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Neuroscience

L'isolement et la quantification de neurotoxine botulique de matrices complexes utilisant les BoTest matrice dosages

doi: 10.3791/51170 Published: March 3, 2014

Summary

La neurotoxine botulique BoTest Matrix (BoNT) des tests de détection de purifier rapidement et quantifier BoNT d'une gamme de matrices d'échantillons. Ici, nous présentons un protocole pour la détection et la quantification de la BoNT de matrices solides et liquides et de démontrer l'essai avec BOTOX, les tomates et le lait.

Abstract

Détection précise et la quantification de la neurotoxine botulique (BoNT) dans des matrices complexes est nécessaire pour l'industrie pharmaceutique, l'environnement, et les essais de l'échantillon de la nourriture. Les tests rapides BoNT des denrées alimentaires est nécessaire pendant la criminalistique épidémiologiques, le diagnostic du patient, et des tests de sécurité alimentaire lors des tests d'activité précis est nécessaire pour la fabrication d'un produit médicamenteux à base de BoNT et la sécurité des patients. Le bio-essai souris largement utilisé pour les tests BoNT est très sensible mais manque de précision et le débit nécessaire pour les tests BoNT rapide et la routine. En outre, l'utilisation de l'essai biologique des animaux a suscité des appels par les autorités de réglementation des produits de la drogue et les partisans des droits des animaux aux États-Unis et à l'étranger pour remplacer le bio-essai sur souris pour les tests BoNT. Plusieurs essais in vitro de remplacement ont été développés qui fonctionnent bien avec purifiée BoNT dans des tampons simples, mais la plupart n'ont pas été montré pour être applicable à l'essai dans des matrices complexes. Ici, un protocole pour la détection d'BoNT dans des matrices complexes en utilisant les BoTest matrice essais est présenté. Le test se compose de trois parties: La première partie comprend la préparation des échantillons pour essais, la deuxième partie est une étape d'immunoprécipitation utilisant des anticorps anti-BoNT billes paramagnétiques recouvertes d'anticorps pour purifier BoNT de la matrice, et la troisième partie quantifie la protéolytique de l'isolement BoNT activité en utilisant un journaliste fluorogène. Le protocole est écrite pour le test à haut débit dans des plaques à 96 puits en utilisant des matrices à la fois liquides et solides et nécessite environ 2 heures de préparation manuelle avec le total des temps de dosage de 4-26 heures, selon le type d'échantillon, la charge de la toxine, et la sensibilité souhaitée. Les données sont présentées pour BoNT / A l'essai avec tampon phosphate salin, un médicament, un surnageant de culture, lait 2%, et les tomates fraîches et comprend la discussion des paramètres essentiels à la réussite du test.

Introduction

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neurotoxines botuliques (de Bont) sont les substances les plus mortelles connues, avec des doses létales humaines intraveineuses estimés à 1-3 ng / kg 1,2. Sept sérotypes de BoNT structurellement similaires, marqués de A à G, exister, chacun consistant en un domaine de chaîne lourde responsable de la liaison cellulaire, l'absorption et la translocation dans le cytosol et d'une chaîne légère qui code pour une endopeptidase de zinc 5.3. La toxicité exquis de BoNT résulte, en partie, son entrée obligatoire et spécifique dans les neurones moteurs à la jonction neuromusculaire 6. Une fois à l'intérieur du neurone, l'endopeptidase de la chaîne légère clive spécifiquement une ou plusieurs de la N-éthylmaléimide sensible récepteur soluble de la protéine de fixation du facteur (SNARE) des protéines nécessaires à la fusion des vésicules, l'inhibition de la libération de neurotransmetteurs et conduisant à la paralysie flasque 7-14. Communément appelée la maladie "botulisme" paralysie du diaphragme et des muscles intercostaux par BoNT aboutit finalement dansinsuffisance respiratoire et la mort moins le diagnostic précoce et le traitement sont reçus.

Origine alimentaire humaine botulisme est le plus souvent associée à BoNT sérotypes A, B, E, et F (BoNT / A, BoNT / B, etc) et se traduit généralement par l'ingestion d'aliments contaminés 15,16; bien que, plusieurs cas de botulisme par blessure ont été signalés chez les usagers de drogues par voie intraveineuse 17,18. Aux États-Unis, le botulisme infantile résultant de l'ingestion de spores de Clostridium par les enfants de moins de un est la forme la plus commune de botulisme 19-21. Cependant, les épidémies d'origine alimentaire de neurotoxines botuliques résultant de la mise en conserve domestique inadéquate et la transformation des aliments ont été signalés dans les États-Unis et à l'étranger. Entre 2000-2009, au moins 338 cas de botulisme d'origine alimentaire ont été signalés dans le monde entier, y compris six décès 22. La capacité de détecter rapidement et de manière sensible des éclosions de botulisme d'origine alimentaire est une indication critique qui pourrait faciliter le diagnostic précoce 23,24. En outre, les méthodes de détection qui permettent rentable et les tests de routine alimentaire permettront d'améliorer la sécurité alimentaire.

Spécificité neuronale de BoNT et longue demi-vie biologique rend également une thérapeutique efficace. Aux États-Unis, les médicaments à base de BoNT sont approuvés par la Food and Drug Administration pour le traitement de conditions cosmétiques et de troubles liés neuromusculaires, y compris les rides glabellaires, la dystonie cervicale, des migraines, de la vessie hyperactive, et le strabisme. De nombreuses applications "off-label" sont documentées, y compris les traitements à forte dose pour grave dysfonctionnement musculaire 25-28. Précise toxine quantification est essentiel pour un dosage correct, comme un sous-dosage peut conduire à un traitement inefficace tout surdosage met les patients à risque d'effets secondaires potentiellement dangereux. Malheureusement, aucun protocole de test de puissance normalisée est partagée entre les fabricants, ce qui entraîne des inégalités de définition de l'unité entre les producteurs de médicaments à base de BoNTcts 29-31.

Le test standard pour BoNT est le bio-essai souris dans lesquelles des échantillons contenant BoNT sont injectés par voie intrapéritonéale à des souris et le nombre de décès enregistrés plus de 1-7 jours 16,32,33. Le bio-essai sur souris est très sensible aux limites de détection (LOD) de 5-10 pg BoNT / A 34, mais les préoccupations éthiques sur l'utilisation des animaux, le coût élevé de la formation du personnel et l'entretien des installations d'animaux, les temps de dosage longues, et le manque de protocoles normalisés ont donné lieu à des appels à se développer, les tests BoNT standardisé sans animaux et méthodes de quantification 35-39. Récemment, plusieurs méthodes de quantification de neurotoxines botuliques alternatifs ont été développés qui offrent la souris ou à proximité de la souris essai biologique sensibilité 40-49. Ces méthodes utilisent couramment fluorescence, spectrométrie de masse, ou des méthodes immunologiques et offrent des temps d'analyse considérablement plus courte que le bio-essai sur souris sans l'utilisation d'animaux. Spectrométrie de masse approches combinées avec techniq immunologiqueues ont été présentés pour détecter et quantifier BoNT contenue dans les aliments et autres échantillons complexes; toutefois, les exigences de formation du personnel et la limite de l'équipement spécialisé ces dosages 50-55. La plupart des autres tests alternatifs ne sont pas facilement applicable à des tests d'échantillonnage complexe ou n'ont pas le débit requis pour les tests de routine BoNT. La nature très variable de la viscosité de l'échantillon alimentaire, le pH, la teneur en sel, et constituants de la matrice présente un défi particulièrement difficile lorsque vous essayez de développer des méthodes d'essai in vitro avec une sensibilité pour correspondre à la puissance extrême de BoNT. De plus, même les systèmes tampons simples et relativement bénignes, telles que celles résultant de la remise en suspension de produits médicamenteux à base de BoNT, contiennent des sels, l'albumine, le sucre et les stabilisants (par exemple excipients) qui ont une incidence significative in vitro BoNT puissance 56. purification de la toxine est nécessaire pour le contrôle de l'activité précise de tous, mais le plus simple des échantillons 56-59.

LaBoTest essais de Matrix ont été conçus pour rapide, à haut débit, et la quantification de la BoNT cohérente à partir d'échantillons très complexes utilisant des équipements couramment dans les laboratoires de recherche 56,60. Ces tests utilisent des billes paramagnétiques liés de manière covalente à des anticorps anti-BoNT sérotypes spécifiques de lier et séquestrer BoNT sur un échantillon, puis retirez interférer composés de la matrice par lavage. Après lavage, l'activité protéolytique de BoNT lié est ensuite quantifiée dans un tampon de réaction optimisé en utilisant un rapporteur compatible avec le sérotype BoNT testé. Ces rapporteurs sont des protéines fluorogènes constitués d'un cyan N-terminal de la protéine fluorescente (PCP) du fragment et un jaune fluorescent dérivé de protéine C-terminal de la fraction (Venus) reliés par un substrat de BoNT, les résidus de SNAP25 141-206 ou les résidus Synaptobrevin 33-94 constituant l' BoTest A / E ou B / D / F / G journalistes, respectivement 45. Reporter clivage par BoNT est contrôlée en utilisant Förster transfert d'énergie par résonance (FRET). Quand til rapporteur est intact, l'excitation de la PCP en résulte FRET à Vénus, trempe PCP émission et passionnante émission Vénus. Le clivage de la reporter par la BoNT empêche FRET, conduisant à une augmentation de la PCP et de diminution de l'émission de Vénus émission. Activité BoNT peut alors être mesuré quantitativement utilisant le ratio des émissions PCP et Vénus. LOD-dessous de 3 pg sont possibles à partir d'un large éventail d'aliments en utilisant un format de plaque de 96 puits à haut débit 56. Sensibilité accrue peut être obtenue en utilisant des volumes d'échantillon plus grands depuis la concentration de dosage permet la toxine sur la surface des billes.

Les essais de la matrice BoTest pour BoNTs A, B, E, et F ont été développés et testés avec de la nourriture, des produits pharmaceutiques, et les échantillons environnementaux 56,60. Ici, nous décrivons les procédures pour exécuter ces tests pour la détection des BoNT faible complexité (par exemple, pharmaceutique, BoNT dans le tampon) et haute complexité (par exemple la nourriture, de l'environnement) des échantillons. Méthodes de traitement spécifiquespour plusieurs types d'échantillons sont traités dans ce protocole et les types d'échantillons ne sont pas décrites ici peuvent généralement être adaptées en utilisant une combinaison des méthodes présentées. Le protocole a été développé et testé avec BoNT / A, mais est adaptable à d'autres sérotypes de neurotoxines botuliques en utilisant leurs analyses respectives comme en témoigne d'ailleurs 56,60.

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Protocol

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Une. Préparation des réactifs d'essai

  1. Dégel dithiothréitol 200x (TNT), 10x matrice tampon de liaison (10x liaison de la suite de tampon), 10x tampon de neutralisation (alimentaires ou de pH des échantillons déséquilibrées seulement), et 10x BoTest tampon de réaction (10x Reaction ci tampon) à température ambiante (RT) pendant 15 min ou jusqu'à ce que complètement dégelé. Voir le tableau 1 pour la liste des tampons et des réactifs utilisés dans ce protocole. Voir le tableau 2 pour une liste des matériaux et l'équipement requis pour ce protocole.
  2. Vortex tampons décongelés pendant 5 sec pour mélanger. 10x neutralisation tampon, 200xDTT, et 10x tampon de réaction doivent apparaître clairement alors que le tampon de liaison 10x aura un aspect trouble. Réchauffer le tampon de réaction 10x pendant 5 min à 37 ° C et répéter vortex si elle apparaît trouble après la décongélation.
  3. Générer 3,8 ml de tampon de réaction 1 x.
    1. Étiqueter un «tampon de réaction de 1x" 15 ml conique du tube et ajouter 3,42 ml biologie moléculaire qualité water, 380 ul 10x tampon de réaction, et 19 pl 200x TNT. Mélanger tampon bien par inversion.
    2. Inhibiteurs de couper un seul comprimé d'inhibiteur de la protéase sans EDTA dans les quartiers à l'aide d'une lame de rasoir propre et ajouter un quart de la tablette pour le tampon de réaction 1x (la partie de la tablette restant peut être conservé à 4 ° C pour une utilisation ultérieure). NB protéase ne peut pas être nécessaire si vous utilisez toxine purifiée et tampons simples (par exemple, des échantillons pharmaceutiques).
    3. Vortex le tampon de réaction 1 x jusqu'à ce que la tablette de la protéase est complètement dissous.
  4. Réchauffez les perles matrice A (perles IP-A ci-après) pendant 20 min à température ambiante.
  5. Décongeler le journaliste BoTest A / E (A / E journaliste ci-après) à la température ambiante à l'abri de la lumière.
  6. Etiqueter un tube de 15 ml conique "0,5 uM A / E rapporteur" et ajouter 45 ul de 20 uM A / E journaliste actions pour 1,8 ml de tampon 1x de réaction. Bien mélanger par pipetage et stocker sur la glace abri de la lumière.

2. Supporterard génération de l'échantillon de la courbe

La courbe standard décrit ici s'étend 10-30,000 mLD 50 / g d'aliment ou par tampon ml des dilutions demi-logarithmiques (tableau 3). L'utilisateur final est libre d'utiliser des concentrations de remplacement le cas échéant.

  1. Enrichir et incubation des matrices avec des matériaux de référence. Générer la courbe standard en utilisant un diluant de la même matrice que l'inconnu, si possible, afin de réduire les effets de matrice. Utiliser de la gélatine tampon phosphate (GPB) ou une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) comme diluant si d'autres matrice, BoNT négatif n'est pas disponible (par exemple champ ou test de l'échantillon de l'éclosion BoNT). Générer la courbe standard par dopage BoNT / A dans la matrice de choix en suivant le protocole approprié ci-dessous.
    1. Échantillons de faible complexité (par exemple PBS, GPB, ou pharmaceutique)
      1. Ajouter 10 ml de tampon approprié à un tube de 15 ml conique et mettre de côté. Cet exemple sera utilisé comme diluant pour la standard courbe et dilutions inconnus (section 4).
      2. Ajouter 1,2 ml de tampon dans un tube à centrifuger.
      3. ATTENTION: Cette étape utilise BoNT et une extrême prudence doit être utilisé lors de la manipulation et de l'élimination de tous les réactifs et les matériaux qui entrent en contact avec la toxine. L'utilisation des équipements de protection individuelle et l'élimination de tous les matériaux doit être effectuée selon le ministère de lignes directrices du travail de l'OSHA pour BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) des États-Unis. Ajouter BoNT / A à 1,2 ml de l'échantillon de telle sorte que la concentration finale est de 30.000 MLD 50 / ml (36000 mLD 50 au total).
    2. Échantillons d'aliments liquides (ou d'autres échantillons de liquides complexes) Note: le test initial est recommandé de déterminer le volume de surnageant récupéré à partir d'échantillons clarifié que la matière particulaire (. Des pâtes par exemple) dans des matrices liquides varie. Ce protocole suppose au moins 1,2 ml de surnageant clarifié seront récupérés à partir d'un samp 1,4 mlle. Augmenter la taille de l'échantillon si nécessaire.
      1. Ajouter 10 ml de liquides alimentaires dans un tube conique de 15 ml et le mettre de côté. Cet échantillon sera utilisé comme diluant pour la courbe d'étalonnage et les dilutions inconnus (section 4).
      2. Peser un tube de 1,5 ml microtubes vide et enregistrer sa masse.
      3. Ajouter 1,4 ml de l'aliment liquide au tube à centrifuger pesé.
      4. Peser à nouveau le tube de microcentrifugeuse et calculer la masse de la prise alimentaire ajoutée en soustrayant la masse du tube vide.
      5. ATTENTION: Cette étape utilise BoNT et une extrême prudence doit être utilisé lors de la manipulation et de l'élimination de tous les réactifs et les matériaux qui entrent en contact avec la toxine. L'utilisation des équipements de protection individuelle et l'élimination de tous les matériaux doit être effectuée selon le ministère de lignes directrices du travail de l'OSHA pour BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) des États-Unis. Ajouter BoNT / A à l'échantillon de 1,4 ml à une concentration finale de 30 000 mLD 50 / g d'aliment.
      6. IncubationTE et le diluant des échantillons dopés à la température ambiante ou à 4 ° C pendant 2 heures pour donner le temps de BoNT d'interagir avec la matrice alimentaire, imitant une contamination naturelle.
    3. Les échantillons solides alimentaires (ou d'autres échantillons solides) Remarque: le test initial est recommandé de déterminer le volume de surnageant récupéré à partir d'échantillons homogénéisés et clarifiées suite à l'ajout de 1 ml GPB / g d'aliment. Ce protocole suppose que au moins 1,2 ml clarifiées surnageant sera récupéré à partir d'un échantillon de 2 g. Augmenter la taille de l'échantillon si nécessaire.
      1. Peser 10 g d'échantillon solide dans un tube conique de 50 ml et mettre de côté. Ceci sera utilisé comme diluant.
      2. Peser 2 g de solide échantillon de produit alimentaire dans un second tube conique de 50 ml.
      3. ATTENTION: Cette étape utilise BoNT et une extrême prudence doit être utilisé lors de la manipulation et de l'élimination de tous les réactifs et les matériaux qui entrent en contact avec la toxine. L'utilisation des équipements de protection individuelle et l'élimination de toutes les matièress doivent être effectuées selon le ministère de lignes directrices du travail de l'OSHA pour BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) des États-Unis. Ajouter BoNT / A à la surface de l'échantillon 2 g à une concentration finale de 30 000 mLD 50 / g nourriture (total 60000 mLD 50).
      4. Incuber les échantillons dopés diluant et à la température ambiante ou à 4 ° C pendant 2 heures pour donner le temps de BoNT d'interagir avec la matrice alimentaire, imitant une contamination naturelle.
  2. homogénéisation de l'échantillon et le tampon ajustement. Traiter l'échantillon de courbe standard enrichi et diluant généré ci-dessus selon le type d'échantillon.
    1. Les échantillons de faible complexité
      1. Aucun autre traitement de l'échantillon est nécessaire.
    2. échantillons d'aliments liquides (ou d'autres échantillons de liquides complexes)
      1. Aucun échantillon homogénéisation est nécessaire.
      2. Ajouter 140 pi de tampon 10x de neutralisation de 1,4 ml échantillon enrichi et 1 ml 10x Neutralization tampon à l'échantillon de 10 ml de diluant. Bien mélanger les échantillons par inversion.
      3. Clarifier partiellement les deux échantillons par centrifugation pendant 10 min à 6000 x g et 4 ° C. Retirer immédiatement les surnageants et transférer dans de nouveaux tubes.
    3. Échantillons d'aliments solides (ou d'autres échantillons solides)
      1. Ajouter 2 ml GPB (1 ml GPB / g d'aliment) à la 2 g BoNT / A-échantillon enrichi de nourriture solide et 10 ml GPB à l'échantillon de 10 g de diluant.
      2. Homogénéiser les échantillons à l'aide d'un pilon jusqu'à ce que bien mélangé. En fonction de la nature de l'échantillon, il peut y avoir de petits morceaux de matériau qui ne peut pas être homogénéisée, ce qui est acceptable. Alternativement, les méthodes d'homogénéisation mécaniques peuvent être utilisés. L'utilisation d'un mélangeur n'est pas recommandé car il peut inactiver ainsi que aérosoliser la toxine.
      3. Ajouter le volume de 1/10e de tampon 10x neutralisation de l'échantillon de diluant sur ​​la base du volume total approximatif (par exemple 2 ml, si le volume est de 20 ml). Extrapolerle volume total de l'/ A-échantillon enrichi BoNT et ajouter du volume de 1/10e de 10x tampon de neutralisation. Bien mélanger les échantillons par inversion.
      4. Clarifier partiellement les deux échantillons par centrifugation pendant 10 min à 6000 x g et 4 ° C. Retirer immédiatement les surnageants et transférer dans de nouveaux tubes.
  3. Préparer des dilutions en série de courbes standards pour les tests
    1. Utilisation de la BoNT / A-dopés exemple de courbe d'étalonnage comme D1 et l'échantillon nonspiked comme diluant, de générer les échantillons restants de la courbe standard de 1,5 ml microtubes selon le tableau 3.

3. Préparer des échantillons inconnus

Cette section peut être complété en parallèle à la section 2.

  1. Déterminer le nombre et les dilutions d'inconnues. Testez inconnues en triple exemplaire, si possible.
    1. Pour les analyses qualitatives, exécutez les inconnues sans dilution supplémentaire n'est requis pour traiter l'échantillon comme descriLit ci-dessous.
    2. Pour des dosages quantitatifs, préparer au moins deux échantillons de dilution 1:10, tel que décrit ci-dessous, afin de s'assurer que un ou plusieurs échantillons tombent dans la plage linéaire de la réponse du dosage. Générer des dilutions en utilisant un diluant de la même matrice que l'inconnu, si possible, pour réduire les effets de la matrice comme décrit dans la section 3. Sinon, utilisez PBS ou GPB comme diluant.
  2. La génération et la dilution des échantillons inconnus d'après le type d'échantillon.
    1. Inconnues faible complexité (par exemple PBS, GPB, ou pharmaceutique)
      1. Ajouter au moins 750 pi inconnus dans un tube à centrifuger pour générer Inconnu dilution 1.
      2. Ajouter 675 pi de diluant pour deux tubes à centrifuger marqués Inconnu dilution 2 et 3. Le diluant est le même matériau utilisé pour la génération de la courbe standard.
      3. Série diluer dilution 1 en transférant 75 ul de dilution 1 dans le tube dilution 2 et mélanger.
      4. Série DILUTe dilution 2 en transférant 75 ul de dilution 2 dans le tube dilution 3 et mélanger.
    2. Inconnues alimentaires liquides (ou d'autres échantillons de liquides complexes) Note: le test initial est recommandé de déterminer le volume de surnageant récupéré à partir d'échantillons clarifiés comme indiqué à la section 3. Augmenter la taille de l'échantillon si nécessaire.
      1. Ajouter ≥ 875 pi de l'inconnu liquide dans un tube à centrifuger.
      2. Ajouter le volume de 1/10e de tampon 10x neutralisation de l'échantillon (par exemple 87,5 pi d'un échantillon de 875 pi).
      3. Clarifier partiellement l'échantillon par centrifugation pendant 10 min à 6000 x g et 4 ° C. Transférer immédiatement le surnageant dans un nouveau tube. C'est Inconnu dilution 1.
      4. Ajouter 675 pi de diluant pour deux tubes étiquetés Inconnu dilution 2 et 3. Le diluant est le même matériau traité utilisé pour la génération de la courbe standard.
      5. Série diluer dilution 1 par transfertanneau 75 ul de dilution 1 dans le tube dilution 2 et le mixage.
      6. Série diluer dilution 2 en transférant 75 ul de dilution 2 dans le tube dilution 3 et mélanger.
    3. Inconnues solides alimentaires (ou d'autres échantillons solides) Remarque: le test initial est recommandé de déterminer le volume de surnageant récupéré à partir d'échantillons clarifié comme on le verra dans la section 3. Augmenter la taille de l'échantillon si nécessaire.
      1. Peser 2 g de l'échantillon inconnu solide dans un tube conique de 50 ml.
      2. Ajouter 2 ml GPB (1 ml GPB / g d'aliment) à l'échantillon de 2 g solide.
      3. Homogénéiser les échantillons comme décrit dans la section 3.2.3.2.
      4. Ajouter le volume de 1/10e de 10x tampon de neutralisation de l'échantillon sur la base du volume total approximatif (par exemple 0,4 ml si le volume est de 4 ml). Bien mélanger les échantillons par inversion.
      5. Clarifier partiellement l'échantillon par centrifugation pendant 10 min à 6000 x g et 4 ° C. Immediateltransfert de 750 ul de y ≥ surnageant dans un tube à centrifuger. C'est Inconnu dilution 1.
      6. Ajouter 675 ml de diluant à deux tubes étiquetés Inconnu dilution 2 et 3. Le diluant est le même matériau traité utilisé pour la génération de la courbe standard.
      7. Série diluer dilution 1 en transférant 75 ul de dilution 1 dans le tube dilution 2 et mélanger.
      8. Série diluer dilution 2 en transférant 75 ul de dilution 2 dans le tube dilution 3 et mélanger.

4. Clarification de l'échantillon final

Si le liquide d'essai ou des échantillons d'aliments solides, centrifugeuse tous les échantillons pendant 5 min à 14 000 xg ≥ dans une micro pour clarifier pleinement les échantillons. Retirer immédiatement les surnageants et transférer dans de nouveaux tubes.

5. Configuration de la plaque et BoNT / un menu déroulant

  1. Le plan de plaque spécifique dépend de l'application, mais ne pas utiliser les puits à l'extérieur de manièrepour éviter les effets de bord. Chaque échantillon inconnu et un échantillon de courbe standard D1-D8 nécessite 3 puits tandis que l'échantillon D9 nécessite 6 puits. Un plan de plaque suggéré est représenté sur la figure 1.
  2. Ajouter 20 ul de 10 x tampon de liaison à chaque puits pour être utilisé.
  3. Ajouter 200 ul de chaque dilution clarifié et inconnu à chacun des trois puits (six puits pour D9) pour les tests de trois exemplaires. Mélanger la plaque pendant 10 secondes sur un mélangeur à microplaque.
  4. Ajouter les perles IP-A.
    1. Vortex les perles IP-A pendant 10 secondes à la vitesse la plus élevée. Continuer vortex si perles ne sont pas entièrement remises en suspension et homogène.
    2. Pipette 20 ul IP-A perles à chaque échantillon ainsi.
    3. Mélanger la plaque pendant 30 secondes sur un mélangeur à microplaque.
  5. Incuber la plaque à l'aide d'une plaque de l'incubateur rotatif pendant 2 heures à 750 tours par minute, 25 ° C ou à la température ambiante. Les performances du test est très dépendante de la génération et le maintien de l'IP-A suspension de billes pendant toutes les étapes d'incubation. Toujours perles resuspendre avec un microPmélangeur tard après la granulation et de maintenir la suspension à l'aide d'une plaque de microtitration agitation pendant toutes les étapes d'incubation.

6. Plaque à laver et perle Resuspension

  1. Laver les plaques à la main ou à l'aide d'une plaque magnétique automatisé laveur de perles-compatible. Une machine à laver automatique de plaque configuré pour billes magnétiques augmente considérablement le débit dosage.
    1. Lave-Manuel
      1. Etiqueter un tube conique de 50 ml "tampon 1x Wash" et ajouter 45 ml d'eau de qualité de biologie moléculaire et 5 ml 10x matrice tampon de lavage. Mélanger tampon bien par inversion.
      2. Retirer la plaque de la plaque tournante incubateur.
      3. Placer immédiatement la plaque sur une bille magnétique plaque de 96 puits de séparation pendant 5 min.
      4. Tout en gardant la plaque sur la plaque de 96 puits séparation par billes magnétiques, retirez délicatement et jeter les surnageants des puits d'échantillon à l'aide d'une pipette multi-canal unique ou. Ne pas aspirerperles visuellement surveiller le tampon aspiré dans la pointe de pipette pour le retrait accidentel du cordon. Si le retrait est témoin, ajouter délicatement le contenu de la pointe vers le bien, reséparer, et répéter l'enlèvement.
      5. Ajouter 300 ul de tampon de lavage 1x pour chaque échantillon.
      6. Remettre en suspension les billes entièrement en mélangeant la plaque pendant 30 secondes sur un mélangeur à microplaque.
      7. Incuber la plaque sur la bille magnétique plaque de 96 puits de séparation pendant 2 min.
      8. Retirez et jetez les surnageants des puits d'échantillon comme avant.
      9. Répétez les étapes 6.1.1.5-6.1.1.8 trois fois pour un total de 4 lavages.
      10. Avec la plaque sur la bille magnétique plaque à 96 puits de séparation, inspecter visuellement les puits pour confirmer la suppression même surnageant; utiliser une pipette pour enlever l'excès de tampon résiduel nécessaire. Certains tampon restera dans les puits et des précautions doivent être prises pour éviter le retrait de talon ou de séchage des billes.
      11. Ajouter 50 ul de tampon de réaction 1x pour chaque échantillon et mélanger la plaque 30 sec sur un mélangeur à microplaque pour remettre en suspension les billes entièrement. Si nécessaire, utiliser une pipette pour remettre en suspension entièrement les perles.
    2. Lave-automatique de plaques
      1. Configuration de la machine à laver et d'un programme selon le tableau 4. Nettoyez et rincez la vaisselle de haute qualité (par exemple nanopure) de l'eau.
      2. Premier de la rondelle en exécutant le programme "Premier".
      3. Retirer la plaque de la plaque tournante incubateur.
      4. Placer immédiatement la plaque sur la bille magnétique plaque de 96 puits de séparation sur la rondelle de la plaque.
      5. Exécutez le programme de lien "Maître Wash". La première étape du programme est une étape d'incubation de 5 min lorsque la rondelle est à l'arrêt.
      6. Après l'achèvement du programme, retirez la plaque de la machine à laver, ajouter un tampon de réaction 1x 50 pi de chaque échantillon, et mélanger la plaque pendant 30 secondes sur un mélangeur de microplaques pour remettre en suspension entièrement les perles. Si nécessaire, utiliser une pipette pour remettre en suspension entièrement les perles.

    7. Essai Initiation et incubation

    1. Ajouter 50 ul de 0,5 uM A / E journaliste (voir chapitre 1) pour chaque échantillon et mélanger pendant 30 secondes sur un mélangeur de microplaques pour remettre en suspension entièrement les perles.
    2. Ajouter 100 ul d'eau à chaque puits utilisé sur la plaque pour éviter les effets de bord.
    3. Sceller la plaque avec la plaque film adhésif et incuber la plaque à l'aide d'une plaque incubateur tournant à 750 tours par minute, 25 ° C ou RT. Protéger la plaque de la lumière pendant l'incubation.

    8. Collecte et analyse des données

    Remarque: Cette analyse est une analyse en temps réel qui peut être mesurée à plusieurs reprises jusqu'à ce que la sensibilité souhaitée est obtenue, il n'y a pas de butée de réactifs nécessaires. Recommandés temps de lecture initiales sont 2, 4, et 24 heures de temps d'incubation avec la sensibilité du test augmente avec le temps d'incubation.

    1. La collecte des données
      1. A chaque temps de lecture, retirez la plaque de la plaque tournante incubateur, retirer le jointment du ruban, et placer immédiatement la plaque sur la bille magnétique plaque de 96 puits de séparation. Permettre aux billes de se séparer pendant 2 min.
      2. Placer la plaque dans le lecteur de microplaques et de mesurer les émissions à ~ 470 et ~ 526 nm sous excitation à 434 nm ~.
      3. Si le temps de lecture supplémentaires sont souhaités, remettre en suspension les perles pendant 30 secondes sur le mélangeur de microplaques, refermer la plaque, et retourner la plaque à la plaque tournante incubateur.
    2. L'analyse des données
      1. Calculer le rapport d'émission pour chaque échantillon en divisant l'unité de fluorescence relative (RFU) de la valeur à 526 nm par la valeur de la RFU à 470 nm.
      2. Tracer le rapport d'émission en fonction du log [BoNT / A] pour les points de données de courbe standard. Selon la BoNT / A Gamme de puissance testé, une courbe dose-réponse sigmoïde sera obtenue (voir Résultats représentant).
      3. Monter les données de la courbe standard avec la courbe dose-réponse à pente variable Y = Bottom + (Haut-Bas) / (1 ​​+10 ^ ((logEC 50-X) * versant)) où X est lelogarithme de la concentration, Y est la réponse, et Y commence à fond et va de la page avec une forme sigmoïde.
      4. Déterminer les limites de détection (LOD), limites de quantification (LQ), et la concentration efficace demi-maximale (CE 50). Les limites de détection sont définis comme un échantillon ayant un rapport d'émission moins de 3 écarts-types (DS) ci-dessous les témoins à blanc (n = 6). Limites de quantification sont définis comme un échantillon ayant un rapport d'émission moins de 10 DS ci-dessous les témoins à blanc (n = 6). CE 50 est déterminée à partir de l'ajustement de courbe dose-réponse sigmoïdale.
      5. Interpoler la puissance de tous les échantillons inconnus contre la courbe standard dose-réponse sigmoïde.
        1. Pour obtenir des résultats quantitatifs, l'échantillon inconnu devrait idéalement s'inscrire dans la partie linéaire de la courbe étalon. Approximation de la partie linéaire de la courbe d'étalonnage en calculant le total fenêtre de réponse de dosage de 20 à 80% (par exemple, si le rapport d'émission de la courbe r-typeanges de 0,5 à 2,5, la plage linéaire serait la portion de la courbe d'étalonnage qui varie de 0,9 à 2,1).
        2. Pour obtenir des résultats qualitatifs, comparer l'échantillon inconnu contre la LD et la LQ de la courbe standard.
        3. Ne pas extrapoler les échantillons inconnus au-delà des limites de la courbe standard.

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Representative Results

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Un diagramme résumant les étapes du protocole décrit est représenté sur la figure 2. Le dosage nécessite entre 4-26 heures à compléter en fonction du type d'échantillon et la sensibilité du test désiré, mais seulement ~ 2 heures de temps de manipulation. Le dosage est réalisé dans des plaques à 96 puits et, en fonction du type de test en cours d'exécution, permet de tester trois exemplaires de jusqu'à 20 échantillons par plaque y compris les normes.

La figure 3 montre les résultats d'analyse représentatifs utilisant BoNT / A holotoxine ajouté dans du PBS et on a testé le protocole décrit ci-dessous de 2, 4, et 24 heures d'incubation avec le A / E reporter. Purifié BoNT / A holotoxine a été choisi pour cette expérience parce que son poids moléculaire défini de ~ 150 kDa, par rapport à la définition plus large de 700 à 900 kDa pour le complexe de la toxine, et la pureté de permettre dopage très précise à des concentrations précises. Le taux d'émission, le rapport d'émission à 526 nm à celle à 470 nm après excitation à 434nm, à chaque point de temps est tracé en fonction de la BoNT / A concentration (la valeur mLD 50 est basé sur le contrôle de l'activité de l'/ Un fabricant BoNT). Le clivage de la journaliste par BoNT est mesurée comme une réduction du taux d'émission, qui avec notre lecteur de plaque est comprise entre environ 2,7 pour le journaliste intact à environ 0,7 pour le journaliste totalement clivé. Il est important de noter que, étant donné que chacune des mesures d'un lecteur de plaque de fluorescence en RFU, la valeur effective du rapport d'émission sera fonction du lecteur de plaque utilisée. Allongement du temps d'incubation avec les résultats de reporter à une augmentation clivage de journaliste comme on le voit par le déplacement vers la gauche de la courbe. Les points de données, testés en triple exemplaire, affichent faible SD de la moyenne et de suivre l'évolution attendue de l'augmentation de rapport d'émission avec réduction de la charge de la toxine. L'échec de l'essai de suivre cette tendance devrait peut indiquer une erreur lors de la génération de dilution ou de traçage de données. Les rapports d'émission des témoins ne contenant pas BoNT / A restent également stables During l'incubation (Figure 3, en médaillon), ce qui indique l'absence d'activité de la protéase non spécifique.

Un exemple d'utilisation de ce protocole pour quantifier les échantillons BoNT / A pharmaceutiques est représentée sur la figure 4. Une courbe standard a été générée en PBS avec purifiée BoNT / Holotoxine et traité en parallèle avec des dilutions de médicament générées à partir d'un seul flacon de 100 U de BOTOX lyophilisé réhydraté dans saline à 0,9%. (Dans l'idéal, la courbe standard sera composé des lots de référence de BOTOX mais un tel matériau n'était pas facilement disponible.) Les échantillons ont été testés selon le protocole décrit à l'exception que les échantillons de 50 pi ont été testés en double exemplaire, sans l'utilisation de 10x tampon de liaison. La courbe étalon a été tracée en fonction de la BoNT / A la suite de la concentration de 24 heures d'incubation avec le A / E reporter. Le taux d'émission de chaque échantillon inconnu est ensuite visualisée en traçant son intersection entre la courbe standard. Dans ce test, la lignepartie ar de la courbe standard (la fenêtre de 20 à 80% de réponse du dosage) se situe entre un rapport d'émission de 2.11 à 1.5 et est indiqué par la case en pointillés sur la figure. Les concentrations des trois inconnues qui tombent dans cette gamme linéaire sont ensuite interpolés à partir de la courbe d'étalonnage (Figure 4, encart). Cet exemple démontre la méthode générale qui serait utilisé pour détecter ou quantifier n'importe quel échantillon inconnu à une courbe standard.

Tomates fraîches et 2% de lait ont été choisis pour démontrer les performances et la sensibilité à l'aide à la fois un solide (tomate) et des aliments liquides (lait 2%) matrice du protocole. BoNT / A complexe composé de l'holotoxine de base et les protéines de neurotoxine associée (PAN) a été choisi pour ces expériences, car cette préparation ressemble à la toxine produite lors d'une contamination de Clostridium naturel. Comme le montre la figure 5A, la récupération de la BoNT / A, mesuré par le clivage de l'A / E reporter, qui est observé avec bmatrices OTH. Augmentation du temps d'incubation avec le journaliste augmente la sensibilité du test, mais n'entraîne pas de rapports d'émission diminué pour les pas de contrôle des toxines (figure 5A, encarts), indiquant les résultats de clivage observés de BoNT / A et protéase pas non spécifique report de la nourriture dans le dosage. Comme avec la figure 3, l'affichage des données à faible variabilité et suit l'évolution attendue de la diminution journaliste clivage avec diminution de la concentration de toxine.

La BoNT / A LOD, LOQ, et CE 50 pour les aliments à chaque point indiqué de temps sont résumés dans le tableau 5. La LD et LQ sont définis comme le meilleur exemple de concentration avec un rapport d'émission inférieure à trois et dix DS ci-dessous (fond échantillons ne contenant pas de BoNT / A), respectivement. Ces limites sont limités à des points de données testées, bien que l'interpolation de la courbe dose-réponse sigmoïde peut être utilisée pour calculer les limites théoriques inférieures. Certains matrice-à-matrice variabilité de LD et LQ est prévu, en tant que les effets de matrice peuvent influencer la liaison de la toxine à des billes et la récupération des perles pendant le lavage. Bien qu'il semble qu'il n'y avait plus la récupération de la toxine de 2% de lait de tomates à partir des données de la figure 5A, une grande partie de cette différence résulte de la dilution supplémentaire nécessaire pour homogénéiser des échantillons de tomates dans GPB.

En plus d'être une matrice alimentaire solide, les tomates sont un type d'échantillon remarquable où le pH et la force ionique de réglage, obtenu par l'addition de 10 x tampon de neutralisation, est essentiel à la réussite du test. Figure 5B illustre les réponses de test lors du test de tomates avec ou sans inclusion d' le tampon 10x de neutralisation. Le défaut d'ajouter les résultats de tampon 10x neutralisation dans une mauvaise récupération de la BoNT / A à partir des échantillons et est démontrée par un taux d'émission constant pour toutes les concentrations de BoNT / A testées. L'addition du tampon de neutralisation 10x, cependant, résultats de détection sensible de la toxine.

Protéases non spécifiques contenues dans des matrices complexes peuvent conduire à des faux positifs s'il n'est pas traité depuis protéases autres que la BoNT peuvent cliver le A / E journaliste. Des protéases non spécifiques peuvent être endogène à l'échantillon d'aliment ou introduit lors de l'utilisation des préparations non purifiée BoNT tels que Clostridium surnageants de culture. Lavage à l'bourrelet se retirer proteases plus non spécifiques, mais l'addition d'inhibiteurs de la protéase dans le tampon de réaction est critique La figure 6 montre l'activité de la protéase non spécifique trouvé dans Clostridium BoNT / A surnageants de culture en utilisant un rapporteur A / E modifié, BoTest KO (KO reporter. ). Le reporter KO est le même que le reporter A / E, à l'exception que la BoNT / A site de clivage a été mutée de telle sorte qu'elle n'est plus clivée par BoNT / A. Par conséquent, n'importe quel journaliste clivage observé des résultats de l'activité de la protéase non spécifique. Les niveaux élevés de KO reporter articleAvage indique le surnageant de culture contient un niveau élevé d'activité de protease, mais cette activité est effectivement annulée par l'ajout d'inhibiteurs de protéase.

Les données d'échantillons démontrent l'utilité du protocole de haut débit BoNT / A la détection dans des tampons simples et les matrices alimentaires. Certains aliments peuvent nécessiter des petits ajustements de dosage, mais le protocole décrit devraient donner de bons résultats avec la plupart des types d'aliments.

Figure 1
Figure 1. Suggéré disposition de la plaque. Échantillons sont limités aux intérieurs de 60 puits de la plaque pour éviter d'éventuels effets de bord. Des exemples de courbes standards inconnus ou peuvent être ajoutés comme on le souhaite. Tous les puits non utilisés doivent être remplis avec 100 pi d'eau pendant journaliste incubation. Click ici pour agrandir l'image.

Figure 2
Figure 2. Vue d'ensemble schématique du protocole décrit. Chaque étape majeure dans le protocole est indiqué par une case et aligné à côté d'un calendrier de dosage estimée (pas à l'échelle). Des échantillons de non alimentaires ne nécessitent pas de traitement de l'échantillon et ainsi entrent dans le protocole en aval d'échantillons d'aliments. La zone en pointillés autour de génération de série de dilution pour les inconnues indique que cela est une option, mais recommandé, étape. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 3
Figure 3. Détection de BoNT / A holotoxine dans du PBS en utilisant le protocole décrit.Purifié BoNT / A holotoxine a été ajouté dans du PBS et testées selon le protocole décrit avec une concentration supérieure de BoNT / A de 1 nM. Tous les échantillons ont été testés en triple exemplaire et les barres d'erreur représentent l'écart type de la moyenne. Puissance signalé, est basé sur des tests de bio-essai sur souris par le fabricant de la toxine. Le rapport d'émission (le ratio de l'émission à 526 nm à 470 nm après excitation à 434 nm) de la courbe standard a été mesurée après 2, 4 et 24 heures d'incubation avec A / E reporter et tracée en fonction de la BoNT / A la concentration . Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 4
Figure 4. Quantification de produit médicamenteux BOTOX selon le protocole décrit. Un seul flacon de 100 UI de produit pharmaceutique de BOTOX lyophilisé était resuspe DEMVSO dans 220 ul saline à 0,9%, dilué en série, et testés comme inconnus contre une courbe standard faite dans du PBS en utilisant purifiée BoNT / Holotoxine. Les échantillons ont été testés selon le protocole décrit, sauf que des échantillons de 50 pi ont été testées sans 10x tampon de liaison en double exemplaire. La courbe d'étalonnage a été calculée en ajustant le rapport d'émission des échantillons de la courbe standard pour l'équation sigmoïde dose-réponse de pente variable et est tracée en fonction de la BoNT / A de concentration. Chaque échantillon inconnu est représenté son intersection avec la courbe standard après une heure d'incubation 24 avec le journaliste A / E. Les concentrations des échantillons inconnus qui tombent dans la plage linéaire (zone ombrée en tirets) ont été interpolées à partir de la courbe étalon. L'étiquette de chaque inconnue BOTOX est le nombre d'unités présentes dans l'échantillon sur la base de la puissance marqué. Les barres d'erreur représentent l'écart-type de la moyenne.t = "_blank"> Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 5
Figure 5. Récupération de BoNT / A-dopés lait 2% et les tests de tomates fraîches en utilisant le protocole décrit. Échantillons de lait 2% et tomates fraîches ont été inoculés avec purifiée BoNT / A complexe et testé selon le protocole décrit. Tous les échantillons ont été testés en triple exemplaire et les barres d'erreur représentent l'écart type de la moyenne. (A) Le taux d'émission du lait à 2% et de tomates fraîches courbes d'étalonnage ont été mesurées suivant 2, 4 et 24 heures d'incubation avec A / E reporter et tracée en fonction de la BoNT / A puissance. (B) Le défaut d'inclure la mémoire tampon 10x de neutralisation pendant les résultats des tests de tomate dans l'échec du test. Des échantillons de tomates fraîches ont été testés selon le protocole décrit avec ou sans addition de 10x Neutretampon tion. Les données indiquées sont pour le point de temps de 4 h. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 6
Les inhibiteurs de la figure 6. Protéase sont requises lors de l'essai des matrices complexes. Clostridium BoNT / A (souche Hall A) du surnageant de culture a été dilué en série dans du PBS et testée selon le protocole décrit, avec ou sans inhibiteurs de protéase ajoutée au tampon de réaction et à la fois avec la A / E et KO journalistes. Le rapport d'émission a été mesurée après 24 heures d'incubation à la fois avec la A / E ou reporters KO et tracée en fonction de la BoNT / A puissance. Clivage significatif de la journaliste KO a été vu sans addition d'inhibiteurs de la protéase, mais a été annulée par leur inclusion. Tous les échantillons ont été testés en triple exemplaire et l'erreur bars représentent l'écart type de la moyenne. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Tampon Composition Température de stockage Stabilité Remarques
10x Matrice Binding Buffer 500 mM de HEPES-NaOH, pH 7,1, 250 mM de NaCl, 1% de Tween-20, 5% de caséine, 0,05% de NaN3 -20 Ou -80 ° C Stable pour un minimum de cinq jours à 4 ° C après décongélation Livré avec kit BoTest matrice A Détection botulique
10x matrice tampon de lavage Phosphates 119 mM, pH 7,4, 1,370 mM de NaCl, 27 mM de KCl, 1% de Tween-20 -20 Ou -80 ° C Stable pour un minimum de cinq jours à 4 ° C après décongélation Livré avec kit BoTest matrice A Détection botulique
10x neutralisation tampon 1 M de HEPES-NaOH, pH 8,0, NaCl 1 M 4 ° C Stable jusqu'à six mois à 4 ° C
10x BoTest Reaction Buffer 500 mM de HEPES-NaOH, pH 7,1, 50 mM de NaCl, 1% de Tween-20, 100 uM de ZnCl2 -20 Ou -80 ° C Stable pour un minimum de cinq jours à 4 ° C après décongélation Livré avec kit BoTest matrice A Détection botulique
BoTest A / E Reporter 20 uM dans 50 mM de HEPES-NaOH, 10 mM de NaCl, 15% de glycérol -80 ° C Stocker dans de petites fractions. Stable pour un minimum de cinq jours à 4 ° C lors de la décongélation. Livré avec kit BoTest matrice A Détection botulique
Gélatine de tampon phosphate (GPB) 33,3 mM de NaH 2 PO 4, pH 6,2, 2 g / l de gélatine 4 ° C Stable pendant 1 mois à 4 ° C
200x dithiothréitol (DTT) 1 M DTT -20 ° C Stable jusqu'à 6 mois à -20 ° C Faire et ranger les petits (100 pi) aliquotes
1x PBS-T Phosphates 11,9 mM, pH 7,4, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 0,1% de Tween-20 4 ° C Stable pendant 1 mois à 4 ° C Peut être fait en utilisant 10x PBS de Fisher (BP399-1)
Matrice A Perles (IP-A Perles) Les billes magnétiques conjuguées de manière covalente à du poulet anti-BoNT / A anticorps dans du PBS. 0,1% de Tween-20, 0,05% d'azoture de sodium, 0,25% de caséine et 50% de glycérol -20 ° C Stables pendant au moins cinq jours à 4 ° C lors de l'enlèvement de -20 ° C. NE PAS congeler à -80 ° C

Tableau 1. Tampons nécessaires pour le protocole décrit. L'neutralisation 10xTampon est seulement pour (denrées alimentaires) échantillons très complexes et ne peut pas être nécessaire en fonction de la nature des échantillons étant analysés.

Nom du matériel / équipement Entreprise Numéro de catalogue Commentaires / Description
BoTest matrice A Kit de détection de neurotoxine botulique BioSentinel A1015 kits de détection des BoNT / B et F sont également disponibles.
Varioskan le lecteur Flash de microplaques à fluorescence Thermo-Fisher Scientific 5250040 La plupart des unités-ou monochromateur à filtres 434 nm avec excitation à 470 nm et une capacité de 526 nm d'émission peuvent être utilisées.
96 puits perle magnétique Séparation Plate V & P scientifique VP771H D'autres plaques magnétiques peuvent être utilisées, mais la plaque doivent être conçus pour séparer le bEADS sur le côté du puits.
Plaque magnétique laveur de perles-Compatible BioTek ELx405 VSRM En option, uniquement nécessaire pour le lavage automatique de la plaque. D'autres laveurs de plaques de perles compatible magnétiques peuvent aussi être utilisés, mais doivent être testés avant utilisation.
Microtubes Divers N / A En option, uniquement requis pour les échantillons nécessitant centrifugation.
Mélangeur de plaque MixMate Eppendorf 22674200
Orbital Shaker Divers N / A Employée à la température ambiante ou à 25 ° C Si le contrôle de la température est disponible
Sans EDTA-inhibiteur de la protéase Comprimés Roche 4693132001 Seulement nécessaire pour la nourriture ou des essais environnementaux. Les inhibiteurs de protéase doivent être sans EDTA.
BoNT / A Metabiologics N / A En option, uniquement à des fins de normalisation et de quantification
Noir, plaques à 96 puits à fond plat NUNC 237105 Elles ne doivent pas être traités
96 puits Plaque Sealing Tape Thermo Scientific 15036

Tableau 2. Matériaux et équipements requis pour le protocole décrit. Certains matériaux et équipements sont en option ou peuvent être substitués en fonction de l'équipement disponible. Tests d'aptitude et d'optimisation supplémentaires peuvent être nécessaires si l'aide d'équipement de remplacement.

</ Tr>
Nom échantillon Volume toxines Volume de diluant [BoNT / A] (mLD 50 / ml) ou (mLD 50 / g d'aliment) log [BoNT / A] (mLD 50 / ml) ou (mLD 50 / g d'aliment) D1 1200 pi Stock N / A 30000 4.48
D2 300 ul D1 600 pl 10000 4
D3 90 ul D1 810 pi 3000 3.48
D4 90 ul D2 810 pi 1000 3
D5 90 ul D3 810 pi 300 2.48
D6 90 pi D4 810 pi 100 2
D7 90 ul D5 810 pi 30 1,48
D8 90 pi D6 810 pi 10 1
D9 N / A 1400 pi N / A N / A

Tableau 3:. Tableau de dilution pour les échantillons de courbes standard Ce tableau génère une courbe standard dans des dilutions demi-logarithmiques de plus de 3,5 ordres de grandeur. Échantillon blanc Pas assez BoNT (D9) est généré pour exécuter un n = 6. Des dilutions supplémentaires peuvent être ajoutés si on le souhaite.

<td> 0
Nom du programme Variable Valeur Commentaires
Premier Flacon de réactif A
Premier Volume 400
Premier Débit 7
Faire tremper Après le premier? N
Matrice de lavage Flacon de réactif A Le nombre de lavages peut être augmentée si l'activité de la protéase résiduelle est observée.
Méthode
4
Faire tremper / secousse Y
Faire tremper Durée 180
Agiter Avant tremper? N
Premier Après tremper? N
Disp
Distribuer le volume 300
Distribuer Débit 5
Distribuer Hauteur 130
Hor. Distribuer Pos. 0
Aspirer désactiver? Y
Bas Laver d'abord? N
Premier avant le début? N
Aspir
Hauteur d'aspiration 40
Hor. Aspirer Pos. 0
Aspiration taux 5
Aspiration de retard
Transversalement Aspirer? N
Finale aspiration? Y
Finale aspiration retard 0
Matrice tremper Faire tremper Durée 300 Durée de trempage accrue peut augmenter la récupération de billes à partir d'aliments plus visqueux.
Agiter Avant tremper? N
Maître de lavage Matrice tremper Il s'agit d'un programme «Lien» pour lancer la matrice tremper et programmes Matrice Laver ensemble.
Matrice de lavage

Tableau 4. Magnétique automatisés paramètres du programme plaque de lave perles compatible. Les programmes suivants supposent que le laveur de plaques est équipé d'un aimant qui tire des billes à côté des puits et que le tampon du module de commutation est configuré de telle sorte que le tampon de lavage 1x ( PBS-t) est attaché à la soupape A. Ces programmes sont spécifiques à la BioTek ELx405. Reportez-vous au manuel pour les instructions de programmation. Autres bille magnétique compatible laveurs de plaques automatique ou distributeurs à vide peut être utilisé, mais le test sera nécessaire pour définir les paramètres qui maximisent l'efficacité de lavage et de minimiser la perte de billes pendant le lavage. Essai initial de la récupération de talon suivant est recommandé de laver de la vaisselle, indépendamment de la plaque spécifique utilisé.

<td> LOD
matrice alimentaire Métrique 2 heures 4 heures 24 h
mLD 50 / g d'aliment mLD 50 / puits mLD 50 / g d'aliment mLD 50 / puits mLD 50 / g d'aliment mLD 50 / puits
Lait 300 58 100 19 30 6
LQ 1000 193 300 58 100 19
CE 50 2404 464 590 114 92 18
Tomates fraîches LOD 1000 91 300 27 30 3
LQ 1000 91 1000 91 100 9
CE 50 7561 687 1932 176 229 21

Tableau 5. Limites de détection (LOD), limites de quantification (LQ) et la demi-maximal concentration efficace (CE 50) pour le lait 2% et les tests de tomate fraîche de la figure 2A. L'EC 50 est dérivé de l'ajustement de la courbe dose-réponse sigmoïde tandis que la LD et la LQ sont définis comme étant le point le plus bas de données de concentration qui tombe soit 3 ou 10 écarts-types sous les pas de contrôle de neurotoxines botuliques (n = 6), respectivement. Les données sont présentées en tant mLD 50 / g d'aliment et un total de 50 s mLD testés par puits dans un volume d'échantillon de 200 ul.

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Discussion

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Ce protocole décrit les procédures permettant de quantifier BoNT / A complexe, holotoxine, ou Clostridium surnageant de culture dans des matrices complexes. Le protocole est le même, cependant, lors de l'essai d'autres sérotypes BoNT (par exemple de BoNT / B, E et F) avec leurs dosages matricielles respectives 56,60, même si la sensibilité dosage variera selon les sérotypes et dosages. Ce protocole ne tient pas compte de tous les types d'échantillon possible et certaines modifications peuvent être nécessaires en fonction de la composition de l'échantillon spécifique et de l'application souhaitée. Les matrices peuvent inclure des échantillons d'aliments (par exemple des tests de provocation alimentaire) ou des tampons d'excipient pharmaceutique (essais de médicament à base de BoNT par exemple). Non alimentaires complexes (par exemple, un tissu animal ou l'environnement) liquide et des échantillons solides doivent être traités comme des échantillons d'aliments. Ce protocole utilise des volumes de 200 pl / puits échantillon mais aussi peu que 50 pl / puits peut être testé avec un ajustement correspondant au volume de 10x binding tampon. Des échantillons plus petits que 50 ul doivent être dilués avec du PBS GPB ou ≥ à 50 pi avant l'essai.

La nature très variable des denrées alimentaires représente un défi particulier pour la détection et la quantification de la BoNT dans les aliments. pH de l'échantillon, la viscosité, la force ionique et la présence de matières particulaires peuvent tous avoir une incidence sur l'activité de la toxine à l'intérieur de la matrice alimentaire et nécessiter que la toxine être isolé de la nourriture pour exacts, la quantification in vitro. De nombreux aliments ou préparations de toxine contiennent également des protéases endogènes qui doivent être éliminés ou inactivés lors de l'utilisation journalistes à base de protéines pour s'assurer que seule l'activité de BoNT-spécifique protéase est mesurée. Même matrices simples et bien définies, tampons tels que des tampons d'excipients pharmaceutiques, peuvent contenir des composés qui interfèrent avec l'activité de BoNT qui doit être enlevé avant la quantification 35,56-59,61. Immunoprécipitation offre un moyen rapide, hautement spécifique du sérotype BoNT puriméthode de notification prévue mais nécessite des anticorps de haute affinité pour isoler les faibles concentrations de toxines présents dans les aliments "monde réel", de l'environnement, et des échantillons pharmaceutiques.

Le protocole décrit purifie la toxine en utilisant des billes paramagnétiques revêtues d'anticorps anti-BoNT / A dirigées vers le domaine récepteur de la chaîne lourde de la toxine de la BoNT / A holotoxine du noyau 56. Espèces de Clostridium, cependant, produisent naturellement des complexes de toxine consistant en l'holotoxine du noyau en association avec PAN 62-64. Les PAN protéger la toxine de l'attaque de la protéase dans le tractus gastro-intestinal et sont censés faciliter le transport de la toxine à travers l'épithélium intestin 63,65. Les PAN inhibent la liaison des anticorps IP-Un cordon anti-BoNT / A à l'holotoxine de base (données non présentées). Cette inhibition est soulagée par l'augmentation du pH de l'échantillon ci-dessus ~ 6,25, ce qui provoque l'/ Une toxine efficace complexe à se dissocier en holotoxine et PAN et permettant BoNTliaison à l'IP-A 66 perles. Pour cette raison, l'ajustement du pH de l'échantillon ci-dessus à 6,5 est critique pour le succès de l'essai (figure 5B). Le 10x tampon de liaison utilisé dans le protocole contient un agent tampon pour aider à élever le pH à des conditions de test standard. Cependant, de nombreux aliments acides peuvent submerger la capacité tampon de la mémoire tampon Binding. Le tampon supplémentaire de neutralisation 10x augmente considérablement la capacité échantillon de tampon et devrait neutraliser la majorité des matrices alimentaires.

Un autre paramètre important pour le dosage est de force ionique échantillon. Clarification des échantillons par centrifugation est nécessaire pour le lavage efficace de talon et la récupération après immunoprécipitation. Test avec des tomates fraîches a révélé qu'aucun BoNT / Une reprise a été observée lorsque les échantillons ont été traités simplement et centrifugés. Nous émettons l'hypothèse que la BoNT / A peut associer à la chair de tomate amenant à culot lors de la centrifugation et de devenir absent de lasurnageant testé. Nous avons constaté que l'augmentation de la force ionique ou, de manière plus significative, en neutralisant le pH interactions limitées entre BoNT et la matrice ce qui améliore la récupération de la toxine (Figure 5B). Bien que non requis pour la récupération de BoNT, il est prévu, bien que non montré, que des concentrations en sel plus élevées vont également augmenter la stringence de l'immuno-précipitation et entraîner une récupération de protéine non spécifique inférieure, en particulier dans les aliments à faible teneur en sel.

pH de l'échantillon et l'ajustement de la force ionique dans le protocole est réalisée par l'addition de 10 x tampon de neutralisation et doivent être compatibles avec une large gamme d'aliments. Alors que le tampon 10x neutralisation a une capacité tampon élevé, certains aliments très acides peuvent nécessiter un ajustement supplémentaire du pH. Test de pH de l'échantillon après addition de tampon est recommandée si la performance du test pauvres est observée et le volume de l'échantillon le permet. L'ajustement du pH supplémentaire peut être obtenue par l'addition de svolumes de centre commercial de 1 M HEPES pH 8, si nécessaire. Le NaCl supplémentaire introduite par le tampon de neutralisation 10x devrait être acceptable pour tous, mais les aliments les plus salés, mais 10x tampon de neutralisation peut être remplacé par une M HEPES pH 8 si mauvais résultats sont observés avec un produit alimentaire donné. Aucune différence significative n'a été observée lors de l'essai le protocole décrit à des concentrations de NaCl à 1,2 M dans du PBS.

Bien que ce protocole est applicable à la plupart des échantillons, les aliments à des extrêmes de pH, de force ionique, et / ou le contenu de protease peuvent pas donné de bons résultats avec le dosage. Certains aliments peuvent également rester trop visqueux suite à l'ajout de GPB, résultant dans la récupération pauvres de perles. De diluer les échantillons avec un simple tampon tels que PBS peut améliorer les résultats. L'augmentation du nombre de lavages ou laver rigueur (par augmentation de la concentration de NaCl) et l'augmentation de la concentration d'inhibiteurs de protéases sans EDTA peut également améliorer les résultats si non spécifique protéase contaion est observée. Instrument propreté est également très important lors de l'utilisation de lavage automatique des plaques. Contamination des buses de plomberie et d'injection avec protéases (par exemple la trypsine) d'autres tests de laboratoire peut conduire à l'introduction involontaire de protéases pendant le test. Un nettoyage en profondeur de la rondelle de la plaque selon le manuel de l'utilisateur du fabricant est recommandé avant d'exécuter le test.

Les essais de la matrice BoTest sont les premiers commercialisés, les tests basés sur les activités de détection et de quantification BoNT dans des matrices complexes. Par rapport à la bio-essai sur souris standard, le test est rapide, moins coûteux, et permet de tester à haut débit sans la nécessité pour les établissements spécialisés ou des préoccupations éthiques concernant l'utilisation des animaux 56. Autres vitro de neurotoxines botuliques méthodes de détection en ont été décrites mais n'ont pas été montré pour être compatible avec les matrices d'échantillons complexes, nécessitent un équipement spécialisé, ou ne sont pas commercialement disple 35,42-44,46-55. Les tests sont également des analyses basées sur les activités qui mesurent l'activité endoprotéase de toxine, alors que dosage immunoenzymatique de enzyme-linked traditionnelle (ELISA) techniques ne font que rapporter la masse de la toxine. Des tests ELISA basés sur les activités ont été décrites précédemment, mais ces essais n'ont pas été démontrées à travailler avec des matrices alimentaires et n'englobent pas la purification de la toxine à partir de la matrice de l'échantillon 41. Importante sous-estimation de la toxicité d'échantillons complexes peut se produire si la toxine n'est pas purifié à partir de l'échantillon puisque les composés de la matrice interfèrent souvent avec l'activité de BoNT 35,56-59.

Une fois le protocole est maîtrisée, des modifications peuvent être apportées pour accroître les volumes d'échantillons et améliorer la sensibilité de l'échantillon. Par exemple, la liaison de la toxine à des billes peut être réalisée dans des échantillons en vrac, de plus grandes (par exemple 10 ml ou plus) avant la collecte par centrifugation. Ces billes peuvent ensuite être ajoutés à une plaque de 96 puits et analysés suivant la décrired protocole. Augmente la sensibilité supérieure à un journal ont été observées avec l'augmentation taille de l'échantillon 56. Ainsi, le protocole décrit peut être utilisé avec de plus grands volumes d'échantillons pour détecter même des quantités infimes de BoNT contenues dans les échantillons qui peuvent passer inaperçus par le bio-essai sur souris.

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Disclosures

FM Dunning, TM Piazza, F. Zeïtoun, et WC Tucker sont des employés ou des propriétaires de BioSentinel Inc. BioSentinel actuellement fabrique et a commercialisé certains des réactifs présentés dans ce rapport.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier H. Olivares et D. Ruge pour des discussions et des conseils précieux. Cette recherche a été financée en partie par une bourse NSF SBIR (PII-1127245 à BioSentinel Inc.) et un ministère de la Défense contrat (W81XWH-07-2-0045 de bien BioSentinel Inc.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit BioSentinel A1015 Detection kits for BoNT/B and F are also available.
Varioskan Flash fluorescence microplate reader Thermo Fisher Scientific 5250040 Most monochromator- or filter-based units with 434 nm excitation and 470 nm and 526 nm emission capability can be used.
96-well Magnetic Bead Separation Plate V&P Scientific VP771H Other magnetic plates may be used, but the plate should be designed to separate the beads to the side of the well.
Magnetic Bead-Compatible Plate Washer BioTek ELx405 VSRM Optional, only required for automated plate washing.  Other magnetic bead-compatible plate washers may also be used, but should be tested before use.
Microcentrifuge Optional, only required for samples needing centrifugation.
MixMate plate mixer Eppendorf 22674200
Orbital Shaker Used at room temperature or at 25 °C If temperature control is available
EDTA-free Protease Inhibitor Tablets Roche 4693132001 Only required for food or environmental testing. Protease inhibitors must be EDTA-free.
BoNT/A Metabiologics Optional, only required for standardization and quantification purposes
Black, Flat-bottomed 96-well Plates NUNC 237105 Plates should not be treated
96-well Plate Sealing Tape Thermo Fisher Scientific 15036

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L&#39;isolement et la quantification de neurotoxine botulique de matrices complexes utilisant les BoTest matrice dosages
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Dunning, F. M., Piazza, T. M., Zeytin, F. N., Tucker, W. C. Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays. J. Vis. Exp. (85), e51170, doi:10.3791/51170 (2014).More

Dunning, F. M., Piazza, T. M., Zeytin, F. N., Tucker, W. C. Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays. J. Vis. Exp. (85), e51170, doi:10.3791/51170 (2014).

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