Isolering og kvantifisering av Botulinum Neurotoxin fra komplekse matriser med bruk av BoTest Matrix Analyser

Summary

Den BoTest Matrix botulinumnevrotoksin (Bont) deteksjon analyser raskt rense og kvantifisere Bont fra et spekter av prøven matriser. Her presenterer vi en protokoll for påvisning og kvantifisering av Bont fra både faste og flytende matriser og demonstrere analysen med BOTOX, tomater og melk.

Abstract

Nøyaktig påvisning og kvantifisering av botulinum neurotoxin (Bont) i komplekse matriser er nødvendig for farmasøytiske, miljø-, og mat sample testing. Rapid Bont testing av matvarer er nødvendig under utbruddsetterforskning, pasientens diagnose, og mattrygghet testing mens nøyaktig potens testing er nødvendig for Bont-basert medikament produkt produksjon og pasientsikkerhet. Den mye brukt musen bioassay for Bont testing er svært følsom, men mangler presisjon og gjennomstrømning som trengs for rask og rutinemessig Bont testing. Videre har bioassay bruk av dyr førte til samtaler av narkotika produkt regulatoriske myndigheter og dyrerettighetstalsmenn i USA og i utlandet for å erstatte musen bioassay for Bont testing. Flere in vitro erstatningsanalyser har blitt utviklet som fungerer godt med renset bont i enkle buffere, men de fleste har ikke vist seg å kunne anvendes til testing i svært komplekse matrikser. Her er en protokoll for påvisning avBont i komplekse matriser ved hjelp av BoTest Matrix analysene er presentert. Analysen består av tre deler: Den første del omfatter fremstilling av prøver for testing, er den andre delen en immunoutfelling trinn ved hjelp av anti-bont antistoff-belagte paramagnetiske kuler for å rense bont fra grunnmassen, og den tredje delen kvantifiserer det isolerte bont største proteolytiske aktivitet ved hjelp av en fluorogene reporter. Protokollen er skrevet for høy gjennomstrømning testing i 96-brønners plater ved anvendelse av både flytende og faste matrikser og krever omtrent 2 timer for manuell forberedelse med totale analysetider av 4 til 26 timer, avhengig av prøvetype, toksin belastning, og ønsket følsomhet. Dataene er presentert for bont / A-testing med fosfat-bufret saltvann, et legemiddel, kultur supernatant, 2% melk, og ferske tomater og omfatter diskusjon av kritiske parametre for assay suksess.

Introduction

Botulinum nervegifter (BoNTs) er de dødeligste stoffer kjent, med intravenøse menneskelige dødelige doser anslått til 1-3 ng / kg ^1,2. Syv strukturelt lignende serotyper av bont, merket A til og med G, finnes, som hver består av en tung kjede domenet er ansvarlig for cellebinding, binding og translokasjon inn i cytosol og en lett kjede som koder for et sink endopeptidase ^3-5. Den utsøkte toksisitet av Bont skyldes delvis sin spesifikk binding og oppføring i motoriske nerveceller ved nevromuskulære krysset ^seks. Inne i nervecellen, den lette kjede endopeptidase spesifikt spalter ett eller flere av de løselige N-etylmaleimid følsomt faktor festeproteinreseptoren (SNARE) proteiner som kreves for vesikkelfusjon, inhiberende nevrotransmitter-frigjøring, og som fører til slapp paralyse ^7-14. Kjent som sykdommen "botulisme," lammelse av membranen og interkostalrom muskler ved Bont slutt resulterer irespirasjonssvikt og død hvis ikke tidlig diagnose og behandling er mottatt.

Menneskelig matbåren botulisme er oftest assosiert med Bont serotype A, B, E og F (Bont / A, Bont / B, etc.) og vanligvis resultater fra inntak av forurenset mat ^15,16, selv om, flere tilfeller av sårbotulisme ble rapportert blant sprøytemisbrukere ^17,18. I USA, spedbarn botulisme som følge av inntak av Clostridium sporer av barn under ett er den vanligste formen for botulisme ^19-21. Imidlertid ble det rapportert om matbårne Bont utbrudd som følge av uriktig hjem hermetisering og matfag i både USA og i utlandet. Mellom 2000-2009 ble det rapportert om minst 338 tilfeller av matbåren botulisme verdensbasis, inkludert seks omkomne ^22. Evnen til raskt og følsomt oppdage matbårne botulisme utbrudd er en kritisk indikasjon som kan hjelpe tidlig diagnose ^23,24. Videre vil deteksjonsmetoder som tillater kostnadseffektiv og rutine mat testing føre til økt matsikkerhet.

Bont sin neuronal spesifisitet og lang biologisk halveringstid gjør det en potent terapeutisk også. I USA, er Bont-baserte legemidler godkjent av Food and Drug Administration for behandling av kosmetiske forhold og nevromuskulære relaterte lidelser inkludert glabellalinjer, cervikal dystoni, migrene, overaktiv blære, og skjeling. Mange "off-label" applikasjoner er dokumentert, inkludert høydose behandlinger for alvorlig muskel dysfunksjon ^25-28. Nøyaktig kvantifisering toksin er kritisk for riktig dosering, som underdosering kan føre til ineffektiv behandling mens dosering setter pasienter med risiko for potensielt skadelige bivirkninger. Dessverre er ingen standardisert potens analyseprotokollen delt på tvers av produsenter, noe som resulterer i enhet definisjonsforskjeller mellom Bont-basert medikament proCTS ^29-31.

Standarden test for Bont er musen bioassay der Bont-holdige prøvene er injisert intraperitonealt i mus og antallet dødsfall registrert over 1-7 dager ^16,32,33. Musen bioassay er svært følsom med grensene for påvisning (LOD) på 5-10 pg Bont / A ^34, men etiske bekymringer over dyr bruk, de høye kostnadene ved opplæring av personell og opprettholde dyrefasiliteter, lange analyse ganger, og mangel på standardiserte protokoller resulterte i samtaler for å utvikle standardiserte, dyr fritt Bont testing og kvantifisering metoder ^35-39. Nylig ble flere alternative Bont kvantifisering metoder utviklet som tilbyr musen eller nær-mus bioassay følsomhet ^40-49. Disse metodene vanligvis bruker fluorescens, masse-spektrometri, eller immunologiske metoder og gir analysetider betydelig kortere enn mus bioassay uten animalsk bruk. Mass-spektrometri tilnærminger kombinert med immunologisk techniqdier ble vist å oppdage og kvantifisere Bont finnes i mat og andre komplekse prøver, men krav personell opplæring og spesialisert utstyr grense disse analysene ^50-55. De fleste andre alternative analyser er ikke aktuelt lett til komplekse sample testing eller mangler kapasiteten som kreves for rutine Bont testing. Den svært variabel karakter av mat prøveviskositeten, pH, saltinnhold, og matrise bestanddeler presenterer en spesielt vanskelig utfordring når du prøver å utvikle in vitro analysemetoder med følsomhet for å matche den ekstreme styrken på Bont. Videre, til og med enkle og forholdsvis godartede buffersystemer, slik som de som oppstår ved resuspensjon av bont-baserte legemidler, inneholder salt, albumin, og sukker stabilisatorer (dvs. hjelpestoffer) som i vesentlig grad påvirker in vitro potens bont ^56.. Toksin rensing er nødvendig for nøyaktig aktivitet testing av alle, men den enkleste av prøvene ^56-59.

DenBoTest Matrix analysene ble designet for rask, høy gjennomstrømning, og konsekvent kvantifisering av Bont fra svært komplekse prøver ved hjelp av utstyr som vanligvis finnes i forskningslaboratorier ^56,60. Disse analysene bruker paramagnetiske perler kovalent knyttet til serotype-spesifikke anti-Bont antistoffer til å binde og beslaglegge Bont ut av en prøve, og deretter fjerne forstyrrende matrise forbindelser ved vasking. Etter vasking blir bundet bont proteolytisk aktivitet så kvantifisert i en optimal reaksjonsbuffer ved hjelp av et reporter kompatibel med bont serotype som testes. Disse journalister er fluorogenic proteiner bestående av en N-terminal cyan fluorescerende protein (CFP) del og en C-terminal gul fluoriserende protein derivat (Venus) enheten bundet av en Bont substrat, SNAP25 rester 141-206 eller synaptobrevin rester 33-94 utgjør den BoTest A / E eller B / D / F / G journalister, henholdsvis ^45. Reporter spalting av Bont er overvåket ved hjelp av Förster resonans energioverføring (FRET). Når than reporter er intakt, eksitasjon av CFP resulterer i FRET til Venus, leskende CFP utslipp og spennende Venus utslipp. Spalting av reporter ved Bont hindrer FRET, som fører til en økning i CFP utslipp og reduksjon i Venus utslipp. Bont aktivitet kan deretter bli målt kvantitativt ved å bruke forholdet mellom CFP og Venus utslipp. LOD under 3 pg er mulig fra et bredt utvalg av matvarer ved hjelp av en high-throughput 96-brønn plate-format ^56. Økt følsomhet kan oppnås ved bruk av større prøvevolumer, siden analysen tillater konsentrasjonen av toksinet på perleoverflaten.

De BoTest Matrix-analyser for BoNTs A, B, E og F ble utviklet og testet med mat, farmasøytisk, og miljøprøver ^56,60. Her beskriver vi prosedyrer for å gjennomføre disse analysene for påvisning av Bont i lav kompleksitet (f.eks farmasøytisk, Bont i buffer) og høy kompleksitet (for eksempel mat, miljø) prøver. Spesifikke bearbeidingsmetoderfor flere prøvetyper er omtalt i denne protokollen, og prøvetyper som ikke er beskrevet her kan vanligvis tilpasses ved hjelp av en kombinasjon av de presenterte metoder. Protokollen ble utviklet og testet med Bont / A, men er tilpasningsdyktig til andre Bont serotyper bruke sine respektive analysene som demonstrert andre steder ^56,60.

Protocol

En. Utarbeidelse av analysereagensene Tin 200x ditiotreitol (DTT), 10x Matrix bindende buffer (10 x bindingsbuffer heretter), 10x Nøytralisering buffer (næringsmiddel-eller pH ubalanserte prøvene bare), og 10x BoTest reaksjonsbuffer (10x reaksjonsbuffer i det følgende) ved romtemperatur (RT) i 15 min eller til det er helt tint. Se tabell 1 for en liste over buffere og reagenser som brukes i denne protokollen. Se tabell 2 for en liste over materialer og utstyr som kreves f…

Representative Results

Et diagram som oppsummerer fremgangsmåten i den beskrevne protokoll er vist i figur 2.. Analysen krever mellom 4-26 timer å fullføre, avhengig av prøvetype og ønsket analysen følsomhet, men bare ~ 2 timers hands-on tid. Analysen utføres i 96-brønners plater, og, avhengig av hvilken type av tester som skal utføres, kan triplo testing av opptil 20 prøver inkludert standarder pr plate. Fig. 3 viser representative resultater ved å bruke assay-bont / A…

Discussion

Denne protokollen beskriver prosedyrer for kvantifisering Bont / En kompleks, holotoxin, eller Clostridium kultur supernatant i komplekse matriser. Protokollen er det samme, men, når testing andre bont serotyper (f.eks bont / B, E og F) med de respektive matrise-analyser ^56,60, selv om måle-følsomheten vil variere mellom serotyper og analyser. Denne protokollen ikke står for hver type prøve mulig og kan kreves noen modifikasjoner avhengig av den spesifikke utvalget sammensetning og øns…

Materials

BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit	BioSentinel	A1015	Detection kits for BoNT/B and F are also available.
Varioskan Flash fluorescence microplate reader	Thermo-Fisher Scientific	5250040	Most monochromator- or filter-based units with 434 nm excitation and 470 and 526 nm emission capability can be used.
96-well Magnetic Bead Separation Plate	V&P Scientific	VP771H	Other magnetic plates may be used, but the plate should be designed to separate the beads to the side of the well.
Magnetic Bead-Compatible Plate Washer	BioTek	ELx405 VSRM	Optional, only required for automated plate washing.  Other magnetic bead-compatible plate washers may also be used, but should be tested before use.
Microcentrifuge	Various	N/A	Optional, only required for samples needing centrifugation.
MixMate plate mixer	Eppendorf	22674200
Orbital Shaker	Various	N/A	Used at room temperature or at 25 °C If temperature control is available
EDTA-free Protease Inhibitor Tablets	Roche	4693132001	Only required for food or environmental testing.  Protease inhibitors must be EDTA-free.
BoNT/A	Metabiologics	N/A	Optional, only required for standardization and quantification purposes
Black, Flat-bottomed 96-well Plates	NUNC	237105	Plates should not be treated
96-well Plate Sealing Tape	Thermo Scientific	15036