Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Isolatie en kwantificering van botulineneurotoxine uit complexe matrices gebruiken BoTest Matrix Testen

doi: 10.3791/51170 Published: March 3, 2014

Summary

De BoTest Matrix botulinum neurotoxine (BoNT) opsporingsanalyses snel te zuiveren en te kwantificeren BoNT uit een reeks van monstermatrices. Hier presenteren we een protocol voor de detectie en kwantificering van BoNT uit zowel vaste als vloeibare matrices en demonstreren van de test met BOTOX, tomaten en melk.

Abstract

Nauwkeurige detectie en kwantificering van botulinum neurotoxine (BoNT) in complexe matrices is vereist voor de farmaceutische-, milieu-, en voedsel steekproeven. Rapid BoNT testen van levensmiddelen is nodig tijdens uitbraak forensisch onderzoek, patiënt de diagnose en voedselveiligheid testen is nauwkeurig de werkzaamheid is vereist voor BoNT-based drug fabricage van de producten en de veiligheid van de patiënt. Het op grote schaal gebruikt bioassay in muizen voor BoNT testen is zeer gevoelig, maar mist de precisie en doorvoer nodig is voor een snelle en routinematige BoNT testen. Bovendien is de bioassay's gebruik van dieren heeft geleid tot oproepen van geneesmiddel regelgevende instanties en voorstanders van dieren-rechten in de VS en het buitenland om de muis bioassay voor BoNT testen vervangen. Verschillende in vitro vervangende tests zijn ontwikkeld die goed werken met gezuiverd BoNT in eenvoudige buffers, maar de meeste niet aangetoond voor testen in zeer complexe matrices zijn. Hier, een protocol voor de detectie vanBoNT in complexe matrices met de BoTest Matrix assays gepresenteerd. De test bestaat uit drie delen: Het eerste deel omvat de voorbereiding van de monsters voor het testen, het tweede deel is een immunoprecipitatie stap met behulp van anti-BoNT-antilichaam beklede paramagnetische kralen te zuiveren BoNT uit de matrix, en het derde deel kwantificeert de geïsoleerde Bont proteolytische activiteit met behulp van een fluorogeen reporter. Het protocol is geschreven voor high throughput testen in 96-well platen met zowel vloeibare als vaste matrices en is ongeveer 2 uur handmatig preparaat met in totaal assay tijd van 4-26 uur, afhankelijk van het type monster toxine belasting en de gewenste gevoeligheid. Gegevens zijn weergegeven voor BoNT / A test met fosfaat gebufferde zoutoplossing, een geneesmiddel, kweeksupernatant, 2% melk en verse tomaten en omvat bespreking van kritische parameters voor de test succesvol.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Botulinum neurotoxinen (Bonts) zijn de dodelijkste bekende stoffen, met intraveneuze menselijke dodelijke doses geschat op 1-3 ng / kg 1,2. Zeven structureel vergelijkbare serotypen van BoNT, A tot en met G, bestaan ​​elk uit een zware keten domein verantwoordelijk voor celbinding, opname en translocatie naar het cytosol en een lichte keten die een zink-endopeptidase 3-5 codeert. De exquise toxiciteit van BoNT voortvloeit uit, voor een deel, de specifieke binding en inwerking motorische neuronen in de neuromusculaire verbinding 6. Eenmaal binnen het neuron, het lichte keten endopeptidase splitst specifiek een of meer van de oplosbare N-ethylmaleimide-gevoelige factor attachment eiwitreceptor (SNARE) proteïnen vereist voor vesikel fusie, remmende neurotransmitter en leidt tot zwakke verlamming 7-14. Algemeen bekend als de ziekte 'botulisme, "verlamming van het diafragma en tussenribspieren door BoNT uiteindelijk totrespiratoire insufficiëntie en de dood, tenzij een vroege diagnose en behandeling zijn ontvangen.

Menselijke voedselbotulisme wordt meestal geassocieerd met BoNT serotypen A, B, E en F (BoNT / A, BoNT / B, enz.) en meestal het gevolg van de inname van besmet voedsel 15,16, hoewel verscheidene gevallen wondbotulisme werden gemeld bij intraveneuze druggebruikers 17,18. In de Verenigde Staten, infantiel botulisme als gevolg van de inname van Clostridium sporen door kinderen onder de leeftijd van een is de meest voorkomende vorm van botulisme 19-21. Echter, door voedsel overgedragen BoNT uitbraken als gevolg van onjuist thuis inblikken en verwerking van levensmiddelen werden gemeld in zowel de Verenigde Staten en in het buitenland. Tussen 2000-2009 werden ten minste 338 gevallen van voedselbotulisme wereldwijd gemeld waaronder zes dodelijke slachtoffers 22. De mogelijkheid om voedselbotulisme uitbraken snel en gevoelig op te sporen is een kritische indicatie dat een vroege diagnose zou kunnen helpen 23,24. Bovendien zal detectiemethoden die kosteneffectief en routinematig testen van voedsel laten leiden tot een betere voedselzekerheid.

Neuronale specificiteit en lange biologische halfwaardetijd BoNT maakt het een krachtige therapeutische ook. In de Verenigde Staten, zijn BoNT-gebaseerde geneesmiddelen goedgekeurd door de Food and Drug Administration voor de behandeling van cosmetische voorwaarden en-neuromusculaire-gerelateerde aandoeningen, waaronder glabellalijnen, cervicale dystonie, migraine, overactieve blaas, en scheelzien. Tal van "off-label"-toepassingen zijn gedocumenteerd, met inbegrip van hoge-dosis behandelingen voor ernstige spier-disfunctie 25-28. Nauwkeurige kwantificering toxine is essentieel voor een juiste dosering, als onderdosering kan leiden tot ineffectieve behandeling, terwijl overdosering brengt patiënten met een risico van potentieel schadelijke bijwerkingen. Helaas is er geen gestandaardiseerde potentie assayprotocol gedeeld over fabrikanten, wat resulteert in eenheid definitie ongelijkheid tussen BoNT-based drug products 29-31.

De standaard test voor BoNT de muizen bioassay waarin BoNT-houdende monsters intraperitoneaal worden geïnjecteerd in muizen en het aantal sterfgevallen geconstateerd gedurende 1-7 dagen 16,32,33. De muis bioassay is zeer gevoelig met detectielimiet (LOD) van 5-10 pg BoNT / A 34, maar de ethische bezorgdheid over het gebruik van dieren, de hoge kosten van de opleiding van personeel en het onderhoud dier faciliteiten, lange assay keer, en het gebrek aan gestandaardiseerde protocollen geleid tot oproepen om gestandaardiseerde, diervrije BoNT testen en kwantificeringsmethoden 35-39 ontwikkelen. Onlangs werden een aantal alternatieve BoNT kwantificeringsmethoden ontwikkeld die muis of bijna-bioassay gevoeligheid 40-49 bieden. Deze methoden vaak gebruikt fluorescentie, massa-spectrometrie, of immunologische methoden en bieden testtijden aanzienlijk korter dan de bioassay in muizen zonder dierproeven. Massaspectrometrie benaderingen gecombineerd met immunologische techniqwaarden bleken te detecteren en kwantificeren BoNT in voedsel en andere complexe monsters, maar de opleiding van personeel eisen en gespecialiseerde apparatuur limiet deze assays 50-55. De meeste andere alternatieve tests zijn niet direct van toepassing op complexe steekproeven of missen de doorvoer nodig is voor routine BoNT testen. De sterk variabele aard van voedsel monster viscositeit, pH, zoutgehalte, en matrixbestanddelen presenteert een bijzonder moeilijke uitdaging wanneer het proberen om in vitro assay methodes met gevoeligheid voor de extreme kracht van BoNT overeen te ontwikkelen. Zelfs eenvoudige en relatief goedaardige buffersystemen, zoals die welke voortvloeien uit resuspensie van BoNT gebaseerde geneesmiddelen bevatten zout, albumine, suiker en stabilisatoren (bijvoorbeeld excipiënten) die grote invloed in vitro potentie BoNT 56. Toxine zuivering vereist voor nauwkeurige activiteit testen van alle maar de eenvoudigste monsters 56-59.

DeBoTest Matrix testen werden ontworpen voor een snelle, high-throughput, en consistente kwantificering van BoNT van zeer complexe monsters met behulp van apparatuur vaak gevonden in onderzoekslaboratoria 56,60. Deze testen gebruiken paramagnetische kralen covalent gebonden aan serotype-specifieke anti-BoNT antilichamen te binden en afzonderen BoNT uit een steekproef en verwijder storende matrix verbindingen door wassen. Na het wassen wordt gebonden BoNT proteolytische activiteit dan gekwantificeerd in een geoptimaliseerde reactie buffer met behulp van een verslaggever compatibel met de BoNT serotype wordt getest. Deze reporters fluorogene eiwitten bestaande uit een N-terminale cyaan fluorescerend eiwit (CFP) deel en een C-eindstandige geel fluorescerend proteïne derivaat (Venus) groep verbonden door een BoNT substraat, SNAP25 residuen 141-206 of synaptobrevin residuen 33-94 die de BoTest A / E of B / D / F / G verslaggevers, respectievelijk 45. Reporter splitsing door BoNT wordt bewaakt door middel Förster resonance energie-overdracht (FRET). Als thij verslaggever is intact, excitatie van GVB resulteert in FRET naar Venus, afschrikken GVB emissie en spannende Venus emissie. Splitsing van de reporter door BoNT FRET voorkomt, wat leidt tot een toename GVB emissie en afname Venus emissie. BoNT activiteit kan dan kwantitatief worden gemeten met behulp van de verhouding van het GVB en Venus uitstoot. LOD onder 3 pg mogelijk uit een breed scala van voedingsmiddelen met behulp van een high-throughput 96-well plaat formaat 56. Verhoogde gevoeligheid kan worden verkregen met grotere monstervolumes aangezien de test maakt concentratie van het toxine op de korrel oppervlak.

De BoTest Matrix assays voor Bonts A, B, E, en F werden ontwikkeld en getest met voedings-, farmaceutische, en milieu-monsters 56,60. Hier beschrijven we de procedures voor het uitvoeren van deze tests voor de detectie van BoNT lage complexiteit (bijv. farmaceutische, BoNT in buffer) en grote complexiteit (bijvoorbeeld voeding, milieu) monsters. Specifieke verwerkingsmethodenvoor verschillende soorten monsters worden in dit protocol en soorten monsters hier niet beschreven kan meestal worden aangepast met behulp van een combinatie van de gepresenteerde methoden. Het protocol is ontwikkeld en getest met BoNT / A, maar is aan te passen aan andere BoNT serotypen middel van hun respectieve testen zoals elders 56,60 aangetoond.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Bereiding van Assay Reagents

  1. Ontdooi 200x dithiothreitol (DTT), 10x Matrix bindingsbuffer (10x Binding buffer hierna), 10x neutralisatie buffer (pH alleen voedsel of onevenwichtige monsters) en BoTest 10x reactiebuffer (10X Reaction Buffer hierna) bij kamertemperatuur (KT) gedurende 15 min of totdat het volledig ontdooid. Zie tabel 1 voor een overzicht van buffers en reagentia die in dit protocol. Zie tabel 2 voor een lijst van materialen en apparatuur die nodig is voor dit protocol.
  2. Vortex de ontdooide buffers 5 seconden om te mengen. 10x neutralisatiebuffer 200xDTT en 10x Reaction buffer moet duidelijk zichtbaar worden terwijl de 10x Binding buffer een troebel uiterlijk zal hebben. Verwarm de 10x reactiebuffer gedurende 5 minuten bij 37 ° C en herhaal vortexen wanneer het troebel na ontdooien.
  3. Genereer 3.8 ml 1x Reaction buffer.
    1. Label een 15 ml conische buis "1x Reaction buffer" en voeg 3,42 ml moleculaire biologie leerjaar wateh, 380 ul 10x Reaction buffer en 19 pl 200x DTT. Meng buffer goed door.
    2. Snijd een EDTA-vrije proteaseremmer tablet wijken met een schone scheermesje en voeg een kwart van de tablet de reactie 1x buffer (de overige tablet gedeelte kan worden opgeslagen bij 4 ° C voor later gebruik). NB Proteaseremmers mag nodig zijn bij gebruik van gezuiverd toxine en simpele buffers (bijv. farmaceutische monsters).
    3. Vortex het 1x Reaction buffer totdat de protease tablet volledig is opgelost.
  4. Verwarm de matrix A kralen (IP-A-parels hierna) gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Ontdooi de BoTest A / E reporter (A / E reporter hierna) bij kamertemperatuur beschermd tegen licht.
  6. Label een 15 ml conische buis "0,5 uM A / E reporter" en voeg 45 ul van de 20 uM A / E reporter voorraad tot 1,8 ml 1x Reaction buffer. Meng goed door pipetteren en op te slaan op ijs beschermd tegen licht.

2. Staanard Curve Sample Generation

De standaardkromme beschreven omvat 10-30,000 sounddecoder 50 / g voedsel of per ml buffer in half-log verdunningen (Tabel 3). De eindgebruiker is vrij om alternatieve concentraties gebruiken als toepasselijk.

  1. Spiking en incuberen van de matrices met referentiemateriaal. Genereer de standaardcurve met behulp van een verdunningsmiddel van dezelfde matrix als onbekende, indien mogelijk, om matrix te verminderen. Gebruik gelatine fosfaatbuffer (GPB) of fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) als verdunningsmiddel of aanvullende BoNT-negatieve matrix niet beschikbaar (bijv. veld of BoNT uitbraak steekproeven). Genereer de standaard curve door stekelige BoNT / A in de matrix van de keuze na het geschikte protocol hieronder.
    1. Lage complexiteit monsters (bijv. PBS, GPB, of farmaceutische)
      1. Voeg 10 ml van de geschikte buffer om een ​​15 ml conische buis en zet apart. Dit monster wordt gebruikt als verdunningsmiddel voor de standaard curve en onbekende verdunningen (hoofdstuk 4).
      2. Voeg 1,2 ml buffer tot een microcentrifugebuis.
      3. LET OP: Deze stap maakt gebruik BoNT en uiterste voorzichtigheid moeten worden gebruikt bij de behandeling en verwijdering van eventuele reagentia en materialen die in contact komen met het toxine. Gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen en correcte verwijdering van alle materialen moeten volgens het Amerikaanse ministerie van Arbeid OSHA richtlijnen voor BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) worden uitgevoerd. Voeg BoNT / A 1,2 ml monster zodanig dat de uiteindelijke concentratie 30.000 sounddecoder 50 / ml (36.000 sounddecoder 50 totaal).
    2. Vloeibaar voedsel monsters (of andere complexe vloeibare monsters) Opmerking: De eerste testen wordt aanbevolen om het volume van de bovenstaande vloeistof gewonnen uit verduidelijkt monsters als de deeltjes (. Bv pulp) in vloeibare matrices bepalen zal variëren. Dit protocol veronderstelt ten minste 1,2 ml geklaarde supernatant zal worden verhaald op een 1,4 ml sample. Verhoog steekproefgrootte indien nodig.
      1. Voeg 10 ml vloeibaar voedsel aan een 15 ml conische buis en leg het opzij. Dit monster wordt gebruikt als verdunningsmiddel voor de standaardkromme en onbekende verdunningen (punt 4).
      2. Weeg een lege 1,5 ml microcentrifugebuis en noteer de massa.
      3. Voeg 1,4 ml van het vloeibare voedingsmiddel de gewogen microcentrifugebuis.
      4. Weeg de microcentrifugebuis en bereken de massa van het toegevoegde levensmiddelen monster door het aftrekken van de massa van de lege buis.
      5. LET OP: Deze stap maakt gebruik BoNT en uiterste voorzichtigheid moeten worden gebruikt bij de behandeling en verwijdering van eventuele reagentia en materialen die in contact komen met het toxine. Gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen en correcte verwijdering van alle materialen moeten volgens het Amerikaanse ministerie van Arbeid OSHA richtlijnen voor BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) worden uitgevoerd. Voeg BoNT / A op de 1,4 ml monster in een eindconcentratie van 30.000 sounddecoder 50 / g voedsel.
      6. IncubatietE het verdunningsmiddel en spiked monsters bij kamertemperatuur of 4 ° C gedurende 2 uur om het BoNT tijd om met de voedselmatrix geven nabootsen van een natuurlijke besmetting.
    3. Vast voedsel monsters (of andere vaste monsters) Opmerking: De eerste testen wordt aanbevolen om het volume van de bovenstaande vloeistof hersteld van gehomogeniseerd en verduidelijkt monsters na de toevoeging van 1 ml GPB / g voedsel bepalen. Dit protocol gaat ervan uit dat ten minste 1,2 ml geklaarde supernatant zal worden verhaald op een 2 g monster. Verhoog steekproefgrootte indien nodig.
      1. Weeg 10 g monster van vaste stof in een 50 ml conische buis en zet apart. Dit wordt gebruikt als verdunningsmiddel.
      2. Weeg 2 g vast voedsel monster in een tweede 50 ml conische buis.
      3. LET OP: Deze stap maakt gebruik BoNT en uiterste voorzichtigheid moeten worden gebruikt bij de behandeling en verwijdering van eventuele reagentia en materialen die in contact komen met het toxine. Gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen en het weggooien van het materiaals moet volgens het Amerikaanse ministerie van Arbeid OSHA richtlijnen voor BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) worden uitgevoerd. Voeg BoNT / A het oppervlak van de 2 g monster tot een eindconcentratie van 30.000 sounddecoder 50 / g voedsel (60.000 totaal sounddecoder 50).
      4. Incubeer het verdunningsmiddel en verrijkte monsters bij kamertemperatuur of 4 ° C gedurende 2 uur om het BoNT tijd om met de voedselmatrix geven nabootsen van een natuurlijke besmetting.
  2. Monster homogenisering en buffer aanpassing. Verwerk de spiked standaardcurve monster en verdunningsmiddel boven naar soort monster gegenereerd.
    1. Lage complexiteit monsters
      1. Geen verdere monster verwerking noodzakelijk is.
    2. Vloeibaar voedsel monsters (of andere complexe vloeibare monsters)
      1. Geen enkel monster homogenisering nodig.
      2. Voeg 140 ul 10x neutralisatiebuffer aan de 1,4 ml spiked monster en 1 ml 10x Neutroion buffer op de 10 ml diluentstaat. Meng monsters goed door.
      3. Gedeeltelijk verduidelijken beide monsters door centrifugeren gedurende 10 min bij 6000 xg en 4 ° C. Verwijder direct de bovenstaande vloeistoffen en over te dragen aan nieuwe buizen.
    3. Vast voedsel monsters (of andere vaste monsters)
      1. Voeg 2 ml GPB (1 ml GPB / g voedsel) aan de 2 g BoNT /-A spiked vast voedsel monster en 10 ml GPB aan de 10 g diluentstaat.
      2. Meng de monsters met behulp van een stamper tot het goed gemengd. Afhankelijk van de aard van het monster, kunnen er kleine stukjes materiaal die niet kunnen worden gehomogeniseerd, die aanvaardbaar is. Als alternatief kan mechanische homogenisatie methoden worden gebruikt. Het gebruik van een blender is niet aanbevolen, omdat het zo goed als kunnen inactiveren aerosolize het toxine.
      3. Voeg 1/10e volume 10x Neutralisering buffer om de diluentstaat basis van het geschatte totale volume (bv. 2 ml of het volume 20 ml). Extrapolerenhet totale volume van de BoNT /-A spiked monster en voeg 1/10e volume van 10x neutralisatie buffer. Meng monsters goed door.
      4. Gedeeltelijk verduidelijken beide monsters door centrifugeren gedurende 10 min bij 6000 xg en 4 ° C. Verwijder direct de bovenstaande vloeistoffen en over te dragen aan nieuwe buizen.
  3. Bereid standaardcurve seriële verdunningen te testen
    1. Met behulp van de BoNT /-A spiked standaardcurve monster als D1 en de nonspiked monster als verdunner, het genereren van de overige standaard curve monsters in 1,5 ml microcentrifugebuizen volgens Tabel 3.

3. Bereid onbekende monsters

Deze sectie kan parallel aan hoofdstuk 2 worden afgerond.

  1. Bepaal het aantal en verdunningen van onbekenden. Test onbekenden in drievoud indien mogelijk.
    1. Voor kwalitatieve bepalingen, lopen de onbekenden zonder verdere verdunning dan nodig is om het monster te verwerken als descrihieronder bed.
    2. Voor kwantitatieve testen bereiden minste twee 1:10 verdunning monsters, zoals hieronder beschreven, zodat een of meer monsters binnen het lineaire bereik van de assay respons vallen. Genereer verdunningen met behulp van een verdunningsmiddel van dezelfde matrix als het onbekende, indien mogelijk, om matrix effecten te verminderen, zoals beschreven in hoofdstuk 3. Gebruik anders PBS of GPB als verdunner.
  2. Het genereren en verdunnen van onbekende monsters volgens het type monster.
    1. Lage complexiteit onbekenden (bijv. PBS, GPB, of farmaceutische)
      1. Voeg minstens 750 ul onbekend bij een microcentrifugebuis met onbekende verdunning 1 genereren.
      2. Voeg 675 ul verdunner twee microcentrifugebuizen gelabeld Onbekend verdunning 2 en 3. Het verdunningsmiddel wordt hetzelfde materiaal voor standaardcurve generatie.
      3. Serieel verdunnen verdunning 1 door de overdracht 75 ul van verdunning 1 in de verdunning 2 buis en mengen.
      4. Serieel verwaterdee verdunning 2 door de overdracht 75 ul van verdunning 2 in de verdunning 3 buis en mengen.
    2. Vloeibaar voedsel onbekenden (of andere complexe vloeibare monsters) Opmerking: De eerste testen wordt aanbevolen het volume van de bovenstaande vloeistof gewonnen uit verduidelijkt monsters zoals besproken in hoofdstuk 3 te bepalen. Verhoog steekproefgrootte indien nodig.
      1. Voeg ≥ 875 ul van de vloeistof onbekende een microcentrifugebuis.
      2. Voeg 1/10e volume 10x Neutralisering buffer aan het monster (bijv. 87,5 ul van een 875 pi monster).
      3. Het monster gedeeltelijk verduidelijken door centrifugeren gedurende 10 min bij 6000 xg en 4 ° C. Onmiddellijk Breng de bovenste naar een nieuwe buis. Dit is Onbekend verdunning 1.
      4. Voeg 675 ul verdunningsmiddel twee buizen gemerkte gekend verdunning 2 en 3. Het verdunningsmiddel zal hetzelfde verwerkt materiaal voor standaardcurve generatie.
      5. Serieel verdunnen verdunning 1 door overschrijvingring 75 ul van verdunning 1 in de verdunning 2 buis en mixen.
      6. Serieel verdunnen verdunning 2 door de overdracht 75 ul van verdunning 2 in de verdunning 3 buis en mengen.
    3. Vast voedsel onbekenden (of andere vaste monsters) Opmerking: De eerste testen wordt aanbevolen om het volume van de bovenstaande vloeistof gewonnen uit verduidelijkt monsters zoals besproken in hoofdstuk 3 te bepalen. Verhoog steekproefgrootte indien nodig.
      1. Weeg 2 g vast onbekend monster in een 50 ml conische buis.
      2. Voeg 2 ml GPB (1 ml GPB / g voedsel) aan de 2 g monster van vaste stof.
      3. Meng de monsters zoals beschreven in paragraaf 3.2.3.2.
      4. Voeg 1/10e volume van 10x neutralisatie buffer om de steekproef op basis van de geschatte totale volume (bv. 0,4 ml als het volume 4 ml). Meng monsters goed door.
      5. Het monster gedeeltelijk verduidelijken door centrifugeren gedurende 10 min bij 6000 xg en 4 ° C. Immediately overdracht ≥ 750 ul supernatant naar een microcentrifugebuis. Dit is Onbekend verdunning 1.
      6. Voeg 675 ml verdunning twee buizen gemerkte gekend verdunning 2 en 3. Het verdunningsmiddel zal hetzelfde verwerkt materiaal voor standaardcurve generatie.
      7. Serieel verdunnen verdunning 1 door de overdracht 75 ul van verdunning 1 in de verdunning 2 buis en mengen.
      8. Serieel verdunnen verdunning 2 door de overdracht 75 ul van verdunning 2 in de verdunning 3 buis en mengen.

4. Final Sample Verduidelijking

Als testvloeistof of vaste voedselsteekproeven, centrifuge alle monsters gedurende 5 min bij 14.000 xg ≥ in een microcentrifuge om volledige opheldering de monsters. Verwijder direct de bovenstaande vloeistoffen en over te dragen aan nieuwe buizen.

5. Plaat Setup en BoNT / A Pull Down

  1. De specifieke plaat indeling is afhankelijk van de toepassing, maar niet de buitenwereld putten gebruiken om zonaar de rand te voorkomen. Elk onbekend monster en de standaard curve monster D1-D8 vereist 3 putten terwijl monster D9 vereist 6 putten. Een voorgestelde plaatindeling wordt getoond in Figuur 1.
  2. Voeg 20 ul 10x bindingsbuffer aan elk putje worden gebruikt.
  3. Voeg 200 pi van elke verdunning verduidelijkt en onbekende aan elk van drie putjes (zes putjes D9) voor drievoud getest. Meng de plaat gedurende 10 sec op een microplaat mixer.
  4. Voeg het IP-A kralen.
    1. Vortex het IP-A kralen voor 10 seconden op de hoogste snelheid. Verder wervelen als korrels niet volledig geresuspendeerd en homogeen.
    2. Pipetteer 20 ul IP-A-parels aan elk monster ook.
    3. Meng de plaat gedurende 30 seconden op een microplaat mixer.
  5. Incubeer de plaat met behulp van een roterende plaat incubator gedurende 2 uur bij 750 rpm, 25 ° C of kamertemperatuur. Assay prestaties sterk afhankelijk van het genereren en onderhouden van de IP-A kralensuspensie tijdens alle incubatiestappen. Altijd resuspendeer kralen met een microplaat mixer na pelletiseren en onderhouden van de suspensie op met een orbitale microtiterplaat shaker tijdens alle incubatie stappen.

6. Plaat Wassen en Kraal Resuspension

  1. Was de platen met de hand of met behulp van een magnetische kraal-compatibele geautomatiseerde plaatwasser. Een geautomatiseerde plaatwasser geconfigureerd voor magnetische korrels verhoogt assay doorvoer.
    1. Handmatig wassen
      1. Label een 50 ml conische buis "1x Wash buffer" en voeg 45 ml moleculaire biologie kwaliteit water en 5 ml 10x Matrix Wash Buffer. Meng buffer goed door.
      2. Verwijder de plaat uit de roterende plaat incubator.
      3. Doe de plaat onmiddellijk op een 96-well magnetisch bolletje scheiding plaat gedurende 5 minuten.
      4. Terwijl de plaat op de 96-well magnetische kraal scheiding plaat, verwijder voorzichtig en gooi de bovenstaande vloeistoffen uit de steekproef putten met behulp van een single-of multi-channel pipet. Niet aspirerenkralen-visueel toezicht op de aangezogen buffer in de pipet tip voor toevallige kraal verwijderen. Als het verwijderen is getuige, voorzichtig voeg de inhoud tip terug naar de bron, reseparate, en herhaal de verwijdering.
      5. Voeg 300 ul 1x Wash buffer aan elk monster ook.
      6. Volledig resuspendeer de korrels door mengen van de plaat gedurende 30 seconden op een microplaat mixer.
      7. Incubeer de plaat op de 96-well magnetische bead scheidingsplaat gedurende 2 minuten.
      8. Verwijder en gooi de bovenstaande vloeistoffen uit de steekproef putjes goed als voorheen.
      9. Herhaal stap 6.1.1.5-6.1.1.8 drie keer voor een totaal van 4 wasbeurten.
      10. Met de plaat op de 96-well magnetische kraal scheiding plaat visueel op de putten zelfs supernatant verwijderen te bevestigen, gebruik een pipet om overtollig resterende buffer indien nodig te verwijderen. Sommige buffer zal in de putten te blijven en de zorg moeten worden genomen om kraal verwijdering of kraal voorkomen dat ze uitdrogen.
      11. Voeg 50 ul 1x Reaction buffer aan elk monster goed en meng de plaat gedurende 30 sec op een microplaat mixer volledig resuspendeer de kralen. Indien nodig, gebruik dan een pipet om volledig resuspendeer de kralen.
    2. Geautomatiseerde Plate Wassen
      1. Setup en het programma van de wasmachine volgens tabel 4. Reinig en spoel de wasmachine met een hoge kwaliteit (bijv. nanozuiver) water.
      2. Prime de ring door het uitvoeren van het programma "Prime".
      3. Verwijder de plaat uit de roterende plaat incubator.
      4. Doe de plaat onmiddellijk op de 96-well magnetische kraal scheiding plaat op de plaat wasmachine.
      5. Ren de link programma "Master Wash". Het eerste programma stap is een 5 minuten incubatie stap waar de wasmachine stilstaat.
      6. Volgende programma voltooiing, verwijder de plaat uit de wasmachine, voeg 50 ul 1x Reaction buffer aan elk monster goed, en meng de plaat gedurende 30 seconden op een microplaat mixer volledig resuspendeer de kralen. Indien nodig, gebruik dan een pipet om volledig resuspendeer de kralen.

    7. Assay Initiatie en incubatie

    1. Voeg 50 ul 0,5 uM A / E reporter (zie hoofdstuk 1) aan elk monster goed en meng gedurende 30 seconden op een microplaat mixer volledig resuspendeer de kralen.
    2. Voeg 100 ul water aan elke ongebruikte goed op de plaat naar de rand effecten te voorkomen.
    3. Dicht de plaat met plaat afdichtband en incubeer de plaat met behulp van een roterende plaat incubator bij 750 rpm, 25 ° C of RT. Bescherm de plaat van licht tijdens de incubatie.

    8. Dataverzameling en-analyse

    Opmerking: Deze test is een real-time test die meerdere malen kan worden gemeten tot de gewenste gevoeligheid wordt verkregen, er geen stop reagentia vereist. Aanbevolen initiële leestijden zijn 2, 4 en 24 uur incubatie met assay gevoeligheid toeneemt met incubatietijd.

    1. Het verzamelen van gegevens
      1. Bij elke lezen, haal de plaat uit de roterende plaat incubator, verwijder het zegeling tape, en onmiddellijk het bord op de 96-well magnetische kraal scheiding plaat. Laat de korrels te scheiden voor 2 minuten.
      2. Plaats de plaat in de microplaatlezer en meet de emissies op ~ 470 en ~ 526 nm onder excitatie bij ~ 434 nm.
      3. Als er extra read tijden gewenst zijn, resuspendeer de kralen voor 30 seconden op de microplaat mixer, sluit de plaat, en de terugkeer van de plaat naar de roterende plaat incubator.
    2. Data-analyse
      1. Bereken de emissie-ratio voor elk monster door de relatieve fluorescentie-eenheid (RFU) waarde te delen bij 526 nm door de RFU waarde bij 470 nm.
      2. Teken de emissie verhouding ten opzichte van de log [BoNT / A] voor de standaard curve datapunten. Afhankelijk van de BoNT / A potentie geteste, een sigmoïdale dosis-respons curve verkregen (zie Representatieve resultaten).
      3. Monteer de standaard curve gegevens met de variabele helling dosis-response curve Y = Bodem + (Boven-Onder) / (1 ​​10 ^ ((logEC 50-X) * hillslope)) waarbij X delogaritme van de concentratie, Y is het antwoord, en Y begint bij Bodem en gaat naar boven met een sigmoïdale vorm.
      4. Bepaal de detectielimieten (LOD), grenzen (LOQ), en half-maximale effectieve concentratie (EC50). Detectielimieten worden gedefinieerd als een monster met een emissiegraad minder dan 3 standaarddeviaties (SD's) in de blanco controlegroep (n = 6). Bepaalbaarheidsgrenzen gedefinieerd als een monster met een emissiegraad minder dan 10 SDs onder de blanco controles (n = 6). EC50 wordt bepaald uit de sigmoïdale dosis-respons curve fit.
      5. Interpoleer de potentie van een onbekende monsters tegen de sigmoïdale dosis-respons standaardcurve.
        1. Voor kwantitatieve resultaten, moet het onbekende monster idealiter binnen het lineaire gebied van de standaardcurve vallen. Benaderen het lineaire gedeelte van de standaard curve door het berekenen van de totale venster 20-80% assay respons (bv. indien de emissie verhouding van de standaard curve ranges 0,5-2,5, zou het lineaire bereik het deel van de standaardcurve die varieert 0,9-2,1 zijn).
        2. Voor kwalitatieve resultaten, vergelijken het onbekende monster tegen de LOD en LOQ van de standaard curve.
        3. Niet extrapoleren onbekende monsters buiten de grenzen van de standaard curve.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Een diagram waarin de stappen beschreven protocol wordt getoond in figuur 2. De test vereist tussen 4-26 uur in beslag, afhankelijk van het type monster en de gewenste assaygevoeligheid, maar slechts ~ 2 uur van hands-on tijd. De test wordt uitgevoerd in 96-well platen en afhankelijk van het soort test wordt uitgevoerd, kan triplo getest tot 20 monsters waaronder normen per plaat.

Figuur 3 toont representatieve analyseresultaten met BoNT / A holotoxine spiked in PBS en getest met de volgende beschreven protocol 2, 4 en 24 uur incubatie met de A / E reporter. Gezuiverd BoNT / A holotoxine werd voor dit experiment gekozen omdat zijn gedefinieerd molecuulgewicht van ~ 150 kDa in vergelijking met de ruimer gedefinieerd 700-900 kDa voor het toxine complex en zuiverheid mogelijk zeer nauwkeurig spiking op precieze concentraties. De emissie, de verhouding van de emissie bij 526 nm tot die bij 470 nm na excitatie bij 434nm, op elk tijdstip is uitgezet tegen BoNT / A concentratie (MLD 50 waarde is gebaseerd op de werkzaamheid van de BoNT / A fabrikant). Splitsing van de reporter door BoNT wordt gemeten als een daling van de emissiegraad, die ons plaatlezer varieert tussen ongeveer 2,7 voor de intacte reporter tot ongeveer 0,7 voor de volledig gesplitste reporter. Het is belangrijk op te merken dat, aangezien elk plaatlezer maatregelen fluorescentie in RFUs, de werkelijke waarde van de emissiegraad afhankelijk plaatlezer gebruikt wordt. Verlengde incubatietijd met de reporter resulteert in verhoogde splitsing reporter zoals gezien door de verschuiving naar links in de bocht. De datapunten, in drievoud getest, geven lage SD van het gemiddelde en volg de verwachte trend van verhoogde emissie verhouding met een verminderde toxine belasting. Falen van de test om deze verwachte trend te volgen kan er een fout aangeven tijdens verdunning generatie of gegevens plotten. De emissie verhoudingen van de controles die geen BoNT / Een gestage Durin blijven ookg de incubatie (Figuur 3, inzet), met vermelding van het ontbreken van niet-specifieke protease activiteit.

Een voorbeeld van het gebruik van dit protocol op farmaceutische BoNT / A monsters te kwantificeren wordt getoond in figuur 4. Een standaard kromme werd gemaakt in PBS met gezuiverd BoNT / A holotoxine en parallel verwerkt met verdunningen van geneesmiddel gegenereerd uit een 100 E flesje gevriesdroogd BOTOX opnieuw gehydrateerd in 0,9% zoutoplossing. (Idealiter zou de standaardcurve bestaan ​​referentie veel BOTOX maar dit materiaal was niet beschikbaar.) De monsters werden getest met beschreven protocol, behalve dat 50 ui monsters werden in tweevoud getest zonder gebruik van 10x bindingsbuffer. De standaardcurve werd uitgezet als een functie van BoNT / A concentratie na 24 uur incubatie met de A / E reporter. De emissiegraad van elk onbekend monster werd vervolgens gevisualiseerd door het uitzetten van het snijpunt in de standaardcurve. In deze bepaling de regelar gedeelte van de standaardkromme (de 20-80% respons venster assay) valt tussen een emissiegraad van 2,11-1,05 en wordt aangegeven door de gestippelde vak in de figuur. De concentraties van de drie onbekenden die binnen deze lineaire bereik vallen werden vervolgens geïnterpoleerd uit de standaard curve (figuur 4, bijvoegsel). Dit voorbeeld toont de algemene methode die zou worden gebruikt voor onbekende monster detecteren of kwantificeren tegen een standaardcurve.

Verse tomaten en 2% melk werden gekozen om de prestaties en gevoeligheid met behulp van zowel een vaste stof (tomaat) en vloeibare levensmiddelen (2% melk) matrix van het protocol aan te tonen. BoNT / A complex bestaat uit de kern holotoxine en neurotoxine geassocieerde proteïnen (NAP) werd geselecteerd voor deze experimenten omdat preparaat lijkt het toxine die in een natuurlijke Clostridium verontreiniging. Zoals getoond in figuur 5A, terugwinning van BoNT / A, gemeten als splitsing van de A / E reporter wordt waargenomen met bOTH matrices. Verhoogde incubatietijd met de reporter assay gevoeligheid verhoogt, maar niet leiden tot verminderde emissie's voor de besturing geen toxine (Figuur 5A, bijvoegsels) waarin de splitsing waargenomen resultaten van BoNT / A en niet-specifieke protease overdracht van het voedsel in de assay. Zoals figuur 3, de data displays lage variabiliteit en volgt de verwachte trend van verminderde verslaggever splitsing met verminderde toxineconcentratie.

De BoNT / A LOD, LOQ, en EC 50 voor zowel voedingsmiddelen op elk tijdstip getoond worden samengevat in Tabel 5. De LOD en LOQ worden gedefinieerd als de laagste concentratie monster met een emissiegraad minder dan drie en tien SDs onder het achtergrondniveau (monsters die geen BoNT / A), respectievelijk. Deze limieten zijn beperkt tot de gegevenspunten getest, hoewel interpolatie aan de sigmoïdale dosis-respons curve kan worden gebruikt lagere theoretische limieten berekenen. Sommige matrix naarmatrix variabiliteit in LOD en LOQ verwacht, als matrixeffecten de binding van het toxine aan de parels en het herstel van de korrels tijdens het wassen beïnvloeden. Hoewel het lijkt dat er meer toxine herstel van 2% melk dan tomaten uit de gegevens in figuur 5A, veel van dit verschil het gevolg van de extra verdunnen voor tomaat monsters homogeniseren in GPB.

Naast het feit dat een vast voedsel matrix, tomaten een opmerkelijk voorbeeld type wanneer de pH en ionische sterkte aanpassing bereikt door toevoeging van 10x neutralisatie buffer, is cruciaal voor het succes test. Figuur 5B illustreert assay reacties bij het ​​testen tomaten met of zonder toevoeging van 10x Neutralisatie buffer. Als de 10x neutralisatiebuffer resultaten toe te voegen in een slechte herstel van BoNT / A uit monsters en wordt aangetoond door een constante emissie-verhouding in alle geteste BoNT / A concentraties. Toevoeging van de 10x neutralisatie buffer, hoewel, resultaten in gevoelige detectie van het toxine.

Niet-specifieke proteasen in complexe matrices kan leiden tot valse positieven zo niet aangepakt omdat andere dan BoNT proteasen de A / E reporter kan klieven. Niet-specifieke proteasen kunnen endogeen aan het voedsel monster of geïntroduceerd bij gebruik nonpurified BoNT bereidingen zoals Clostridium kweeksupernatanten zijn. Grondig wassen bead de meeste niet-specifieke proteasen verwijderen, maar de toevoeging van proteaseremmers aan de reactiebuffer kritisch Figuur 6 toont niet-specifieke proteaseactiviteit in Clostridium BoNT / A kweeksupernatanten met een aangepaste A / E reporter BoTest KO (KO reporter. ). De KO reporter is dezelfde als de A / E reporter behalve dat BoNT / A splitsingsplaats is gemuteerd zodat het niet langer gesplitst door BoNT / A. Daarom is elke waargenomen verslaggever splitsing voortvloeit uit niet-specifieke protease activiteit. De hoge niveaus van KO reporter cleAvage geeft het kweeksupernatant bevat een hoge protease-activiteit, maar deze activiteit daadwerkelijk teniet gedaan door de toevoeging van proteaseremmers.

Het monster gegevens tonen het nut van het protocol voor high throughput BoNT / A detectie in eenvoudige buffers en voedingsmatrices. Bepaalde voedingsmiddelen kunnen kleine test aanpassingen nodig, maar de beschreven protocol moet goede resultaten op met de meerderheid van soorten voedsel.

Figuur 1
Figuur 1. Voorgestelde plaatindeling. Monsters worden beperkt tot de binnenste 60 putjes van de plaat om mogelijke rand effecten te vermijden. Onbekende of standaardcurve monsters kunnen naar wens worden toegevoegd. Alle niet-gebruikte putten moeten worden gevuld met 100 ul water tijdens verslaggever incubatie. Click hier voor grotere afbeelding.

Figuur 2
Figuur 2. Schematische weergave van het beschreven protocol. Elke belangrijke stap in het protocol is aangegeven met gelabelde vakken en uitgelijnd naast schatting assay tijdlijn (niet op schaal). Nonfood monsters niet monster verwerking vereisen en dus vul het protocol stroomafwaarts van voedsel monsters. De gestippelde kader rond seriële verdunning generatie voor de onbekenden geeft dit is een optioneel, maar aanbevolen, stap. Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 3
Figuur 3. Detectie van BoNT / A holotoxine in PBS met het beschreven protocol.Gezuiverd BoNT / A holotoxine werd ingespoten in PBS en getest met gebruikmaking van de beschreven protocol met een bovenste BoNT / A concentratie van 1 nM. Alle monsters werden in drievoud getest en de foutbalken geven de standaarddeviatie van het gemiddelde. Gerapporteerde potentie is gebaseerd op bioassay testen van het toxine de fabrikant. De emissie (de verhouding van de emissie bij 526 nm tot 470 nm na excitatie bij 434 nm) van de standaardcurve werd gemeten na 2, 4 en 24 uur incubatie met A / E reporter en uitgezet als een functie van BoNT / Concentraties . Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 4
Figuur 4. Kwantificering van BOTOX geneesmiddel met behulp van de beschreven protocol. Een enkele 100 E flacon gevriesdroogd BOTOX geneesmiddel was resuspe nded in 220 pi 0,9% zoutoplossing, serieel verdund en getest als onbekenden tegen een standaard curve gemaakt in PBS met gezuiverd BoNT / A holotoxine. De monsters werden getest volgens het beschreven protocol, behalve dat 50 ui monsters werden getest zonder 10x Binding buffer in tweevoud. De standaardkromme werd berekend door de montage van de emissiegraad van de standaardcurve monsters naar de variabele helling sigmoïdale dosis-respons vergelijking en uitgezet als een functie van BoNT / A concentratie. Elke onbekende monster wordt bij de kruising met de standaardcurve na een 24 uur incubatie met de A / E reporter. De concentraties van de onbekende monsters die binnen het lineaire bereik (onderbroken gearceerd vak) werd geïnterpoleerd uit de standaard curve. Het label voor elke BOTOX onbekend is het aantal eenheden in het monster op basis van geëtiketteerde sterkte. Foutenbalken stellen de standaardafwijking van het gemiddelde.t = "_blank"> Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 5
Figuur 5. Herstel van BoNT /-A spiked 2% melk en verse tomaten tests volgens de beschreven protocol. Monsters van 2% melk en verse tomaten werden verrijkt met gezuiverd BoNT / Een complex en getest met behulp van de beschreven protocol. Alle monsters werden in drievoud getest en de foutbalken geven de standaarddeviatie van het gemiddelde. (A) De emissiegraad van 2% melk en verse tomaten standaard curves werden gemeten na 2, 4 en 24 uur incubatie met A / E reporter en uitgezet als een functie van BoNT / A potentie. (B) Als de 10x neutralisatie buffer omvatten in tomaat testresultaten in bepalingsbuffer mislukking. Monsters van verse tomaten werden getest volgens het protocol beschreven met of zonder toevoeging van 10x Neutraalsatie buffer. De getoonde gegevens zijn voor de 4 uur tijdstip. Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 6
Figuur 6. Proteaseremmers zijn voor metingen complexe matrices. Clostridium BoNT / A (stam Hall A) kweeksupernatant werd serieel verdund in PBS en getest met gebruikmaking van de beschreven protocol met of zonder proteaseremmers toegevoegd aan de reactiebuffer en zowel de A / E en KO verslaggevers. De emissiegraad werd gemeten na 24 uur incubatie met zowel de A / E of KO reporters en uitgezet als een functie van BoNT / A potentie. Significante splitsing van de KO verslaggever werd gezien zonder toevoeging van proteaseremmers, maar werd tenietgedaan door hun opname. Alle monsters werden in drievoud getest en de fout bars stellen de standaardafwijking van het gemiddelde. Klik hier voor grotere afbeelding.

Buffer Samenstelling Temperatuur bij opslag Stabiliteit Notes
10x Matrix Binding Buffer 500 mM HEPES-NaOH, pH 7,1, 250 mM NaCl, 1% Tween-20, 5% Caseïne, 0,05% NaN3 -20 Of -80 ° C Stabiel gedurende ten minste vijf dagen bij 4 ° C bij het ontdooien Geleverd met BoTest Matrix A botulinum Detection Kit
10x Matrix Wash Buffer 119 mM Fosfaten, pH 7,4, 1,370 mM NaCl, 27 mM KCl, 1% Tween-20 -20 Of -80 ° C Stabiel gedurende ten minste vijf dagen bij 4 ° C bij het ontdooien Geleverd met BoTest Matrix A botulinum Detection Kit
10x Neutralization Buffer 1 M HEPES-NaOH, pH 8,0, 1 M NaCl 4 ° C Stabiel tot zes maanden bij 4 ° C
10x BoTest Reaction Buffer 500 mM HEPES-NaOH, pH 7,1, 50 mM NaCl, 1% Tween-20, 100 uM ZnCl2 -20 Of -80 ° C Stabiel gedurende ten minste vijf dagen bij 4 ° C bij het ontdooien Geleverd met BoTest Matrix A botulinum Detection Kit
BoTest A / E Reporter 20 uM in 50 mM HEPES-NaOH, 10 mM NaCl, 15% Glycerol -80 ° C Bewaren in kleine porties. Stabiel gedurende ten minste vijf dagen bij 4 ° C bij het ontdooien. Geleverd met BoTest Matrix A botulinum Detection Kit
Gelatine fosfaatbuffer (GPB) 33,3 mM NaH 2PO 4, pH 6,2, 2 g / L gelatine 4 ° C Stabiel tot 1 maand bij 4 ° C
200x dithiothreitol (DTT) 1 M DTT -20 ° C Stabiel tot 6 maanden bij -20 ° C Maken en op te slaan kleine (100 pl) monsters
1x PBS-t 11,9 mM Fosfaten, pH 7,4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 0,1% Tween-20 4 ° C Stabiel tot 1 maand bij 4 ° C Kan worden gemaakt met behulp van 10x PBS van Fisher (BP399-1)
Matrix A Kralen (IP-Parels) Magnetische kralen die covalent geconjugeerd met kip anti-BoNT / A antilichaam in PBS. 0,1% Tween-20, 0,05% natriumazide, 0,25% caseïne en 50% Glycerol -20 ° C Stabiel gedurende ten minste vijf dagen bij 4 ° C na verwijdering van -20 ° C. NIET invriezen bij -80 ° C

Tabel 1. Buffers die voor de beschreven protocol. Het 10x NeutralisatieBuffer alleen voor zeer complexe (bijvoorbeeld voeding) monsters en niet vereist afhankelijk van de aard van de monsters wordt getest.

Naam van Material / Equipment Vennootschap Catalogusnummer Opmerkingen / Omschrijving
BoTest Matrix Een botulinumneurotoxine Detection Kit BioSentinel A1015 Detectie kits voor BoNT / B en F zijn ook beschikbaar.
Varioskan Flash fluorescentie microplaatlezer Thermo Fisher Scientific- 5250040 De meeste monochromator of filter units met 434 nm excitatie en 470 nm en 526 nm emissie capaciteit kan worden gebruikt.
96-well Magnetic Bead scheiding Plate V & P Scientific VP771H Andere magnetische platen kunnen worden gebruikt, maar de plaat moet worden ontworpen om de b scheidenEADS aan de zijkant van de put.
Magnetische Bead-Compatibel plaatwasser BioTek ELx405 VSRM Optioneel, alleen nodig voor geautomatiseerde plaat wassen. Andere magnetische bead-compatibele plaat ringen kunnen ook worden gebruikt, maar moet voor gebruik worden getest.
Microcentrifuge Divers N / A Optioneel, alleen vereist voor monsters nodig centrifugeren.
MixMate plaat mixer Eppendorf 22674200
Orbital Shaker Divers N / A Gebruikt bij kamertemperatuur of bij 25 ° C als temperatuur beschikbaar
-EDTA gratis Proteaseremmer Tabletten Roche 4693132001 Alleen vereist voor voedsel of milieu testen. Proteaseremmers moet-EDTA-vrij zijn.
BoNT / A Metabiologics N / A Optioneel, alleen nodig voor standaardisatie en kwantificatie doeleinden
Zwart, platte bodem 96-well platen NUNC 237105 De platen mogen niet worden behandeld
96-well plaat Sealing Tape Thermo Scientific 15036

Tabel 2. Materialen en uitrusting die voor het beschreven protocol. Sommige materialen en zijn optioneel en kan worden vervangen, afhankelijk van de beschikbare apparatuur. Extra geschiktheid testen en te optimaliseren kan bij gebruik van alternatieve apparatuur nodig zijn.

</ Tr>
Sample Naam Volume Toxine Volume Verdunningsmiddel [BoNT / A] (sounddecoder 50 / ml) of (sounddecoder 50 / g voedsel) log [BoNT / A] (sounddecoder 50 / ml) of (sounddecoder 50 / g voedsel) D1 1200 pi Stock N / A 30.000 4.48
D2 300 pl D1 600 ul 10.000 4
D3 90 pl D1 810 pl 3000 3,48
D4 90 pi D2 810 pl 1000 3
D5 90 pl D3 810 pl 300 2.48
D6 90 pl D4 810 pl 100 2
D7 90 pl D5 810 pl 30 1.48
D8 90 pl D6 810 pl 10 1
D9 N / A 1400 pi N / A N / A

Tabel 3:. Verwatering tafel voor standaard curve monsters Deze tabel genereert een standaard curve in half-log verdunningen dan 3,5 ordes van grootte. Genoeg Geen BoNT blanco monster (D9) wordt gegenereerd om een ​​n = 6 draaien. Extra verdunningen kunnen worden toegevoegd indien gewenst.

<td> 0
Programma Naam Veranderlijk Waarde Reacties
Eerste Reagensfles Een
Prime Volume 400
Prime Flow Rate 7
Geniet na Prime? N
Matrix Wash Reagensfles Een Het aantal wassingen kan toenemen indien resterende proteaseactiviteit waargenomen.
Methode
4
Soak / Shake Y
Soak Duur 180
Schudden voor Soak? N
Prime Na Soak? N
Disp
Afzien Volume 300
Afzien Flow Rate 5
Afzien Hoogte 130
Hor. Afzien Pos. 0
Uitschakelen Aspireren? Y
Bottom Wash First? N
Prime voor de start? N
Aspir
Aspiratie Hoogte 40
Hor. Aspireren Pos. 0
Aspiratie Rate 5
Aspiratie Delay
Kruiselings Aspireren? N
Final Aspiration? Y
Final Aspiration Delay 0
Matrix Soak Soak Duur 300 Verhoogde inweektijd kan kraal herstel toenemen van meer viskeuze voedingsmiddelen.
Schudden voor Soak? N
Master Wash Matrix Soak Dit is een programma 'Link' te lopen de Matrix Soak en Matrix Wash programma samen.
Matrix Wash

Tabel 4. Magnetische bead-compatibele geautomatiseerde plaatwasser programma-instellingen. Volgende programma aangenomen dat de plaat sluitring is voorzien van een magneet die kralen trekt aan de zijkant van de putten en de buffer schakelmodule is ingesteld dat 1x Wash Buffer ( PBS-t) aan de klep bevestigd A. Deze programma's zijn specifiek voor de BioTek ELx405. Raadpleeg de handleiding bij het toestel handleiding voor de programmering. Andere magnetische kraal-compatibele automatische plaat wasmachines of vacuümspruitstukken kan worden gebruikt, maar zal testen nodig zijn om instellingen die wassen efficiëntie te maximaliseren definiëren en te minimaliseren kraal verlies tijdens het wassen. De eerste testen van de kraal herstel na het wassen wordt aanbevolen, ongeacht de specifieke plaatwasser gebruikt.

<td> LOD
Eten Matrix Metriek 2 hr 4 uur 24 uur
sounddecoder 50 / g voedsel sounddecoder 50 / goed sounddecoder 50 / g voedsel sounddecoder 50 / goed sounddecoder 50 / g voedsel sounddecoder 50 / goed
Melk 300 58 100 19 30 6
LOQ 1000 193 300 58 100 19
EC50 2404 464 590 114 92 18
Verse Tomaten LOD 1000 91 300 27 30 3
LOQ 1000 91 1000 91 100 9
EC50 7561 687 1932 176 229 21

Tabel 5. Detectielimiet (LOD), grenzen (LOQ), en half-maximal effectieve concentratie (EC50) voor de 2% melk en verse tomaat testen weergegeven in figuur 2A. De EC 50 is afgeleid van de sigmoïdale dosis-response curve fit terwijl de LOD en LOQ worden gedefinieerd als de laagste concentratie gegevens punt dat valt 3 of 10 standaardafwijkingen onder het geen BoNT controles (n = 6), respectievelijk. De gegevens worden gepresenteerd in zowel sounddecoder 50 / g voedsel en totaal sounddecoder 50 s getest per putje in de 200 ul monstervolume.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dit protocol beschrijft de procedures voor het kwantificeren BoNT / A-complex, holotoxine of Clostridium kweeksupernatant in complexe matrices. Het protocol is hetzelfde, echter, bij het ​​testen van andere BoNT serotypen (bijv. BoNT / B, E en F) met hun respectievelijke Matrix assays 56,60, hoewel assaygevoeligheid zullen verschillen en serotypes en assays. Dit protocol houdt geen rekening met elk type monster mogelijk enkele wijzigingen nodig zijn, afhankelijk van de specifieke vloeistofmonster en gewenste toepassing. Matrices kunnen inclusief eten monsters (bijvoorbeeld voeding uitdaging testen) of farmaceutische hulpstof buffers (bv. BoNT-based drug testen van het product). Complex ongeschikt voor voeding (bv. dierlijk weefsel of milieu-) vloeibare en vaste monsters moeten worden behandeld als voedsel monsters. Dit protocol maakt gebruik van 200 ul / putje monstervolumes maar slechts 50 ul / putje worden getest met een overeenkomstige aanpassing van de hoeveelheid 10x Binding buffer. Monsters kleiner dan 50 ul worden verdund met GPB of PBS tot ≥ 50 pi voor het testen.

De sterk variabele aard van levensmiddelen vormt een bijzondere uitdaging voor BoNT detectie en kwantificering in voedsel. Voorbeeld pH, viscositeit, ionsterkte en de aanwezigheid van deeltjes kan alle potentieel invloed hebben op de activiteit van het toxine in de voedselmatrix en vereisen dat de toxine worden geïsoleerd uit het voedsel voor nauwkeurige in vitro bepaling. Veel voedingsmiddelen of toxine preparaten bevatten ook endogene proteasen die moeten worden verwijderd of geïnactiveerd bij gebruik van eiwit gebaseerde reporters zodat alleen BoNT-specifiek protease activiteit wordt gemeten. Zelfs eenvoudige, goed gedefinieerde buffer matrices, zoals farmaceutische excipiëns buffers kunnen verbindingen die interfereren met BoNT activiteit die voor kwantificering 35,56-59,61 worden verwijderd bevatten. Immuunprecipitatie biedt een snelle, zeer serotype-specifieke BoNT puricatie methode, maar vereist antilichamen met hoge affiniteit aan de lage concentraties toxine gevonden in "real-world" food, milieu-, en farmaceutische monsters te isoleren.

De beschreven protocol zuivert het toxine met paramagnetische kralen bekleed met anti-BoNT / A antilichamen gericht tegen de zware keten van toxine receptor domein van de BoNT / A kern holotoxine 56. Clostridium species, maar natuurlijk produceren toxine complexen bestaande uit de kern holotoxine samen met NAP 62-64. De NAP beschermen toxine van protease aanslag in het maag-darmkanaal en worden verondersteld het vervoer toxine in de darm epitheel 63,65 vergemakkelijken. De NAP remmen binding van het IP-A bead anti-BoNT / A antilichamen tegen de kern holotoxine (gegevens niet getoond). Deze remming is opgelucht door het verhogen van het monster pH boven de ~ 6,25, waardoor de BoNT / A complex om zich te distantiëren in holotoxine en NAP en waardoor effectieve toxinebinding aan het IP-A kralen 66. Daarom instellen van het monster pH tot boven 6,5 is cruciaal voor het succes van de assay (figuur 5B). De 10x bindingsbuffer in het protocol bevat een buffer om de pH te verhogen tot standaard testomstandigheden. Echter, veel zure voedingsmiddelen de buffercapaciteit van de Binding buffer overweldigen. De extra 10x neutralisatiebuffer verhoogt het monster buffercapaciteit en moet de meerderheid van voedingsmatrices neutraliseren.

Een andere belangrijke parameter voor de bepaling is monster ionensterkte. Verduidelijking van de monsters door middel van centrifugeren is nodig voor effectieve kraal wassen en herstel na immunoprecipitatie. Testen met verse tomaten gebleken dat geen enkele BoNT / Een herstel werd gezien wanneer de monsters gewoon werden verwerkt en gecentrifugeerd. Onze hypothese was dat BoNT / A kan associëren met het vruchtvlees waardoor het pellet tijdens het centrifugeren en word afwezig in degeteste supernatant. We vonden dat het verhogen van de ionische sterkte of, nog belangrijker, het neutraliseren van de pH beperkte interacties tussen BoNT en de matrix resulteert in verbeterde toxine herstel (Figuur 5B). Hoewel niet vereist voor BoNT herstel wordt verwacht, maar niet aangetoond dat hogere zoutconcentraties zal bevorderen de stringentie van de immunoprecipitatie en resulteren in minder niet-specifieke eiwitten herstel, vooral bij lage zout voedsel.

Voorbeeld pH en ionsterkte aanpassing van het protocol wordt uitgevoerd door toevoeging van 10x buffer Neutralisering en compatibel met een breed scala aan levensmiddelen worden. Terwijl de 10x neutralisatie buffer heeft een hoge buffercapaciteit, kunnen sommige zeer zure voedingsmiddelen extra pH-aanpassing. Het testen van het monster pH volgende buffer Daarnaast wordt aanbevolen als een slechte uitvoering van de assay wordt waargenomen en monstervolume maakt. Aanvullende pH kan worden bereikt door toevoeging van small volumes 1 M HEPES pH 8, indien nodig. De extra NaCl die door de 10x neutralisatie buffer moet aanvaardbaar zijn voor alle maar saltiest levensmiddelen, maar kan 10x neutralisatie buffer vervangen door 1 M HEPES pH 8 of slechte resultaten zijn gezien met een levensmiddel. Geen significante verschillen werden waargenomen bij het testen van de beschreven protocol bij NaCl concentraties tot 1,2 M in PBS.

Hoewel dit protocol voor de meeste monsters kan voedsel bij de uitersten van pH, ionische sterkte en / of protease-inhoud goede resultaten met de assay verkregen. Sommige voedingsmiddelen kunnen ook te dik blijven na de toevoeging van GPB, resulteert in een slechte kraal herstel. Voorverdunning van monsters met een eenvoudige buffer zoals PBS kan de resultaten te verbeteren. Het verhogen van het aantal wasbeurten of was striktheid (door verhoging van NaCl-concentratie) en het verhogen van de concentratie van EDTA gratis proteaseremmers kan ook resultaten verbeteren als niet-specifieke protease gecontamineerdion wordt waargenomen. Instrument netheid is ook erg belangrijk bij het gebruik van de automatische plaat wassen. Vervuiling van het sanitair en verstuivers met proteasen (bijv. trypsine) van andere laboratorium testen kunnen de onopzettelijke introductie van proteasen leiden tijdens de test. Grondige reiniging van de plaatwasser volgens de handleiding van de fabrikant wordt aanbevolen voor het uitvoeren van de test.

De BoTest Matrix assays zijn de eerste gecommercialiseerd, activity-based assays voor BoNT detectie en kwantificering in complexe matrices. Vergeleken met de standaard bioassay in muizen, de test is snel, goedkoper en maakt hoge-throughput testen zonder dat hiervoor gespecialiseerde faciliteiten of ethische bezwaren betreffende dier gebruik 56. Andere in vitro BoNT detectiemethoden beschreven maar niet aangetoond compatibel met complexe monstermatrices vereisen gespecialiseerde apparatuur of commercieel niet Beschikble 35,42-44,46-55. De testen zijn ook activiteiten gebaseerde testen die toxine endoprotease-activiteit te meten, terwijl traditionele enzymgebonden immunosorbant assay (ELISA) technieken alleen rapporteren toxine massa. Activity-based ELISA-testen werden eerder beschreven, maar deze testen werden niet aangetoond te werken met voedsel matrices en omvatten niet de zuivering van het toxine van het monster matrix 41. Onderschatting van de toxiciteit van complexe monsters kan optreden als het toxine niet wordt gezuiverd uit het monster omdat matrix samenstellingen vaak interfereren met de activiteit BoNT 35,56-59.

Nadat het protocol is beheerst, kunnen wijzigingen worden aangebracht in monster volumes verhogen en monster gevoeligheid. Bijvoorbeeld, binding van het toxine aan de parels kan worden uitgevoerd in grotere, bulk monsters (bijvoorbeeld 10 ml of meer) voor verzameling door centrifugatie. Deze korrels kunnen dan worden toegevoegd aan een plaat met 96 putjes en geanalyseerd volgens de beschrijvingd protocol. Verhogingen van de gevoeligheid groter dan een log zijn waargenomen met een verhoogde steekproefomvang 56. Aldus kan de beschreven protocol worden gebruikt met groter volume monsters hoeveelheden BoNT in monsters die onopgemerkt blijven door de bioassay detecteren zelfs sporen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

FM Dunning, TM Piazza, F. Zeytin, en WC Tucker zijn medewerkers of eigenaren van BioSentinel Inc BioSentinel momenteel produceert en commercialiseert een aantal van de reagentia die in dit rapport.

Acknowledgments

De auteurs willen graag H. Olivares en D. Ruge bedanken voor waardevolle discussies en adviezen. Dit onderzoek werd mede ondersteund door een NSF SBIR award (IIP-1127245 om BioSentinel Inc) en het Ministerie van Defensie contract (W81XWH-07-2-0045 te BioSentinel Inc).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit BioSentinel A1015 Detection kits for BoNT/B and F are also available.
Varioskan Flash fluorescence microplate reader Thermo Fisher Scientific 5250040 Most monochromator- or filter-based units with 434 nm excitation and 470 nm and 526 nm emission capability can be used.
96-well Magnetic Bead Separation Plate V&P Scientific VP771H Other magnetic plates may be used, but the plate should be designed to separate the beads to the side of the well.
Magnetic Bead-Compatible Plate Washer BioTek ELx405 VSRM Optional, only required for automated plate washing.  Other magnetic bead-compatible plate washers may also be used, but should be tested before use.
Microcentrifuge Optional, only required for samples needing centrifugation.
MixMate plate mixer Eppendorf 22674200
Orbital Shaker Used at room temperature or at 25 °C If temperature control is available
EDTA-free Protease Inhibitor Tablets Roche 4693132001 Only required for food or environmental testing. Protease inhibitors must be EDTA-free.
BoNT/A Metabiologics Optional, only required for standardization and quantification purposes
Black, Flat-bottomed 96-well Plates NUNC 237105 Plates should not be treated
96-well Plate Sealing Tape Thermo Fisher Scientific 15036

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arnon, S. S., et al. Botulinum toxin as a biological weapon: medical and public health management. J. Am. Med. Assoc. 285, 1059-1070 (2001).
  2. Gill, D. M. Bacterial toxins: a table of lethal amounts. Microbiol. Rev. 46, 86-94 (1982).
  3. Montal, M. Botulinum neurotoxin: a marvel of protein design. Annu. Rev. Biochem. 79, 591-617 (2010).
  4. Lacy, D. B., Stevens, R. C. Sequence homology and structural analysis of the clostridial neurotoxins. J. Mol. Biol. 291, 1091-1104 (1999).
  5. Montecucco, C., Schiavo, G. Structure and function of tetanus and botulinum neurotoxins. Q. Rev. Biophys. 28, 423-472 (1995).
  6. Ahnert-Hilger, G., Munster-Wandowski, A., Holtje, M. Synaptic vesicle proteins: targets and routes for botulinum neurotoxins. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 364, 159-177 (2013).
  7. Yamasaki, S., et al. Cleavage of members of the synaptobrevin/VAMP family by types D and F botulinal neurotoxins and tetanus toxin. J. Biol. Chem. 269, 12764-12772 (1994).
  8. Schiavo, G., et al. Identification of the nerve terminal targets of botulinum neurotoxin serotypes A, D, and E. J. Biol. Chem. 268, 23784-23787 (1993).
  9. Schiavo, G., et al. Tetanus and botulinum-B neurotoxins block neurotransmitter release by proteolytic cleavage of synaptobrevin. Nature. 359, 832-835 (1992).
  10. Schiavo, G., et al. Botulinum G neurotoxin cleaves VAMP/synaptobrevin at a single Ala-Ala peptide bond. J. Biol. Chem. 269, 20213-20216 (1994).
  11. Rossetto, O., et al. SNARE motif and neurotoxins. Nature. 372, 415-416 (1994).
  12. Montecucco, C., Schiavo, G. Mechanism of action of tetanus and botulinum neurotoxins. Mol. Microbiol. 13, 1-8 (1994).
  13. Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the synaptic protein SNAP-25. Nature. 365, 160-163 (1993).
  14. Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin C1 blocks neurotransmitter release by means of cleaving HPC-1/syntaxin. EMBO J. 12, 4821-4828 (1993).
  15. Cherington, M. Clinical spectrum of botulism. Muscle Nerve. 21, 701-710 (1998).
  16. Lindstrom, M., Korkeala, H. Laboratory diagnostics of botulism. Clin. Microbiol. Rev. 19, 298-314 (2006).
  17. Werner, S. B., Passaro, D., McGee, J., Schechter, R., Vugia, D. J. Wound botulism in California, 1951-1998: recent epidemic in heroin injectors. Clin. Infect. Dis. 31, 1018-1024 (2000).
  18. Passaro, D. J., Werner, S. B., McGee, J., MacKenzie, W. R., Vugia, D. J. Wound botulism associated with black tar heroin among injecting drug users. J. Am. Med. Assoc. 279, 859-863 (1998).
  19. Brook, I. Infant botulism. J. Perinatol. 27, 175-180 (2007).
  20. Arnon, S. S. Honey, infant botulism and the sudden infant death syndrome. West J. Med. 132, 58-59 (1980).
  21. Arnon, S. S. Infant botulism. Annu. Rev. Med. 31, 541-560 (1980).
  22. Peck, M. W., Stringer, S. C., Carter, A. T. Clostridium botulinum in the post-genomic era. Food Microbiol. 28, 183-191 (2011).
  23. Sharma, S. K., Whiting, R. C. Methods for detection of Clostridium botulinum toxin in foods. J. Food Prot. 68, 1256-1263 (2005).
  24. Sobel, J. Botulism. Clin. Infect. Dis. 41, 1167-1173 (2005).
  25. Chen, S. Clinical uses of botulinum neurotoxins: current indications, limitations and future developments. Toxins. 4, 913-939 (2012).
  26. Sinha, D., Karri, K., Arunkalaivanan, A. S. Applications of Botulinum toxin in urogynaecology. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 133, 4-11 (2007).
  27. Dmochowski, R., Sand, P. K. Botulinum toxin A in the overactive bladder: current status and future directions. BJU Int. 99, 247-262 (2007).
  28. Benecke, R., Dressler, D. Botulinum toxin treatment of axial and cervical dystonia. Disabil. Rehabil. 29, 1769-1777 (2007).
  29. Hunt, T., Clarke, K. Potency evaluation of a formulated drug product containing 150-kd botulinum neurotoxin type A. Clin. Neuropharmacol. 32, 28-31 (2009).
  30. Marchetti, A., et al. Retrospective evaluation of the dose of Dysport and BOTOX in the management of cervical dystonia and blepharospasm the REAL DOSE study. Mov. Disord. 20, 937-944 (2005).
  31. Wohlfarth, K., Sycha, T., Ranoux, D., Naver, H., Caird, D. Dose equivalence of two commercial preparations of botulinum neurotoxin type A: time for a reassessment. 25, 1573-1584 (2009).
  32. AOAC International, Clostridium botulinum and its toxins in foods (method 977.26 section 17.7.01). (2001).
  33. Schantz, E. J., Kautter, D. A. Microbiological methods: standardized assay for Clostridium botulinum toxins. J. AOAC. 61, 96-99 (1978).
  34. Ferreira, J. L. Comparison of amplified ELISA and mouse bioassay procedures for determination of botulinal toxins A, B, E, and F. J. AOAC. Int. 84, 85-88 (2001).
  35. Directive 2003/15/EC of the European Parliament and of the Council. Official Journal of the European Union. (2003).
  36. Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM Scientific Workshop on Alternative Methods to Refine, Reduce or Replace the Mouse LD50 Assay for Botulinum Toxin Testing. Report No. 08-6416, NIH. (2008).
  37. Bitz, S. The botulinum neurotoxin LD50 test - problems and solutions. ALTEX. 27, 114-116 (2010).
  38. Balls, M. Replacing the animal testing of botulinum toxin: time to smooth out the wrinkles. Altern. Lab. Anim. 38, 1-2 (2010).
  39. Balls, M. Botulinum toxin testing in animals: the questions remain unanswered. Altern. Lab. Anim. 31, 611-615 (2003).
  40. Singh, A. K., Stanker, L. H., Sharma, S. K. Botulinum neurotoxin: where are we with detection technologies. Crit. Rev. Microbiol. 39, 43-56 (2013).
  41. Liu, Y. Y., Rigsby, P., Sesardic, D., Marks, J. D., Jones, R. G. A functional dual-coated (FDC) microtiter plate method to replace the botulinum toxin LD50 test. Anal. Biochem. 425, 28-35 (2012).
  42. Ouimet, T., Duquesnoy, S., Poras, H., Fournie-Zaluski, M. C., Roques, B. P. Comparison of Fluorigenic Peptide Substrates PL50, SNAPtide, and BoTest A/E for BoNT/A Detection and Quantification: Exosite Binding Confers High-Assay Sensitivity. J. Biomol. Screen. (2013).
  43. Scotcher, M. C., Cheng, L. W., Stanker, L. H. Detection of botulinum neurotoxin serotype B at sub mouse LD(50) levels by a sandwich immunoassay and its application to toxin detection in milk. PLoS One. 5, (2010).
  44. Mason, J. T., Xu, L., Sheng, Z. M., O'Leary, T. J. A liposome-PCR assay for the ultrasensitive detection of biological toxins. Nat. Biotechnol. 24, 555-557 (2006).
  45. Ruge, D. R., et al. Detection of six serotypes of botulinum neurotoxin using fluorogenic reporters. Anal. Biochem. 411, 200-209 (2011).
  46. Hines, H. B., et al. Use of a recombinant fluorescent substrate with cleavage sites for all botulinum neurotoxins in high-throughput screening of natural product extracts for inhibitors of serotypes A, B, and E. Appl. Environ. Microbiol. 74, 653-659 (2008).
  47. Gilmore, M. A., et al. Depolarization after resonance energy transfer (DARET): a sensitive fluorescence-based assay for botulinum neurotoxin protease activity. Anal. Biochem. 413, 36-42 (2011).
  48. Capek, P., Dickerson, T. J. Sensing the deadliest toxin: technologies for botulinum neurotoxin detection. Toxins. 2, 24-53 (2010).
  49. Bagramyan, K., Barash, J. R., Arnon, S. S., Kalkum, M. Attomolar detection of botulinum toxin type A in complex biological matrices. PLoS One. 3, (2008).
  50. Wang, D., Baudys, J., Kalb, S. R., Barr, J. R. Improved detection of botulinum neurotoxin type A in stool by mass spectrometry. Anal. Biochem. 412, 67-73 (2011).
  51. Parks, B. A., et al. Quantification of botulinum neurotoxin serotypes A and B from serum using mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 9047-9053 (2011).
  52. Kalb, S. R., Goodnough, M. C., Malizio, C. J., Pirkle, J. L., Barr, J. R. Detection of botulinum neurotoxin A in a spiked milk sample with subtype identification through toxin proteomics. Anal. Chem. 77, 6140-6146 (2005).
  53. Kalb, S. R., et al. The use of Endopep-MS for the detection of botulinum toxins A, B, E, and F in serum and stool samples. Anal. Biochem. 351, 84-92 (2006).
  54. Boyer, A. E., et al. From the mouse to the mass spectrometer: detection and differentiation of the endoproteinase activities of botulinum neurotoxins A-G by mass spectrometry. Anal. Chem. 77, 3916-3924 (2005).
  55. Barr, J. R., et al. Botulinum neurotoxin detection and differentiation by mass spectrometry. Emerg. Infect. Dis. 11, 1578-1583 (2005).
  56. Dunning, F. M., et al. Detection of botulinum neurotoxin serotype A, B, and F proteolytic activity in complex matrices with picomolar to femtomolar sensitivity. Appl. Environ. Microbiol. 78, 7687-7697 (2012).
  57. Jones, R. G., Ochiai, M., Liu, Y., Ekong, T., Sesardic, D. Development of improved SNAP25 endopeptidase immuno-assays for botulinum type A and E toxins. J. Immunol. Methods. 329, 92-101 (2008).
  58. Ekong, T. A., Feavers, I. M., Sesardic, D. Recombinant SNAP-25 is an effective substrate for Clostridium botulinum type A toxin endopeptidase activity in vitro. Microbiology. 143 (pt 10), 3337-3347 (1997).
  59. Shone, C. C., Roberts, A. K. Peptide substrate specificity and properties of the zinc-endopeptidase activity of botulinum type B neurotoxin. Eur. J. Biochem. 225, 263-270 (1994).
  60. Piazza, T. M., et al. In vitro detection and quantification of botulinum neurotoxin type e activity in avian blood. Appl. Environ. Microbiol. 77, 7815-7822 (2011).
  61. Mizanur, R. M., Gorbet, J., Swaminathan, S., Ahmed, S. A. Inhibition of catalytic activities of botulinum neurotoxin light chains of serotypes A, B and E by acetate, sulfate and calcium. Int. J. Biochem. Mol. Biol. 3, 313-321 (2012).
  62. Sugii, S., Sakaguchi, G. Molecular construction of Clostridium botulinum type A toxins. Infect. Immun. 12, 1262-1270 (1975).
  63. Sharma, S. K., Ramzan, M. A., Singh, B. R. Separation of the components of type A botulinum neurotoxin complex by electrophoresis. Toxicon. 41, 321-331 (2003).
  64. Bryant, A. M., Davis, J., Cai, S., Singh, B. R. Molecular composition and extinction coefficient of native botulinum neurotoxin complex produced by Clostridium botulinum hall A strain. Protein. J. 32, 106-117 (2013).
  65. Kukreja, R. V., Singh, B. R. Comparative role of neurotoxin-associated proteins in the structural stability and endopeptidase activity of botulinum neurotoxin complex types A and E. 46, 14316-14324 (2007).
  66. Eisele, K. H., Fink, K., Vey, M., Taylor, H. V. Studies on the dissociation of botulinum neurotoxin type A complexes. Toxicon. 57, 555-565 (2011).
Isolatie en kwantificering van botulineneurotoxine uit complexe matrices gebruiken BoTest Matrix Testen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dunning, F. M., Piazza, T. M., Zeytin, F. N., Tucker, W. C. Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays. J. Vis. Exp. (85), e51170, doi:10.3791/51170 (2014).More

Dunning, F. M., Piazza, T. M., Zeytin, F. N., Tucker, W. C. Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays. J. Vis. Exp. (85), e51170, doi:10.3791/51170 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter