुसज्जित है कि मान मॉड्यूल स्विचन बफर है कि इस तरह की स्थापना की है 1x धो बफर ( पीबी एस टी) इन कार्यक्रमों बायोटेक ELx405 के लिए विशिष्ट हैं वाल्व ए से जुड़ा हुआ है. प्रोग्रामिंग निर्देश के लिए साधन संदर्भ लें. अन्य चुंबकीय मनका संगत स्वचालित थाली वाशर या निर्वात manifolds इस्तेमाल किया जा सकता है, तथापि, परीक्षण धोने क्षमता को अधिकतम सेटिंग्स है कि परिभाषित और धोने के दौरान मनका नुकसान को कम करने के लिए आवश्यक हो जाएगा. वॉशिंग निम्नलिखित मनका वसूली के प्रारंभिक परीक्षण की परवाह किए बिना इस्तेमाल किया विशिष्ट प्लेट वॉशर की सिफारिश की है.

<टीडी> लोद
खाद्य मैट्रिक्स मीटरी 2 घंटा 4 घंटा 24 घंटा
एमएलडी 50 / जी खाना एमएलडी 50 / अच्छी तरह से एमएलडी 50 / जी खाना एमएलडी 50 / अच्छी तरह से एमएलडी 50 / जी खाना एमएलडी 50 / अच्छी तरह से
दूध 300 58 100 19 30 6
LOQ 1,000 193 300 58 100 19
चुनाव आयोग 50 2404 464 590 114 92 18
ताजा टमाटर लोद 1,000 91 300 27 30 3
LOQ 1,000 91 1,000 91 100 9
चुनाव आयोग 50 7561 687 1932 176 229 21

सारणी 5. पता लगाने की सीमा (लोद), मात्रा का ठहराव की सीमा (LOQ), और आधा मीटरलोद और LOQ गिर जाता है कि सबसे कम एकाग्रता डेटा बिंदु होने के रूप में परिभाषित कर रहे हैं, जबकि चित्रा 2A में दिखाया 2% दूध और ताजा टमाटर के परीक्षण के लिए aximal प्रभावी एकाग्रता (ईसी 50). चुनाव आयोग 50 sigmoidal खुराक प्रतिक्रिया वक्र फिट से प्राप्त होता है कोई Bont नियंत्रण (एन = 6), क्रमशः नीचे 3 या 10 या तो मानक विचलन. डेटा एमएलडी 50 / छ खाद्य और 200 μl नमूना मात्रा में अच्छी तरह से प्रति परीक्षण किया कुल एमएलडी 50 S दोनों में प्रस्तुत कर रहे हैं.

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Discussion

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इस प्रोटोकॉल Bont / जटिल matrices में एक जटिल, holotoxin, या क्लोस्ट्रीडियम संस्कृति पर तैरनेवाला बढ़ाता के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन है. परख संवेदनशीलता सीरमप्रकारों और assays भर में अलग अलग होंगे, हालांकि उनके संबंधित मैट्रिक्स assays 56,60 साथ अन्य Bont सीरमप्रकारों (जैसे Bont / बी, ई, एफ और) जब परीक्षण प्रोटोकॉल, हालांकि, एक ही है. इस प्रोटोकॉल संभव नमूना के हर प्रकार के लिए खाते में नहीं है और कुछ संशोधनों के विशिष्ट नमूना रचना और वांछित आवेदन के आधार पर आवश्यक हो सकता है. Matrices भोजन के नमूने (जैसे खाद्य चुनौती परीक्षण) या दवा excipient बफ़र्स (जैसे Bont आधारित दवा उत्पाद परीक्षण) शामिल कर सकते हैं. परिसर nonfood (जैसे पशु ऊतक या पर्यावरण) तरल और ठोस नमूने खाद्य नमूने के रूप में व्यवहार किया जाना चाहिए. इस प्रोटोकॉल 200 μl / अच्छी तरह से नमूना संस्करणों का उपयोग करता है, लेकिन के रूप में छोटे रूप में 50 μl / अच्छी तरह से 10x bindin की मात्रा को एक इसी समायोजन के साथ परीक्षण किया जा सकता हैजी बफर. 50 μl की तुलना में छोटे नमूने के परीक्षण से पहले ≥ 50 μl को GPB या पीबीएस के साथ पतला होना चाहिए.

खाद्य पदार्थों के अत्यधिक परिवर्तनशील प्रकृति भोजन में Bont का पता लगाने और मात्रा का ठहराव के लिए एक विशेष चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है. नमूना पीएच, चिपचिपाहट, ईओण ताकत, और बात कण की उपस्थिति सभी संभावित खाद्य मैट्रिक्स के भीतर विष की गतिविधि को प्रभावित और विष सही, इन विट्रो मात्रा का ठहराव के लिए भोजन से अलग किया जाना है कि जरूरत सकता है. कई खाद्य पदार्थों या विष की तैयारी भी हटा या केवल Bont विशेष प्रोटीज गतिविधि मापा जाता है यह सुनिश्चित करने के लिए प्रोटीन आधारित संवाददाताओं का उपयोग करते समय निष्क्रिय किया जाना चाहिए कि अंतर्जात proteases होते हैं. ऐसी दवा excipient buffers के रूप में भी सरल, अच्छी तरह से परिभाषित बफर, matrices, मात्रा का ठहराव 35,56-59,61 से पहले हटा दिया जाना चाहिए कि Bont गतिविधि के साथ हस्तक्षेप यौगिकों शामिल कर सकते हैं. Immunoprecipitation एक तेज, अत्यधिक सीरोटाइप विशेष Bont पुरी प्रदान करता हैदिखाएं विधि लेकिन "वास्तविक दुनिया" खाद्य, पर्यावरण, और दवा के नमूने में पाया कम विष सांद्रता अलग करने के लिए उच्च आत्मीयता एंटीबॉडी की आवश्यकता है.

वर्णित प्रोटोकॉल Bont / एक कोर holotoxin 56 के विष भारी श्रृंखला रिसेप्टर डोमेन की ओर निर्देशित विरोधी Bont / ए एंटीबॉडी के साथ लेपित समचुंबक मोती का उपयोग विष शुद्ध. क्लोस्ट्रीडियम प्रजातियों, तथापि, स्वाभाविक रूप से संघ में कोर holotoxin से मिलकर विष परिसरों का उत्पादन NAPs 62-64 के साथ. NAPs आंतों में प्रोटीज हमले से विष की रक्षा और आंत उपकला 63,65 भर में विष परिवहन की सुविधा के लिए माना जाता है. NAPs कोर holotoxin (नहीं दिखाया डेटा) के लिए आईपी एक मनका विरोधी Bont / ए एंटीबॉडी के बंधन को बाधित. इस निषेध Bont / A holotoxin और NAPs में अलग कर देना करने के लिए जटिल और अनुमति प्रभावी विष के कारण 6.25 ~ ऊपर करने के लिए नमूना पीएच में वृद्धि से राहत मिली हैआईपी ​​एक के लिए बाध्य 66 मोती. इस कारण से, 6.5 से ऊपर के लिए नमूना पीएच एडजस्ट परख (चित्रा 5 ब) की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है. प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता 10x बाध्यकारी बफर मानक परख शर्तों को पीएच जुटाने में मदद करने के लिए एक बफरिंग एजेंट होता है. हालांकि, कई अम्लीय खाद्य पदार्थ बाध्यकारी बफर की बफरिंग क्षमता डूब कर सकते हैं. अतिरिक्त 10x निराकरण बफर बहुत नमूना बफरिंग क्षमता बढ़ जाती है और खाद्य matrices के बहुमत बेअसर चाहिए.

परख के लिए एक अन्य महत्वपूर्ण पैरामीटर नमूना ईओण ताकत है. Centrifugation द्वारा नमूनों का स्पष्टीकरण immunoprecipitation निम्नलिखित प्रभावी मनका धोने और वसूली के लिए आवश्यक है. ताजा टमाटर के साथ परीक्षण के नमूने बस संसाधित और centrifuged थे जब कोई Bont / A वसूली में देखा गया था कि पता चला. हम Bont / A यह centrifugation के दौरान गोली के कारण टमाटर मांस के साथ सहयोगी और से अनुपस्थित हो सकते हैं धारणा है किपरीक्षण किया सतह पर तैरनेवाला. हमने पाया है कि Bont और बेहतर विष वसूली (चित्रा 5 ब) में जिसके परिणामस्वरूप मैट्रिक्स के बीच पीएच सीमित बातचीत उदासीन, इससे भी ज्यादा महत्वपूर्ण ईओण ताकत बढ़ाने या. Bont वसूली के लिए आवश्यक नहीं है, यह उच्च नमक सांद्रता भी immunoprecipitation की तंगी वृद्धि और कम nonspecific प्रोटीन वसूली में परिणाम, विशेष रूप से कम नमक खाद्य पदार्थों में होगा कि, का प्रदर्शन नहीं है, हालांकि उम्मीद है.

नमूना पीएच और प्रोटोकॉल में ईओण ताकत समायोजन 10x निराकरण बफर के अलावा द्वारा किया जाता है और खाद्य पदार्थों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ संगत होना चाहिए. 10x निराकरण बफर एक उच्च बफरिंग क्षमता है, वहीं कुछ अत्यधिक अम्लीय खाद्य पदार्थ अतिरिक्त पीएच समायोजन की आवश्यकता हो सकती है. बफर अलावा निम्न नमूना पीएच का परीक्षण गरीब परख प्रदर्शन मनाया जाता है की सिफारिश की और नमूना मात्रा की अनुमति देता है. अपर पीएच समायोजन है के अलावा के माध्यम से हासिल किया जा सकता है1 एम HEPES पीएच 8 के मॉल की मात्रा, यदि आवश्यक हो. खराब परिणाम किसी दिए गए खाद्य पदार्थों के साथ देखा जाता है हालांकि, अगर 10x निराकरण बफर 1 एम HEPES पीएच 8 के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है, 10x निराकरण बफर द्वारा शुरू की अतिरिक्त NaCl saltiest खाद्य पदार्थ है, लेकिन सभी के लिए स्वीकार्य होना चाहिए. पीबीएस में 1.2 मीटर तक NaCl सांद्रता में वर्णित प्रोटोकॉल का परीक्षण जब कोई महत्वपूर्ण अंतर देखा गया है.

इस प्रोटोकॉल के नमूने के बहुमत के लिए लागू है, पीएच, ईओण ताकत, और / या प्रोटीज सामग्री के चरम पर खाद्य पदार्थों परख के साथ अच्छे परिणाम नहीं हो सकता है. कुछ खाद्य पदार्थ भी गरीब मनका वसूली में जिसके परिणामस्वरूप, GPB के अलावा के बाद भी चिपचिपा रह सकती है. ऐसे पीबीएस के रूप में एक सरल बफर के साथ नमूने की Predilution परिणामों में सुधार हो सकता है. Washes की संख्या बढ़ाने या (बढ़ती NaCl एकाग्रता से) तंगी धोने और EDTA मुक्त protease inhibitors की एकाग्रता में वृद्धि भी परिणाम में सुधार हो सकता है अगर अविशिष्ट प्रोटीज contaminatआयन मनाया जाता है. स्वचालित प्लेट धोने का उपयोग करते समय, साधन सफाई भी बहुत महत्वपूर्ण है. अन्य प्रयोगशाला assays से proteases (जैसे trypsin) के साथ पाइपलाइन और इंजेक्शन नलिका के प्रदूषण परख के दौरान proteases की अनजाने में शुरुआत करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. निर्माता के उपयोगकर्ता पुस्तिका के अनुसार प्लेट वॉशर की पूरी तरह से सफाई परख चलाने से पहले की सिफारिश की है.

BoTest मैट्रिक्स assays जटिल matrices में Bont का पता लगाने और मात्रा का ठहराव के लिए पहली commercialized, गतिविधि आधारित assays हैं. मानक माउस bioassay की तुलना में, परख कम खर्चीला है, जल्दी है, और विशेष सुविधाओं या जानवर उपयोग 56 के बारे में नैतिक चिंताओं के लिए आवश्यकता के बिना उच्च throughput परीक्षण की अनुमति देता है. अन्य में इन विट्रो Bont तरीकों का पता लगाने का वर्णन किया गया है, लेकिन जटिल नमूना matrices के साथ संगत होना करने के लिए नहीं दिखाया गया है, विशेष उपकरणों की आवश्यकता है, या व्यावसायिक रूप availab नहीं हैंLe 35,42-44,46-55. assays भी पारंपरिक एंजाइम से जुड़ी immunosorbant परख (एलिसा) तकनीक केवल विष जन रिपोर्ट, जबकि विष endoprotease गतिविधि को मापने कि गतिविधि आधारित assays हैं. गतिविधि आधारित एलिसा assays पहले से वर्णित किया गया है, लेकिन इन assays खाद्य matrices के साथ काम करने के लिए और नमूना मैट्रिक्स 41 से विष की शुद्धि धरना नहीं है का प्रदर्शन नहीं किया गया. मैट्रिक्स यौगिकों अक्सर Bont गतिविधि 35,56-59 के साथ हस्तक्षेप के बाद विष नमूना से शुद्ध नहीं है अगर जटिल नमूनों की विषाक्तता के महत्वपूर्ण मूल्यवान समझना हो सकती है.

प्रोटोकॉल में महारत हासिल हो जाने के बाद संशोधनों नमूना मात्रा में वृद्धि और नमूना संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, मोतियों के लिए विष के बंधन centrifugation द्वारा संग्रह से पहले बड़ा, थोक नमूने (जैसे 10 मिलीलीटर या अधिक) में किया जा सकता है. ये माला तो एक 96 अच्छी तरह से थाली में जोड़ा और वर्णन निम्नलिखित assayed किया जा सकता हैडी प्रोटोकॉल. एक प्रवेश से अधिक संवेदनशीलता में वृद्धि वृद्धि हुई नमूने का आकार 56 के साथ मनाया गया है. इस प्रकार, वर्णित प्रोटोकॉल का पता लगाने के भी माउस bioassay से नहीं चल पाता जा सकते हैं कि नमूने में निहित Bont की मात्रा का पता लगाने के लिए बड़ी मात्रा में नमूनों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Disclosures

एफएम Dunning, टीएम पियाजा, एफ Zeytin, और WC टकर BioSentinel इंक BioSentinel के कर्मचारियों या मालिक हैं वर्तमान में निर्माण और इस रिपोर्ट में प्रस्तुत अभिकर्मकों के कुछ वाणिज्यीकरण किया गया है.

Acknowledgments

लेखकों बहुमूल्य विचार विमर्श और सलाह के लिए एच. Olivares और डी. Ruge धन्यवाद देना चाहूंगा. यह शोध एक NSF एसबीआईआर पुरस्कार (BioSentinel इंक के लिए आईआईपी-1127245) और रक्षा विभाग के एक अनुबंध (BioSentinel इंक को W81XWH-07-2-0045) द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit BioSentinel A1015 Detection kits for BoNT/B and F are also available.
Varioskan Flash fluorescence microplate reader Thermo Fisher Scientific 5250040 Most monochromator- or filter-based units with 434 nm excitation and 470 nm and 526 nm emission capability can be used.
96-well Magnetic Bead Separation Plate V&P Scientific VP771H Other magnetic plates may be used, but the plate should be designed to separate the beads to the side of the well.
Magnetic Bead-Compatible Plate Washer BioTek ELx405 VSRM Optional, only required for automated plate washing.  Other magnetic bead-compatible plate washers may also be used, but should be tested before use.
Microcentrifuge Optional, only required for samples needing centrifugation.
MixMate plate mixer Eppendorf 22674200
Orbital Shaker Used at room temperature or at 25 °C If temperature control is available
EDTA-free Protease Inhibitor Tablets Roche 4693132001 Only required for food or environmental testing. Protease inhibitors must be EDTA-free.
BoNT/A Metabiologics Optional, only required for standardization and quantification purposes
Black, Flat-bottomed 96-well Plates NUNC 237105 Plates should not be treated
96-well Plate Sealing Tape Thermo Fisher Scientific 15036

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References

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BoTest मैट्रिक्स assays का उपयोग जटिल matrices से अलगाव और बोटुलिनम neurotoxin की मात्रा
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Dunning, F. M., Piazza, T. M., Zeytin, F. N., Tucker, W. C. Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays. J. Vis. Exp. (85), e51170, doi:10.3791/51170 (2014).More

Dunning, F. M., Piazza, T. M., Zeytin, F. N., Tucker, W. C. Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays. J. Vis. Exp. (85), e51170, doi:10.3791/51170 (2014).

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