Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Isolering og kvantifisering av Botulinum Neurotoxin fra komplekse matriser med bruk av BoTest Matrix Analyser

doi: 10.3791/51170 Published: March 3, 2014

Summary

Den BoTest Matrix botulinumnevrotoksin (Bont) deteksjon analyser raskt rense og kvantifisere Bont fra et spekter av prøven matriser. Her presenterer vi en protokoll for påvisning og kvantifisering av Bont fra både faste og flytende matriser og demonstrere analysen med BOTOX, tomater og melk.

Abstract

Nøyaktig påvisning og kvantifisering av botulinum neurotoxin (Bont) i komplekse matriser er nødvendig for farmasøytiske, miljø-, og mat sample testing. Rapid Bont testing av matvarer er nødvendig under utbruddsetterforskning, pasientens diagnose, og mattrygghet testing mens nøyaktig potens testing er nødvendig for Bont-basert medikament produkt produksjon og pasientsikkerhet. Den mye brukt musen bioassay for Bont testing er svært følsom, men mangler presisjon og gjennomstrømning som trengs for rask og rutinemessig Bont testing. Videre har bioassay bruk av dyr førte til samtaler av narkotika produkt regulatoriske myndigheter og dyrerettighetstalsmenn i USA og i utlandet for å erstatte musen bioassay for Bont testing. Flere in vitro erstatningsanalyser har blitt utviklet som fungerer godt med renset bont i enkle buffere, men de fleste har ikke vist seg å kunne anvendes til testing i svært komplekse matrikser. Her er en protokoll for påvisning avBont i komplekse matriser ved hjelp av BoTest Matrix analysene er presentert. Analysen består av tre deler: Den første del omfatter fremstilling av prøver for testing, er den andre delen en immunoutfelling trinn ved hjelp av anti-bont antistoff-belagte paramagnetiske kuler for å rense bont fra grunnmassen, og den tredje delen kvantifiserer det isolerte bont største proteolytiske aktivitet ved hjelp av en fluorogene reporter. Protokollen er skrevet for høy gjennomstrømning testing i 96-brønners plater ved anvendelse av både flytende og faste matrikser og krever omtrent 2 timer for manuell forberedelse med totale analysetider av 4 til 26 timer, avhengig av prøvetype, toksin belastning, og ønsket følsomhet. Dataene er presentert for bont / A-testing med fosfat-bufret saltvann, et legemiddel, kultur supernatant, 2% melk, og ferske tomater og omfatter diskusjon av kritiske parametre for assay suksess.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Botulinum nervegifter (BoNTs) er de dødeligste stoffer kjent, med intravenøse menneskelige dødelige doser anslått til 1-3 ng / kg 1,2. Syv strukturelt lignende serotyper av bont, merket A til og med G, finnes, som hver består av en tung kjede domenet er ansvarlig for cellebinding, binding og translokasjon inn i cytosol og en lett kjede som koder for et sink endopeptidase 3-5. Den utsøkte toksisitet av Bont skyldes delvis sin spesifikk binding og oppføring i motoriske nerveceller ved nevromuskulære krysset seks. Inne i nervecellen, den lette kjede endopeptidase spesifikt spalter ett eller flere av de løselige N-etylmaleimid følsomt faktor festeproteinreseptoren (SNARE) proteiner som kreves for vesikkelfusjon, inhiberende nevrotransmitter-frigjøring, og som fører til slapp paralyse 7-14. Kjent som sykdommen "botulisme," lammelse av membranen og interkostalrom muskler ved Bont slutt resulterer irespirasjonssvikt og død hvis ikke tidlig diagnose og behandling er mottatt.

Menneskelig matbåren botulisme er oftest assosiert med Bont serotype A, B, E og F (Bont / A, Bont / B, etc.) og vanligvis resultater fra inntak av forurenset mat 15,16, selv om, flere tilfeller av sårbotulisme ble rapportert blant sprøytemisbrukere 17,18. I USA, spedbarn botulisme som følge av inntak av Clostridium sporer av barn under ett er den vanligste formen for botulisme 19-21. Imidlertid ble det rapportert om matbårne Bont utbrudd som følge av uriktig hjem hermetisering og matfag i både USA og i utlandet. Mellom 2000-2009 ble det rapportert om minst 338 tilfeller av matbåren botulisme verdensbasis, inkludert seks omkomne 22. Evnen til raskt og følsomt oppdage matbårne botulisme utbrudd er en kritisk indikasjon som kan hjelpe tidlig diagnose 23,24. Videre vil deteksjonsmetoder som tillater kostnadseffektiv og rutine mat testing føre til økt matsikkerhet.

Bont sin neuronal spesifisitet og lang biologisk halveringstid gjør det en potent terapeutisk også. I USA, er Bont-baserte legemidler godkjent av Food and Drug Administration for behandling av kosmetiske forhold og nevromuskulære relaterte lidelser inkludert glabellalinjer, cervikal dystoni, migrene, overaktiv blære, og skjeling. Mange "off-label" applikasjoner er dokumentert, inkludert høydose behandlinger for alvorlig muskel dysfunksjon 25-28. Nøyaktig kvantifisering toksin er kritisk for riktig dosering, som underdosering kan føre til ineffektiv behandling mens dosering setter pasienter med risiko for potensielt skadelige bivirkninger. Dessverre er ingen standardisert potens analyseprotokollen delt på tvers av produsenter, noe som resulterer i enhet definisjonsforskjeller mellom Bont-basert medikament proCTS 29-31.

Standarden test for Bont er musen bioassay der Bont-holdige prøvene er injisert intraperitonealt i mus og antallet dødsfall registrert over 1-7 dager 16,32,33. Musen bioassay er svært følsom med grensene for påvisning (LOD) på 5-10 pg Bont / A 34, men etiske bekymringer over dyr bruk, de høye kostnadene ved opplæring av personell og opprettholde dyrefasiliteter, lange analyse ganger, og mangel på standardiserte protokoller resulterte i samtaler for å utvikle standardiserte, dyr fritt Bont testing og kvantifisering metoder 35-39. Nylig ble flere alternative Bont kvantifisering metoder utviklet som tilbyr musen eller nær-mus bioassay følsomhet 40-49. Disse metodene vanligvis bruker fluorescens, masse-spektrometri, eller immunologiske metoder og gir analysetider betydelig kortere enn mus bioassay uten animalsk bruk. Mass-spektrometri tilnærminger kombinert med immunologisk techniqdier ble vist å oppdage og kvantifisere Bont finnes i mat og andre komplekse prøver, men krav personell opplæring og spesialisert utstyr grense disse analysene 50-55. De fleste andre alternative analyser er ikke aktuelt lett til komplekse sample testing eller mangler kapasiteten som kreves for rutine Bont testing. Den svært variabel karakter av mat prøveviskositeten, pH, saltinnhold, og matrise bestanddeler presenterer en spesielt vanskelig utfordring når du prøver å utvikle in vitro analysemetoder med følsomhet for å matche den ekstreme styrken på Bont. Videre, til og med enkle og forholdsvis godartede buffersystemer, slik som de som oppstår ved resuspensjon av bont-baserte legemidler, inneholder salt, albumin, og sukker stabilisatorer (dvs. hjelpestoffer) som i vesentlig grad påvirker in vitro potens bont 56.. Toksin rensing er nødvendig for nøyaktig aktivitet testing av alle, men den enkleste av prøvene 56-59.

DenBoTest Matrix analysene ble designet for rask, høy gjennomstrømning, og konsekvent kvantifisering av Bont fra svært komplekse prøver ved hjelp av utstyr som vanligvis finnes i forskningslaboratorier 56,60. Disse analysene bruker paramagnetiske perler kovalent knyttet til serotype-spesifikke anti-Bont antistoffer til å binde og beslaglegge Bont ut av en prøve, og deretter fjerne forstyrrende matrise forbindelser ved vasking. Etter vasking blir bundet bont proteolytisk aktivitet så kvantifisert i en optimal reaksjonsbuffer ved hjelp av et reporter kompatibel med bont serotype som testes. Disse journalister er fluorogenic proteiner bestående av en N-terminal cyan fluorescerende protein (CFP) del og en C-terminal gul fluoriserende protein derivat (Venus) enheten bundet av en Bont substrat, SNAP25 rester 141-206 eller synaptobrevin rester 33-94 utgjør den BoTest A / E eller B / D / F / G journalister, henholdsvis 45. Reporter spalting av Bont er overvåket ved hjelp av Förster resonans energioverføring (FRET). Når than reporter er intakt, eksitasjon av CFP resulterer i FRET til Venus, leskende CFP utslipp og spennende Venus utslipp. Spalting av reporter ved Bont hindrer FRET, som fører til en økning i CFP utslipp og reduksjon i Venus utslipp. Bont aktivitet kan deretter bli målt kvantitativt ved å bruke forholdet mellom CFP og Venus utslipp. LOD under 3 pg er mulig fra et bredt utvalg av matvarer ved hjelp av en high-throughput 96-brønn plate-format 56. Økt følsomhet kan oppnås ved bruk av større prøvevolumer, siden analysen tillater konsentrasjonen av toksinet på perleoverflaten.

De BoTest Matrix-analyser for BoNTs A, B, E og F ble utviklet og testet med mat, farmasøytisk, og miljøprøver 56,60. Her beskriver vi prosedyrer for å gjennomføre disse analysene for påvisning av Bont i lav kompleksitet (f.eks farmasøytisk, Bont i buffer) og høy kompleksitet (for eksempel mat, miljø) prøver. Spesifikke bearbeidingsmetoderfor flere prøvetyper er omtalt i denne protokollen, og prøvetyper som ikke er beskrevet her kan vanligvis tilpasses ved hjelp av en kombinasjon av de presenterte metoder. Protokollen ble utviklet og testet med Bont / A, men er tilpasningsdyktig til andre Bont serotyper bruke sine respektive analysene som demonstrert andre steder 56,60.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En. Utarbeidelse av analysereagensene

  1. Tin 200x ditiotreitol (DTT), 10x Matrix bindende buffer (10 x bindingsbuffer heretter), 10x Nøytralisering buffer (næringsmiddel-eller pH ubalanserte prøvene bare), og 10x BoTest reaksjonsbuffer (10x reaksjonsbuffer i det følgende) ved romtemperatur (RT) i 15 min eller til det er helt tint. Se tabell 1 for en liste over buffere og reagenser som brukes i denne protokollen. Se tabell 2 for en liste over materialer og utstyr som kreves for denne protokollen.
  2. Vortex tinte buffere for 5 sek å blande. 10x Neutralization buffer, 200xDTT, og 10x Reaction buffer skal være klar, mens 10x Binding buffer vil ha et uklart utseende. Varm opp 10x Reaction buffer for 5 min ved 37 ° C og gjenta virvling hvis den er tåkete etter tining.
  3. Generere 3,8 ml 1x Reaction buffer.
    1. Merke en 15 ml konisk tube "1x Reaction buffer" og legg til 3,42 ml molekylærbiologi grade wateh, 380 mL 10x Reaction buffer, og 19 mL 200x DTT. Bland buffer godt ved inversjon.
    2. Skjær en enkelt EDTA-fri protease inhibitor tablett i fjerdedeler ved hjelp av en ren barberblad og legge til en fjerdedel av tabletten til 1x reaksjonsbuffer (det resterende tablettparti kan lagres ved 4 ° C for senere bruk). NB proteasehemmere kan ikke være nødvendig hvis du bruker renset toksin og enkle buffere (f.eks farmasøytiske prøver).
    3. Vortex 1x Reaction buffer inntil protease tabletten er fullstendig oppløst.
  4. Varm matrisen A perler (IP-A perler heretter) for 20 min ved RT.
  5. Tine BoTest A / E reporter (A / E reporter heretter) ved romtemperatur, beskyttet mot lys.
  6. Merke en 15 ml konisk tube "0,5 mikrometer A / E reporter" og legg til 45 mL av 20 mM A / E reporter lager til 1,8 ml 1x Reaction buffer. Bland grundig ved pipettering og lagre på is beskyttet mot lys.

2. Ståard Curve Sample Generation

Den standardkurve som er beskrevet her strekker 10-30,000 per MLD 50 / g mat eller per ml buffer i halv-log fortynninger (tabell 3). Sluttbrukeren er gratis å bruke alternative konsentrasjoner som er aktuelt.

  1. Inndriving og inkubering matriksene med referansemateriale. Generere standardkurven ved hjelp av et fortynningsmiddel av samme matrise som den ukjente, om mulig, for å redusere matrix effekter. Bruk gelatin fosfatbuffer (GPB) eller fosfat-bufret saltvann (PBS) som et fortynningsmiddel hvis ytterligere, bont-negative matrisen ikke er tilgjengelige (f.eks felt eller bont utbrudd sample testing). Generere standardkurven ved å tilsette bont / A inn i grunnmassen av valget følge den egnede protokollen nedenfor.
    1. Lav kompleksitet prøver (f.eks PBS, GPB, eller farmasøytisk)
      1. Tilsett 10 ml av den passende buffer til en 15 ml konisk rør og satt til side. Denne prøven vil bli brukt som fortynningsmiddel for det standard kurve og ukjente fortynninger (§ 4).
      2. Tilsett 1,2 ml buffer til et mikrosentrifugerør.
      3. FORSIKTIG: Dette trinnet bruker Bont og ekstrem forsiktighet må brukes når det gjelder fjerning av eventuelle reagenser og materialer som kommer i kontakt med gift. Bruk av personlig verneutstyr og riktig disponering av alle materialer må utføres i henhold til US Department of Labor OSHA retningslinjer for Bont (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html). Legg bont / A til 1,2 ml prøve slik at sluttkonsentrasjonen er 30 000 MLD 50 / ml (36,000 MLD 50 totalt).
    2. Flytende matvareprøver (eller andre komplekse flytende prøver) Merk: Første test er anbefalt å bestemme volumet av supernatanten gjenvunnet fra avklares prøver som det partikkelformede materiale (. F.eks pulp) i flytende matriser vil variere. Denne protokollen forutsetter minst 1,2 ml avklart supernatant vil utvinnes fra en 1,4 ml SAMPle. Øk prøvestørrelse dersom det er nødvendig.
      1. Legg 10 ml væske mat til en 15 ml konisk tube og sett den til side. Denne prøven vil bli brukt som fortynningsmiddel for standardkurven og ukjente fortynninger (punkt 4).
      2. Veie en tom 1,5 ml mikrosentrifugerør og registrere sin masse.
      3. Til 1,4 ml av den flytende maten til veid mikrosentrifugerør.
      4. Reweigh den mikrosentrifugerør og beregne massen av tilført mat prøven ved å trekke massen av det tomme rør.
      5. FORSIKTIG: Dette trinnet bruker Bont og ekstrem forsiktighet må brukes når det gjelder fjerning av eventuelle reagenser og materialer som kommer i kontakt med gift. Bruk av personlig verneutstyr og riktig disponering av alle materialer må utføres i henhold til US Department of Labor OSHA retningslinjer for Bont (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html). Legg bont / A til 1,4 ml prøve ved en sluttkonsentrasjon på 30 000 MLD 50 / g mat.
      6. Inkubatorte oppløsningsvæsken og tilsatt prøvene ved romtemperatur eller 4 ° C i 2 timer for å gi bont tid til å interagere med maten matrise, å etterligne et naturlig forurensning.
    3. Faste nærings prøver (eller andre faste prøver) Bemerk: Innledende testing anbefales å bestemme volumet av supernatanten gjenvunnet fra homogeniserte og klargjort prøvene etter tilsetning av 1 ml GPB / g mat. Denne protokollen forutsetter at i det minste 1,2 ml klar supernatanten blir gjenvunnet fra en 2 g prøve. Øk prøvestørrelse dersom det er nødvendig.
      1. Vei opp 10 g fast prøve i en 50 ml konisk rør og satt til side. Dette vil bli benyttet som fortynnings-middel.
      2. Vei opp 2 g fast føde prøven inn i en andre 50 ml konisk rør.
      3. FORSIKTIG: Dette trinnet bruker Bont og ekstrem forsiktighet må brukes når det gjelder fjerning av eventuelle reagenser og materialer som kommer i kontakt med gift. Bruk av personlig verneutstyr og riktig disponering av alt materiales må utføres i henhold til US Department of Labor OSHA retningslinjer for Bont (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html). Legg bont / A til overflaten av 2 g prøvemateriale til en sluttkonsentrasjon på 30 000 MLD 50 / g mat (60.000 total MLD 50).
      4. Inkuber fortynningsmiddel og piggete prøver ved romtemperatur eller 4 ° C i 2 timer for å gi bont tid til å interagere med maten matrise, å etterligne et naturlig forurensning.
  2. Sample homogenisering og buffer justering. Behandle piggete standardkurve prøven og fortynningsmiddel generert ovenfor i henhold til prøvetype.
    1. Lav kompleksitet prøver
      1. Ingen ytterligere prøvebehandling er nødvendig.
    2. Flytende mat prøver (eller andre komplekse væskeprøver)
      1. Ingen prøve homogenisering er nødvendig.
      2. Legg 140 mL 10x Neutralization buffer til de 1,4 ml tilsatt prøven og 1 ml 10x nøytraliseringion buffer til 10 ml fortynner prøven. Bland prøvene godt ved inversjon.
      3. Delvis klar begge prøvene ved sentrifugering i 10 min ved 6000 x g og 4 ° C. Umiddelbart fjerne Supernatantene og overføre til nye rør.
    3. Solid mat prøver (eller andre faste prøver)
      1. Tilsett 2 ml GPB (1 ml GPB / g mat) til 2 g bont / A-tilsatt fast føde prøven og 10 ml GPB til 10 g fortynningsmiddel prøven.
      2. Homogen prøvene ved hjelp av en støter inntil grundig blandet. Avhengig av naturen av prøven, kan det være små biter av materiale som ikke kan homogeniseres, hvilket er akseptabelt. Alternativt kan mekanisk homogenisering metoder benyttes. Anvendelse av en blender er ikke anbefalt da det kan inaktivere samt aerosolize toksinet.
      3. Legg 1/10th volum på 10x Nøytralisering buffer til fortynningsmidlet prøven basert på det omtrentlige totale volum (for eksempel 2 ml hvis volumet er 20 ml). Ekstrapoleredet totale volumet av den bont / A-tilsatt prøven og tilsett 1/10th volum på 10x Nøytralisering buffer. Bland prøvene godt ved inversjon.
      4. Delvis klar begge prøvene ved sentrifugering i 10 min ved 6000 x g og 4 ° C. Umiddelbart fjerne Supernatantene og overføre til nye rør.
  3. Forbered standardkurve seriefortynning for testing
    1. Ved hjelp av bont / A-spiked standardkurve prøven som D1 og nonspiked prøven som fortynnings-middel, genererer de resterende standardkurve prøver i 1,5 ml mikrosentrifugerør i henhold til tabell 3.

Tre. Forbered Ukjente prøver

Denne delen kan gjennomføres parallelt § 2.

  1. Bestem antallet og fortynninger av ukjente. Test ukjente i triplikat hvis mulig.
    1. For kvalitative analyser, kjøre ukjente uten ytterligere fortynning enn nødvendig for å behandle prøven som descriseng nedenfor.
    2. For kvantitative analyser, tilberede minst to 1:10 fortynning prøver, som beskrevet nedenfor, for å sikre at en eller flere av prøvene faller innenfor det lineære området av analysen respons. Generer fortynninger ved bruk av et fortynningsmiddel av samme matrise som den ukjente, om mulig, for å redusere matrix effekter som beskrevet i avsnitt 3. Ellers bruker PBS eller GPB som fortynningsmiddel.
  2. Generering og fortynne ukjente prøver i henhold til prøvetype.
    1. Lav kompleksitet ukjente (f.eks PBS, GPB, eller farmasøytisk)
      1. Legg til minst 750 mL ukjente til en mikrosentrifuge tube å generere Ukjent fortynning en.
      2. Legg 675 pl fortynningsmiddel til to mikrosentrifugerør merkede ukjente fortynning 2 og 3. Fortynningsmiddelet vil være det samme materialet som brukes for standardkurve generasjon.
      3. Serielt å fortynne en fortynning ved å overføre 75 ul av fortynningen 1 inn i røret 2 fortynning og blanding.
      4. Serielt fortynnete fortynning 2 ved å overføre 75 ul fortynning 2 inn i røret 3 fortynning og blanding.
    2. Flytende mat ukjente (eller andre komplekse væskeprøver) Merk: Innledende testing anbefales å bestemme volumet av supernatanten utvinnes fra avklart prøvene som omtalt i kapittel 3. Øk prøvestørrelse dersom det er nødvendig.
      1. Legg ≥ 875 pl av den ukjente væsken til et mikrosentrifugerør.
      2. Legg 1/10th volum på 10x Neutralization buffer til prøven (f.eks 87,5 mL for en 875 mL prøve).
      3. Delvis klar prøven ved sentrifugering i 10 min ved 6000 x g og 4 ° C. Umiddelbart Overfør supernatanten til et nytt rør. Dette er ukjent fortynning en.
      4. Legg 675 pl fortynningsmiddel til to rør som er merket Unknown fortynning 2 og 3. Fortynningsmiddelet vil være det samme prosesserte materialet som brukes for standardkurve generasjon.
      5. Serielt fortynne fortynning 1 ved overføringring 75 pl av fortynningen 1 inn i røret 2 fortynning og blanding.
      6. Serielt fortynnet fortynning 2 ved å overføre 75 ul fortynning 2 inn i røret 3 fortynning og blanding.
    3. Solid mat ukjente (eller andre faste prøver) Note: Innledende testing anbefales å bestemme volumet av supernatanten utvinnes fra avklart prøvene som omtalt i kapittel 3. Øk prøvestørrelse dersom det er nødvendig.
      1. Vei opp 2 g faststoff ukjent prøve i en 50 ml konisk rør.
      2. Tilsett 2 ml GPB (1 ml GPB / g mat) til 2 g fast prøve.
      3. Homogenisere prøvene som beskrevet i punkt 3.2.3.2.
      4. Legg 1/10th volum på 10x Nøytralisering buffer til prøven basert på det omtrentlige totale volum (for eksempel 0,4 ml hvis volum er 4 ml). Bland prøvene godt ved inversjon.
      5. Delvis klar prøven ved sentrifugering i 10 min ved 6000 x g og 4 ° C. Immediately overførings ≥ 750 ul supernatant til et mikrosentrifugerør. Dette er ukjent fortynning en.
      6. Legg 675 ml fortynningsmiddel til to rør som er merket Unknown fortynning 2 og 3. Fortynningsmiddelet vil være det samme prosesserte materialet som brukes for standardkurve generasjon.
      7. Serielt å fortynne en fortynning ved å overføre 75 ul av fortynningen 1 inn i røret 2 fortynning og blanding.
      8. Serielt fortynnet fortynning 2 ved å overføre 75 ul fortynning 2 inn i røret 3 fortynning og blanding.

4. Endelig Sample Avklaring

Hvis testingen flytende eller fast føde prøver, sentrifuger alle prøver for 5 min ved ≥ 14 000 xg i en mikro å fullt avklare prøvene. Umiddelbart fjerne Supernatantene og overføre til nye rør.

5. Plateoppsett og Bont / A Nedtrekk

  1. Den spesifikke plate layout er applikasjonsavhengig, men ikke bruke den utenfor brønner slik somå unngå kanteffekter. Hver ukjent prøve og standardkurve sample D1-D8 krever tre brønner mens prøven D9 krever seks brønner. En foreslått plate layout er vist i figur 1..
  2. Tilsett 20 ul 10 x bindingsbuffer til hver brønn å bli brukt.
  3. Tilsett 200 ul av hver fortynning avklares og ukjent for hver av tre brønner (seks brønner for D9) i triplikat testing. Bland platen i 10 sekunder i en mikroplate-blander.
  4. Tilsett IP-A perler.
    1. Vortex IP-A perler for 10 sek på høyeste hastighet. Fortsett virvling om perler ikke er fullstendig resuspendert og homogent.
    2. Pipetter 20 mL IP-A-perler til hver prøve, samt.
    3. Bland platen i 30 sekunder i en mikroplate-blander.
  5. Inkuber platen ved hjelp av en roterende plate inkubator i 2 timer ved 750 rpm, 25 ° C eller romtemperatur. Assay ytelse er svært avhengig av å generere og opprettholde den IP-A perlesuspensjon ved alle inkubasjon trinn. Alltid resuspender perler med en MicroPsen mikser etter pelletering og opprettholde suspensjonen ved hjelp av en orbital mikrotiter platerister i løpet av alle inkubasjon trinn.

6. Plate Vasking og Bead resuspensjon

  1. Vask platene enten for hånd eller ved hjelp av en magnetisk kule-kompatibel automatisk platevasker. En automatisert plate vaskemaskin konfigurert for magnetiske kuler øker analysen gjennomstrømming.
    1. Manuell Vasking
      1. Merke en 50 ml konisk tube "1X vaskbuffer" og legg til 45 ml molekylærbiologi grade vann og 5 ml 10x Matrix vaskebuffer. Bland buffer godt ved inversjon.
      2. Fjern platen fra den roterende plate inkubatoren.
      3. Umiddelbart plassere platen på en 96-brønns magnetiske kuler separasjonsplaten i 5 min.
      4. Mens du holder platen på 96-brønnen magnetiske kuler separasjon plate, fjern forsiktig og kast supernatanten fra prøvebrønner ved hjelp av en enkelt-eller flerkanals pipette. Ikke aspirerperler-visuelt overvåke den aspirerte buffer i pipettespissen for utilsiktet perle fjerning. Hvis fjerning er vitne til, tilsett spissen innholdet tilbake til brønnen, reseparate, og gjenta fjerning.
      5. Tilsett 300 mL 1X vaskbuffer til hver prøvebrønnen.
      6. Fullt resuspendere kulene ved å blande platen i 30 sekunder i en mikroplate-blander.
      7. Inkuber platen i 96-brønners magnetiske kuler skilleplate i 2 min.
      8. Fjern og kast supernatanten fra prøvebrønner som før.
      9. Gjenta trinn 6.1.1.5-6.1.1.8 tre ganger for totalt fire vasker.
      10. Med platen på 96-brønnen magnetiske kuler separasjon plate, visuelt inspisere brønner for å bekrefte selv supernatant fjerning, bruke en pipette for å fjerne overflødig rest buffer som nødvendig. Noen buffer vil forbli i brønnene og omsorg må tas for å unngå perle fjerning eller perle tørking.
      11. Tilsett 50 pl 1 x reaksjonsbuffer til hver prøvebrønnen og bland plate for 30 sec på en mikro mikseren til fullt resuspendere perlene. Om nødvendig, bruk en pipette til fullt resuspendere perlene.
    2. Automatisert Plate Vaske
      1. Oppsett og program vaskemaskinen i henhold til tabell 4. Rengjør og spyl vaskemaskinen med høy kvalitet (f.eks nanopure) vann.
      2. Prime vaskemaskinen ved å kjøre programmet "Prime".
      3. Fjern platen fra den roterende plate inkubatoren.
      4. Sett platen umiddelbart på 96-brønnen magnetiske kuler separasjon plate på plate vaskemaskin.
      5. Kjør koblingen programmet "Master Wash". Den første programtrinnet er en 5 min inkuberingstrinnet hvor vaskemaskin vil stå stille.
      6. Etter programmet er avsluttet, fjerne platen fra vaskeren, tilsett 50 pl 1 x reaksjonsbuffer til hver prøvebrønnen, og bland platen i 30 sekunder i en mikroplateblander for å fullt ut resuspendere kulene. Om nødvendig, bruk en pipette til fullt resuspendere perlene.

    7. Analyse Innvielse og Inkubasjon

    1. Legg 50 mL 0,5 mikrometer A / E reporter (se del 1) til hver prøve godt og bland i 30 sek på en mikro mikseren til fullt resuspendere perlene.
    2. Tilsett 100 pl vann til hver ubrukt brønn på platen for å unngå kanteffekter.
    3. Forsegl plate med platen forseglingstape og Inkuber platen ved hjelp av en roterende plate inkubator ved 750 rpm, 25 ° C eller romtemperatur. Beskytt platen mot lys under inkubasjon.

    8. Datainnsamling og analyse

    Merk: Denne analysen er en sanntids-analyse som kan bli målt flere ganger inntil den ønskede følsomhet blir oppnådd, er det ingen stopp reagenser som kreves. Anbefalte innledende lesetider er 2, 4 og 24 timers inkuberingstid med analysefølsomhet øker med inkuberingstiden.

    1. Datainnsamling
      1. Ved hver lese tid, fjerne platen fra den roterende plate inkubator, fjern pakninging tape, og umiddelbart plassere platen på 96-brønnen magnetiske kuler separasjon plate. Tillate at perlene skilles i 2 min.
      2. Plasser plate i mikroplateleser og måle utslippet på ~ 470 og ~ 526 nm i henhold til eksitasjon ved ~ 434 nm.
      3. Hvis ytterligere lesetider er ønsket, resuspendere kulene i 30 sek i mikroblanderen, forsegle plate, og returnere platen til den roterende plate inkubatoren.
    2. Dataanalyse
      1. Beregn utslippsforhold for hver prøve ved å dele den relative fluorescens enhet (RFU) verdi på 526 nm ved RFU verdi på 470 nm.
      2. Plott utslippsforhold versus loggen [Bont / A] for standardkurven datapunkter. Avhengig av bont / A potens område testet, vil en sigmoidal dose-responskurve oppnås (se Representative resultater).
      3. Monter standardkurven data med variabel skråningen dose-responskurve Y = Bottom + (topp-bunn) / (1 ​​+10 ^ ((logEC 50-X) * Hillslope)) der X erlogaritmen av konsentrasjonen, er Y responsen, og Y starter ved bunnen og går til toppen med en sigmoidal form.
      4. Bestem grensene for påvisning (LOD), grensene for kvantifisering (LOQ), og halv maksimal effektiv konsentrasjon (EC 50). Deteksjonsgrenser er definert som en prøve å ha en utslippsandel mindre enn tre standardavvik (SDS) under de tomme kontroller (n = 6). Grenser for kvantifisering er definert som en prøve å ha en utslippsandel mindre enn 10 SDS under de tomme kontroller (n = 6). EC 50 blir bestemt fra det sigmoidal dose-respons kurvetilpasning.
      5. Interpoler styrken av ukjente prøver mot sigmoidal dose-respons-standardkurve.
        1. For kvantitative resultater, bør den ukjente prøven ideelt sett faller innenfor den lineære del av standardkurven. Tilnærmet den lineære del av standardkurven, ved å beregne den 20 til 80% totale analyserespons vinduet (for eksempel hvis emisjonsforhold på standardkurven ranges 0,5 til 2,5, vil den lineære området være den del av standardkurven som strekker seg 0,9 til 2,1).
        2. For kvalitative resultater, sammenligner den ukjente prøven inntil LOD og LOQ for standardkurven.
        3. Ikke ekstrapolere ukjente prøver utover grensene for standardkurven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Et diagram som oppsummerer fremgangsmåten i den beskrevne protokoll er vist i figur 2.. Analysen krever mellom 4-26 timer å fullføre, avhengig av prøvetype og ønsket analysen følsomhet, men bare ~ 2 timers hands-on tid. Analysen utføres i 96-brønners plater, og, avhengig av hvilken type av tester som skal utføres, kan triplo testing av opptil 20 prøver inkludert standarder pr plate.

Fig. 3 viser representative resultater ved å bruke assay-bont / A holotoxin tilsatt i PBS og testet med den beskrevne protokoll etter 2, 4 og 24 timers inkubering med A / E reporter. Renset bont / A holotoxin ble valgt for dette forsøk fordi den definerte molekylvekt på ~ 150 kDa, sammenlignet med de mer bredt definert 700-900 kDa for toksinet kompleks, og renhet tillater svært nøyaktig spiking ved nøyaktige konsentrasjoner. Utslippsforhold, idet forholdet av emisjon ved 526 nm til at ved 470 nm etter eksitasjon ved 434nm, ved hvert tidspunkt er plottet versus Bont / En konsentrasjon (MLD 50 verdi er basert på Bont / A produsentens potens testing). Spalting av reporteren ved bont måles som en reduksjon i utslippet grad, som med vår plate reader varierer mellom omtrent 2.7 for den intakte reporter til omtrent 0,7 for fullstendig spaltet reporter. Det er viktig å merke seg at siden hver plate reader måler fluorescens i RFUs, vil den faktiske verdi av emisjonsforholdet være avhengig av plateleser som brukes. Langvarig inkubasjonstid med rapportør resulterer i økt reporter spalting som vist ved den mot venstre skift i kurven. Datapunktene, testet i tre eksemplarer, viser lav SD av gjennomsnittet og følge den forventede trenden med økt utslipp forholdet med redusert toksin belastning. Unnlatelse av analysen til å følge denne forventede utviklingen kan tyde på en feil under utvanning generasjon eller data plotting. Utslipps prosenter av kontrollene som ikke inneholder Bont / A også holde seg During inkubasjonstiden (figur 3, innfelt), noe som viser mangelen på ikke-spesifikk protease-aktivitet.

Et eksempel på bruk av denne protokollen for å kvantifisere farmasøytiske bont / A-prøvene er vist i figur 4.. En standardkurve ble generert i PBS med renset bont / A holotoxin og behandlet parallelt med fortynninger av legemiddel som genereres fra en enkelt 100 U ampulle med lyofilisert BOTOX rehydratisert i 0,9% saltløsning. (Ideelt sett ville standardkurven være sammensatt av referanse masse BOTOX men slikt materiale ikke var lett tilgjengelig.) Prøver ble testet ved hjelp av den beskrevne protokoll med unntak av at 50 mikroliter prøver ble testet i duplikat, uten bruk av 10 x bindingsbuffer. Standardkurven ble plottet som en funksjon av bont / A-konsentrasjon etter 24 timers inkubasjon med A / E reporter. Utslipps forholdet mellom hver ukjent prøve ble deretter visualisert ved å plotte dens skjæringspunkt på tvers av standardkurven. I dette assay, linjenar del av standardkurven (den 20-80%-analysen respons vindu) faller mellom en emisjonsforhold på 2,11 til 1,05, og er angitt med den stiplede boksen i fig. Konsentrasjonene av de tre ukjente som faller innenfor dette lineære område ble deretter interpolert fra standardkurven (figur 4, innfelt). Dette eksempel viser den generelle metode som ville bli brukt for å detektere eller kvantifisere en hvilken som helst ukjent prøve mot en standard kurve.

Friske tomater og 2% melk ble valgt for å demonstrere protokollen ytelse og følsomhet med både en solid (tomat) og flytende mat (2% melk) matrise. Bont / A og består av i kjernen holotoxin og neurotoxin-assosierte proteiner (NAP) ble valgt for disse eksperimenter fordi dette preparatet ligner på toksinet produsert i løpet av en naturlig Clostridium forurensning. Som vist i figur 5A, for gjenoppretting av bont / A, målt som spalting av A / E reporter, er observert med bOTH matriser. Økt inkubasjonstid med reporteren øker analysen følsomhet, men ikke resulterer i redusert utslippsforhold for de ingen gift kontroller (Figur 5A, innfellinger), indikerer de observerte cleavage resultater fra Bont / A og ikke-spesifikk protease bære over fra maten i assay. Som med figur 3, er data viser lav variabilitet og følger den forventede utvikling for redusert reporter spalting med redusert toxin konsentrasjon.

Den bont / A LOD, LOQ og EC 50 for både matvarer på hvert tidspunkt er vist, er oppsummert i tabell 5.. LOD og LOQ er definert som den laveste konsentrasjon prøven med en emisjonsforhold lavere enn tre og ti SDS under bakgrunns (prøver som inneholdt ingen bont / A), henholdsvis. Disse grensene er begrenset til de datapunkter som ble testet, selv om interpolasjon til sigmoidal dose-respons-kurve kan brukes til å beregne teoretiske nedre grenser. Noen matriks-til-matrise variasjon i LOD og LOQ er forventet, som matrix effekter kan påvirke bindingen av toksinet til perlene og utvinning av perler under vasking. Mens det ser ut til at det var mer toksin utvinning fra 2% melk enn tomater fra dataene i figur 5A, mye av denne forskjellen skyldes den ekstra fortynning nødvendig å homogenisere tomat prøver i GPB.

I tillegg til å være en fast føde matriks, tomater er en bemerkelsesverdig prøvetype, hvor pH og ionestyrke justering oppnås ved tilsetning av 10x Nøytralisering buffer, er kritisk for analysen suksess. Figur 5B illustrerer måleresultater som ved testing av tomater med eller uten inkludering av 10x Neutralization buffer. Unnlatelse av å legge til 10x Nøytralisering buffer resultater i dårlig utvinning av Bont / A fra prøver og er demonstrert av en konstant utslippsforhold på tvers av alle testede Bont / A konsentrasjoner. Tilsetning av 10x Nøytralisering buffer, selv om, results i sensitiv deteksjon av toksinet.

Uspesifikke proteaser som finnes i komplekse matriser kan føre til falske positive hvis ikke adressert siden andre enn Bont proteaser kan spalte A / E reporter. Uspesifikke proteaser kan være endogen til mat prøve eller innført ved bruk nonpurified bont preparater slik som Clostridium dyrkningssupernatanter. Grundig perle vasking vil fjerne mest uspesifikke proteaser, men er kritisk tillegg av proteasehemmere til reaksjonen buffer Figur 6 viser uspesifikke protease aktivitet funnet i Clostridium Bont / A dyrkningssupernatanter ved hjelp av en modifisert A / E reporter, BoTest KO (KO reporter. ). Den KO reporter er den samme som A / E reporter med unntak av at den bont / A spaltningssetet er mutert slik at den ikke lenger spaltes av bont / A. Derfor resulterer noen observerte reporter cleavage fra uspesifikke protease aktivitet. De høye nivåene av KO reporter cleAvage indikerer kultursupernatanten inneholder et høyt nivå av protease-aktivitet, men den aktiviteten er effektivt eliminert ved tilsetning av protease-inhibitorer.

Eksempeldataene demonstrere nytten av protokollen for høy gjennomstrømming Bont / A deteksjon i enkle buffere og mat matriser. Visse matvarer kan kreve små analyser justeringer, men den beskrevne protokollen bør gi gode resultater med de fleste typer mat.

Figur 1
Figur 1 Foreslått. Plate layout. Prøver er begrenset til de indre 60 brønnene av platen for å unngå eventuelle effekter kant. Ukjente eller standard kurve prøver kan tilsettes etter ønske. Alle ubrukte brønner skal fylles med 100 mL vann under reporter inkubasjon. CLIck her for å se større bilde.

Fig. 2
Hver stort skritt i protokollen angis Figur 2. Skjematisk oversikt over den beskrevne protokollen. Av en merket boks og justeres ved siden av en estimert analysen tidslinje (ikke i målestokk). Nonfood prøvene ikke krever utvalgets behandling og så gå inn i protokollen nedstrøms matvareprøver. Den stiplede boksen rundt seriell fortynning generasjon for de ukjente indikerer at dette er en valgfri, men anbefalt, trinn. Klikk her for å se større bilde.

Figur 3
Figur 3. Påvisning av Bont / A holotoxin i PBS bruker den beskrevne protokollen.Renset bont / A holotoxin ble tilsatt i PBS og testet ved hjelp av den beskrevne protokoll med en øvre bont / A konsentrasjon på 1 nM. Alle prøver ble testet i triplikat, og feil søylene representerer standardavviket av gjennomsnittet. Rapportert potens er basert på produsentens musen bioassay testing av toksinet. Utslippsforholdet (forholdet mellom emisjon ved 526 nm til 470 nm ved eksitasjon ved 434 nm) av standardkurven ble målt etter 2, 4 og 24 timers inkubering med A / E reporter og plottet som en funksjon av bont / A konsentrasjon . Klikk her for å se større bilde.

Figur 4
Figur 4. Kvantifisering av BOTOX legemiddel bruker den beskrevne protokollen. Et enkelt 100 U ampulle med lyofilisert BOTOX legemiddel var resuspe nded i 220 pl 0,9% saltløsning, serielt fortynnet og testet som ukjente mot en standardkurve laget i PBS ved å bruke renset bont / A holotoxin. Prøvene ble testet i henhold til den protokoll som er beskrevet, bortsett fra at 50 ul prøver ble testet uten 10x bindingsbuffer i duplikat. Standardkurven ble beregnet ved å tilpasse utslipp forholdet av standardkurven prøvene til den variable skråningen sigmoidal dose-respons-likning, og er plottet som en funksjon av bont / A konsentrasjonen. Hver ukjent prøve er vist der den krysser standardkurven etter en 24-timers inkubering med A / E reporter. Konsentrasjonene av ukjente prøver som faller innenfor det lineære området (stiplet skraverte boks) ble interpolert fra en standard kurve. Etiketten for hver BOTOX ukjente er antallet enheter tilstede i prøven basert på merket styrke. Feil søylene representerer standardavviket til gjennomsnittet.t = "_blank"> Klikk her for å se større bilde.

Figur 5
Figur 5. Recovery of bont / A-tilsatt 2% melk og frisk tomater testing ved hjelp av den beskrevne protokoll. Prøver av 2% melk og ferske tomater ble tilsatt med renset bont / A-komplekset, og testet ved hjelp av den beskrevne protokoll. Alle prøver ble testet i triplikat, og feil søylene representerer standardavviket av gjennomsnittet. (A) Utslipps Forholdet mellom 2% melk og ferske tomater standardkurver ble målt etter 2, 4 og 24 timers inkubering med A / E reporter og plottet som en funksjon av bont / A potens. (B) Hvis man inkludere 10x Nøytralisering buffer i løpet av tomattestresultatene i analysefeil. Prøver av ferske tomater ble testet i henhold til den protokoll som er beskrevet, enten med eller uten tilsetning av 10x Neutralization buffer. Dataene som vises er for 4 timers tidspunkt. Klikk her for å se større bilde.

Figur 6
Figur 6. Protease-inhibitorer er nødvendig ved testing av komplekse matrikser. Clostridium bont / A (stamme Hall A) kultursupernatant ble serielt fortynnet i PBS og testet ved hjelp av den beskrevne protokoll enten med eller uten proteaseinhibitorer satt til reaksjonsbufferen, og med både A / E og KO reportere. Emisjonsgraden ble målt etter 24 timers inkubering med både A / E-eller KO reportere og plottet som en funksjon av bont / A potens. Betydelig spalting av KO reporter ble sett uten tillegg av proteasehemmere, men ble motvirket av deres inkludering. Alle prøver ble testet i triplikat, og feil bars representerer standardavviket for gjennomsnittet. Klikk her for å se større bilde.

Buffer Sammensetning Lagringstemperatur Stabilitet Merknader
10x Matrix Binding Buffer 500 mM HEPES-NaOH, pH 7,1, 250 mM NaCl, 1% Tween-20, 5% kasein, 0,05% NaN 3 -20 ° C eller -80 ° C Stabil i minst fem dager ved 4 ° C etter tining Leveres med BoTest matrise A Botulinum Detection Kit
10x Matrix Wash Buffer 119 mM fosfat, pH 7,4, 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 1% Tween-20 -20 ° C eller -80 ° C Stabil i minst fem dager ved 4 ° C etter tining Leveres med BoTest matrise A Botulinum Detection Kit
10x Neutralization Buffer 1 M HEPES-NaOH, pH 8,0, 1 M NaCl 4 ° C Stabilt for inntil seks måneder ved 4 ° C
10x BoTest reaksjonsbuffer 500 mM HEPES-NaOH, pH 7,1, 50 mM NaCl, 1% Tween-20, 100 mM ZnCl 2 -20 ° C eller -80 ° C Stabil i minst fem dager ved 4 ° C etter tining Leveres med BoTest matrise A Botulinum Detection Kit
BoTest A / E Reporter 20 pM i 50 mM HEPES-NaOH, 10 mM NaCl, 15% glyserol -80 ° C Oppbevar i små porsjoner. Stabil i minst fem dager ved 4 ° C etter tining. Leveres med BoTest matrise A Botulinum Detection Kit
Gelatin fosfatbuffer (GPB) 33,3 mM NaH 2 PO 4, pH 6,2, 2 g / l gelatin 4 ° C Stabil i opptil en måned ved 4 ° C
200x dithiothreitol (DTT) 1 M DTT -20 ° C Stabilt for inntil seks måneder ved -20 ° C Lag og lagre små (100 mL) alikvotene
1x PBS-t 11,9 mM fosfat, pH 7,4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 0,1% Tween-20 4 ° C Stabil i opptil en måned ved 4 ° C Kan gjøres ved hjelp 10x PBS fra Fisher (BP399-1)
Matrise A Perler (IP-A Perler) Magnetiske kuler kovalent konjugert til kylling anti-bont / A-antistoff i PBS. 0,1% Tween-20, 0,05% natriumazid, 0,25% kasein, og 50% glyserol -20 ° C Stabil i minst fem dager ved 4 ° C ved fjerning fra -20 ° C. IKKE fryse ved -80 ° C

Tabell 1.. Buffere som kreves for den beskrevne protokoll. 10x NøytraliseringBuffer er kun for svært komplekse (for eksempel mat) prøver og kan ikke være nødvendig, avhengig av arten av prøvene blir analysert.

Navn på materiell / utstyr Selskapet Katalognummer Kommentarer / Beskrivelse
BoTest matrise A Botulinum Neurotoxin Detection Kit BioSentinel A1015 Deteksjons kits for Bont / B og F er også tilgjengelig.
Varioskan Flash fluorescens mikroplateleser Thermo-Fisher Scientific 5250040 De fleste monokromator-eller filter-baserte enheter med 434 nm eksitasjon og 470 nm og 526 nm emisjonsevne kan benyttes.
96-vel magnetiske kuler Separation Plate V & P Scientific VP771H Andre magnetiske plater kan benyttes, men plate bør være utformet for å separere beads til siden av brønnen.
Magnetisk Bead-kompatibel Plate Washer BioTek ELx405 VSRM Valgfritt, bare nødvendig for automatisert plate vask. Andre magnetiske bead-kompatibel plateskiver kan også anvendes, men bør testes før bruk.
Mikro Diverse N / A Valgfritt, bare nødvendig for prøver som trenger sentrifugering.
MixMate plate blandebatteri Eppendorf 22674200
Orbital Shaker Diverse N / A Brukt ved romtemperatur eller ved 25 ° C hvis temperatur er tilgjengelig
EDTA-fri proteasehemmer Tabletter Roche 4693132001 Kun nødvendig for mat eller miljøtesting. Proteasehemmere må være EDTA-fri.
Bont / A Metabiologics N / A Valgfritt, kun nødvendig for standardisering og kvantifisering formål
Svart, flat bunn 96-brønners plater NUNC 237105 Platene bør ikke behandles
96-brønns plate Sealing Tape Thermo Scientific 15036

Tabell 2. Materialer og utstyr som kreves for den beskrevne protokoll. Noen materialer og utstyr er valgfrie, eller kan være substituert, avhengig av tilgjengelig utstyr. Tilleggs egnethet testing og optimalisering kan være nødvendig hvis du bruker alternative utstyr.

</ Tr>
Sample navn Volume Toxin Volume Diluent [Bont / A] (MLD 50 / ml) eller (MLD 50 / g mat) log [Bont / A] (MLD 50 / ml) eller (MLD 50 / g mat) D1 1200 mL Stock N / A 30000 4,48
D2 300 mL D1 600 mL 10000 4
D3 90 mL D1 810 mL 3000 3,48
D4 90 mL D2 810 mL 1000 3
D5 90 mL D3 810 mL 300 2,48
D6 90 mL D4 810 mL 100 2
D7 90 mL D5 810 mL 30 1.48
D8 90 mL D6 810 mL 10 1
D9 N / A 1400 mL N / A N / A

Tabell 3:. Fortynning tabell for standardkurve prøver Denne tabellen genererer en standardkurve i halvlogg fortynninger over 3,5 størrelsesordener. Nok Ingen Bont blindprøve (D9) genereres for å kjøre en n = 6. Ytterligere fortynninger kan legges om ønskelig.

<td> 0
Programnavn Variabel Verdi Kommentarer
Prime Reagensflaske A
Prime Volume 400
Prime Flow Rate 7
Sug Etter Prime? N
Matrix Wash Reagensflaske A Antall vaskinger kan økes dersom gjenværende protease-aktivitet er observert.
Metode
4
Soak / Shake Y
Sug Varighet 180
Rist Før Sug? N
Prime Etter Sug? N
Disp
Tilsett Volume 300
Tilsett Flow Rate 5
Tilsett Høyde 130
Hor. Tilsett Pos. 0
Deaktiver Aspirer? Y
Bottom Vask først? N
Prime før start? N
Aspirerer
Aspirasjon Høyde 40
Hor. Aspirer Pos. 0
Aspirasjon Rate 5
Aspirasjon Delay
Tvers Aspirer? N
Endelig Aspirasjon? Y
Endelig aspire Delay 0
Matrix Soak Sug Varighet 300 Økt suge varighet kan øke perle utvinning fra mer tyktflytende matvarer.
Rist Før Sug? N
Master Wash Matrix Soak Dette er en "Link"-program for å kjøre Matrix Sug og Matrix Vask programmer sammen.
Matrix Wash

Tabell 4. Magnetisk. Bead-kompatibel automatiske program innstillinger platevasker. Følgende programmer anta at plate skive er utstyrt med en magnet som trekker perler til siden av brønnene, og at bufferkoblingsmodulen er satt opp slik at 1x vaskebuffer ( PBS-t) er festet til ventil A. Disse programmene er spesifikke for BioTek ELx405. Se instrumentets manual for programinstruksjonene. Andre magnetiske kuler-kompatibel automatisk plate skiver eller vakuum manifolder kan brukes, men vil testing være nødvendig å definere innstillinger som maksimerer vasking effektiviteten og minimere perle tap under vask. Innledende testing av vulsten restitusjon etter vasking anbefales uavhengig av den bestemte plate skive benyttes.

<td> LOD
Mat Matrix Metric 2 hr 4 timer 24 timer
MLD 50 / g mat MLD 50 / brønn MLD 50 / g mat MLD 50 / brønn MLD 50 / g mat MLD 50 / brønn
Melk 300 58 100 19 30 6
LOQ 1000 193 300 58 100 19
EC 50 2404 464 590 114 92 18
Friske tomater LOD 1000 91 300 27 30 3
LOQ 1000 91 1000 91 100 9
EC 50 7561 687 1932 176 229 21

Tabell 5. Deteksjonsgrenser (LOD), grensene for kvantifisering (LOQ), og halv maximal effektive konsentrasjon (EC 50) på 2% melk og frisk tomat testing er vist i figur 2A. EC 50 er avledet fra det sigmoidal dose-respons kurvetilpasning, mens LOD og LOQ er definert som den laveste konsentrasjon datapunkt som faller enten 3 eller 10 standardavvik under ingen Bont kontroller (n = 6), henholdsvis. Dataene er presentert i begge MLD 50 / g mat og total MLD 50 s testede per brønn i 200 pl prøvevolum.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne protokollen beskriver prosedyrer for kvantifisering Bont / En kompleks, holotoxin, eller Clostridium kultur supernatant i komplekse matriser. Protokollen er det samme, men, når testing andre bont serotyper (f.eks bont / B, E og F) med de respektive matrise-analyser 56,60, selv om måle-følsomheten vil variere mellom serotyper og analyser. Denne protokollen ikke står for hver type prøve mulig og kan kreves noen modifikasjoner avhengig av den spesifikke utvalget sammensetning og ønsket program. Matriser kan inkludere mat prøver (f.eks mat provokasjonstest) eller farmasøytisk hjelpemiddel buffere (f.eks Bont-basert medikament produkt-testing). Complex er matvarer (for eksempel animalsk vev eller miljø) flytende og faste prøver bør behandles som smaksprøver. Denne protokollen bruker 200 ul / brønn testvolumer, men så lite som 50 ul / brønn kan testes med en tilsvarende justering av volumet av 10x Binding buffer. Prøver som er mindre enn 50 pl må fortynnes med GPB eller PBS til ≥ 50 ul før testing.

Den svært variabel karakter av næringsmidler representerer en særlig utfordring for Bont deteksjon og kvantifisering i mat. Prøve pH, viskositet, ionestyrke, og tilstedeværelsen av partikler kan alle potensielt påvirke aktiviteten av toksinet innen næringsmiddel matrise og nødvendiggjøre at toksinet bli isolert fra mat for nøyaktig, in vitro kvantifisering. Mange matvarer eller toksin preparater også inneholde endogene proteaser som må fjernes eller inaktivert ved bruk av protein-baserte pressen for å sikre at bare bont-spesifikk protease-aktivitet blir målt. Selv enkle, veldefinerte buffer matriser, for eksempel farmasøytisk hjelpemiddel buffere, kan inneholde stoffer som forstyrrer Bont aktivitet som må fjernes før kvantifisering 35,56-59,61. Immunoutfelling tilbyr en rask, svært serotype-spesifikke Bont Purifiseringen metoden, men krever høy affinitet antistoffer å isolere de lave giftkonsentrasjoner som finnes i "virkelige verden" mat, miljø, og farmasøytiske prøver.

Den beskrevne protokollen renser toksinet bruker paramagnetiske kuler belagt med anti-Bont / A antistoffer rettet mot toksinet tunge kjeden reseptor domenet til Bont / En kjerne holotoxin 56. Clostridium arter, men naturlig produsere toksin komplekser som består av kjernen holotoxin i foreningen med handlingsplanene 62-64. De nasjonale handlingsplanene beskytte toksinet fra protease angrep i ​​mage-tarmkanalen og antas å forenkle toksin transport over tarmen epitel 63,65. De NAP inhibere bindingen av IP-A bead anti-bont / A antistoffer mot kjernen holotoxin (data ikke vist). Denne hemmingen er lettet ved å øke utvalget pH til over ~ 6,25, forårsaker Bont / En kompleks å distansere inn holotoxin og naps og tillater effektiv toksinbinding til IP-A perler 66.. Av denne grunn, justering av prøven til pH over 6,5 er kritisk for å lykkes i analysen (figur 5B). Den 10 x bindingsbuffer anvendes i protokollen inneholder et buffermiddel for å bidra til å heve pH-verdien til standard analysebetingelser. Imidlertid kan mange sure matvarer velde bufferkapasiteten av Binding buffer. Den ekstra 10x Nøytralisering buffer i stor grad øker prøvebufferkapasitet, og bør nøytralisere de fleste mat-matriser.

En annen viktig parameter for analysen er prøven ionestyrke. Klargjøring av prøven ved sentrifugering er påkrevet for effektiv vulsten vasking og gjenvinning etter immunoutfelling. Testing med friske tomater avslørte at ingen Bont / A bedring ble observert da prøvene ble bare behandlet og sentrifugeres. Vi antok at Bont / A kan assosiere med tomatkjøttet forårsaker den til pellets under sentrifugering og bli borte fratestet supernatant. Vi har funnet at å øke ionestyrken, eller, mer vesentlig, å nøytralisere pH begrenset interaksjoner mellom bont og matrisen som resulterer i forbedret gjenvinning av toksin (figur 5B). Selv om det ikke er nødvendig for bont utvinning, er det forventet, selv om det ikke er vist, at høyere saltkonsentrasjoner vil også øke stringensen av immunopresipitering og resultere i mindre ikke-spesifikk protein utvinning, spesielt ved lave salt matvarer.

Prøve pH og ionestyrke justering i protokollen blir utført ved tilsetning av 10 x Nøytralisering buffer og bør være forenlig med en lang rekke næringsmidler. Mens 10x Neutralization buffer har en høy bufferkapasitet, kan noen svært sure matvarer krever ekstra pH justering. Testing av prøve pH følgende buffer tillegg anbefales hvis dårlig analyseytelsen er observert og prøvevolum tillater. Ytterligere justering av pH kan oppnås ved tilsetning av small volumer av 1 M HEPES pH 8, om nødvendig. Den ekstra NaCl innført av 10x Nøytralisering buffer bør være akseptabelt for alle bortsett fra de saltiest matvarer, men kan 10x Nøytralisering buffer bli erstattet med 1 M HEPES pH 8 hvis dårlige resultater ses med en gitt matvare. Ingen signifikante forskjeller har blitt observert ved testing den beskrevne protokollen på NaCl konsentrasjoner opp til 1,2 M i PBS.

Selv om denne protokoll kan anvendes på de fleste av prøvene, kan matvarer på ytterpunktene av pH, ionestyrke, og / eller protease-innhold ikke gir gode resultater med analysen. Enkelte matvarer kan også være for viskøst etter tilsetning av GPB, noe som resulterer i dårlig kule utvinning. Predilution av prøver med en enkelt buffer slik som PBS, kan bedre resultater. Økning av antallet vaskinger eller vask stringens (ved å øke NaCl-konsentrasjonen), og å øke konsentrasjonen av EDTA-fri proteaseinhibitorer kan også bedre resultater hvis ikke-spesifikk protease forurensedeion er observert. Instrument renslighet er også svært viktig når du bruker automatisk plate vasking. Forurensning av VVS-og injeksjonsdyser med proteaser (for eksempel trypsin) fra andre laboratorieanalyser kan føre til utilsiktet innføring av proteaser i løpet av analysen. Grundig rengjøring av platen vaskemaskin i henhold til brukerens produsentens håndbok anbefales før du kjører analysen.

De BoTest Matrix analysene er de første kommersialiserte, aktivitetsbaserte analyser for Bont deteksjon og kvantifisering i komplekse matriser. Sammenlignet med vanlig mus bioassay, er analysen raske, rimeligere, og lar høy gjennomstrømming testing uten behov for spesialiserte anlegg eller etiske spørsmål angående dyr bruk 56. Andre in vitro Bont deteksjonsmetoder har blitt beskrevet, men har ikke vist seg å være kompatible med komplekse prøve matriser, krever spesialisert utstyr, eller ikke er kommersielt tilgjle 35,42-44,46-55. Assayene er også aktivitetsbaserte assays som måler toksin endoprotease-aktivitet, mens tradisjonell enzyme-linked immunosorbantkolonne assay (ELISA) teknikker bare rapportere toxin masse. Aktivitet basert ELISA-analyser, er tidligere beskrevet, men disse analysene ble ikke vist å virke sammen med mat matriser, og ikke omfatter rensing av toksinet fra prøven matrisen 41.. Betydelig undervurdering av giftigheten av komplekse prøver kan oppstå hvis toksinet ikke er renset fra prøven siden matrise forbindelser ofte forstyrre Bont aktivitet 35,56-59.

Når protokollen er mestret, kan bli gjort endringer for å øke prøvevolum og øke sample følsomhet. For eksempel kan bindingen av toksinet til perlene skal utføres i større, bulk prøver (for eksempel 10 ml eller mer) før samlingen ved sentrifugering. Disse perler kan deretter tilsettes til en 96-brønns plate og undersøkes etter den beskrivended protokollen. Økninger i følsomheten større enn en tømmerstokk har blitt observert med økt utvalgsstørrelse 56. Således kan den beskrevne protokoll brukes med større volum prøver for å påvise selv spormengder av bont som finnes i prøver som kan gå ubemerket av muse bioassay.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

FM Dunning, TM Piazza, F. Zeytin, og WC Tucker er ansatte eller eiere av BioSentinel Inc. BioSentinel tiden produserer og har kommersialisert noen av reagenser som presenteres i denne rapporten.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke H. Olivares og D. Ruge for verdifulle diskusjoner og råd. Denne forskningen ble støttet delvis av en NSF SBIR award (IIP-1127245 til BioSentinel Inc.) og en Department of Defense kontrakt (W81XWH-07-2-0045 til BioSentinel Inc.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit BioSentinel A1015 Detection kits for BoNT/B and F are also available.
Varioskan Flash fluorescence microplate reader Thermo Fisher Scientific 5250040 Most monochromator- or filter-based units with 434 nm excitation and 470 nm and 526 nm emission capability can be used.
96-well Magnetic Bead Separation Plate V&P Scientific VP771H Other magnetic plates may be used, but the plate should be designed to separate the beads to the side of the well.
Magnetic Bead-Compatible Plate Washer BioTek ELx405 VSRM Optional, only required for automated plate washing.  Other magnetic bead-compatible plate washers may also be used, but should be tested before use.
Microcentrifuge Optional, only required for samples needing centrifugation.
MixMate plate mixer Eppendorf 22674200
Orbital Shaker Used at room temperature or at 25 °C If temperature control is available
EDTA-free Protease Inhibitor Tablets Roche 4693132001 Only required for food or environmental testing. Protease inhibitors must be EDTA-free.
BoNT/A Metabiologics Optional, only required for standardization and quantification purposes
Black, Flat-bottomed 96-well Plates NUNC 237105 Plates should not be treated
96-well Plate Sealing Tape Thermo Fisher Scientific 15036

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arnon, S. S., et al. Botulinum toxin as a biological weapon: medical and public health management. J. Am. Med. Assoc. 285, 1059-1070 (2001).
  2. Gill, D. M. Bacterial toxins: a table of lethal amounts. Microbiol. Rev. 46, 86-94 (1982).
  3. Montal, M. Botulinum neurotoxin: a marvel of protein design. Annu. Rev. Biochem. 79, 591-617 (2010).
  4. Lacy, D. B., Stevens, R. C. Sequence homology and structural analysis of the clostridial neurotoxins. J. Mol. Biol. 291, 1091-1104 (1999).
  5. Montecucco, C., Schiavo, G. Structure and function of tetanus and botulinum neurotoxins. Q. Rev. Biophys. 28, 423-472 (1995).
  6. Ahnert-Hilger, G., Munster-Wandowski, A., Holtje, M. Synaptic vesicle proteins: targets and routes for botulinum neurotoxins. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 364, 159-177 (2013).
  7. Yamasaki, S., et al. Cleavage of members of the synaptobrevin/VAMP family by types D and F botulinal neurotoxins and tetanus toxin. J. Biol. Chem. 269, 12764-12772 (1994).
  8. Schiavo, G., et al. Identification of the nerve terminal targets of botulinum neurotoxin serotypes A, D, and E. J. Biol. Chem. 268, 23784-23787 (1993).
  9. Schiavo, G., et al. Tetanus and botulinum-B neurotoxins block neurotransmitter release by proteolytic cleavage of synaptobrevin. Nature. 359, 832-835 (1992).
  10. Schiavo, G., et al. Botulinum G neurotoxin cleaves VAMP/synaptobrevin at a single Ala-Ala peptide bond. J. Biol. Chem. 269, 20213-20216 (1994).
  11. Rossetto, O., et al. SNARE motif and neurotoxins. Nature. 372, 415-416 (1994).
  12. Montecucco, C., Schiavo, G. Mechanism of action of tetanus and botulinum neurotoxins. Mol. Microbiol. 13, 1-8 (1994).
  13. Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the synaptic protein SNAP-25. Nature. 365, 160-163 (1993).
  14. Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin C1 blocks neurotransmitter release by means of cleaving HPC-1/syntaxin. EMBO J. 12, 4821-4828 (1993).
  15. Cherington, M. Clinical spectrum of botulism. Muscle Nerve. 21, 701-710 (1998).
  16. Lindstrom, M., Korkeala, H. Laboratory diagnostics of botulism. Clin. Microbiol. Rev. 19, 298-314 (2006).
  17. Werner, S. B., Passaro, D., McGee, J., Schechter, R., Vugia, D. J. Wound botulism in California, 1951-1998: recent epidemic in heroin injectors. Clin. Infect. Dis. 31, 1018-1024 (2000).
  18. Passaro, D. J., Werner, S. B., McGee, J., MacKenzie, W. R., Vugia, D. J. Wound botulism associated with black tar heroin among injecting drug users. J. Am. Med. Assoc. 279, 859-863 (1998).
  19. Brook, I. Infant botulism. J. Perinatol. 27, 175-180 (2007).
  20. Arnon, S. S. Honey, infant botulism and the sudden infant death syndrome. West J. Med. 132, 58-59 (1980).
  21. Arnon, S. S. Infant botulism. Annu. Rev. Med. 31, 541-560 (1980).
  22. Peck, M. W., Stringer, S. C., Carter, A. T. Clostridium botulinum in the post-genomic era. Food Microbiol. 28, 183-191 (2011).
  23. Sharma, S. K., Whiting, R. C. Methods for detection of Clostridium botulinum toxin in foods. J. Food Prot. 68, 1256-1263 (2005).
  24. Sobel, J. Botulism. Clin. Infect. Dis. 41, 1167-1173 (2005).
  25. Chen, S. Clinical uses of botulinum neurotoxins: current indications, limitations and future developments. Toxins. 4, 913-939 (2012).
  26. Sinha, D., Karri, K., Arunkalaivanan, A. S. Applications of Botulinum toxin in urogynaecology. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 133, 4-11 (2007).
  27. Dmochowski, R., Sand, P. K. Botulinum toxin A in the overactive bladder: current status and future directions. BJU Int. 99, 247-262 (2007).
  28. Benecke, R., Dressler, D. Botulinum toxin treatment of axial and cervical dystonia. Disabil. Rehabil. 29, 1769-1777 (2007).
  29. Hunt, T., Clarke, K. Potency evaluation of a formulated drug product containing 150-kd botulinum neurotoxin type A. Clin. Neuropharmacol. 32, 28-31 (2009).
  30. Marchetti, A., et al. Retrospective evaluation of the dose of Dysport and BOTOX in the management of cervical dystonia and blepharospasm the REAL DOSE study. Mov. Disord. 20, 937-944 (2005).
  31. Wohlfarth, K., Sycha, T., Ranoux, D., Naver, H., Caird, D. Dose equivalence of two commercial preparations of botulinum neurotoxin type A: time for a reassessment. 25, 1573-1584 (2009).
  32. AOAC International, Clostridium botulinum and its toxins in foods (method 977.26 section 17.7.01). (2001).
  33. Schantz, E. J., Kautter, D. A. Microbiological methods: standardized assay for Clostridium botulinum toxins. J. AOAC. 61, 96-99 (1978).
  34. Ferreira, J. L. Comparison of amplified ELISA and mouse bioassay procedures for determination of botulinal toxins A, B, E, and F. J. AOAC. Int. 84, 85-88 (2001).
  35. Directive 2003/15/EC of the European Parliament and of the Council. Official Journal of the European Union. (2003).
  36. Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM Scientific Workshop on Alternative Methods to Refine, Reduce or Replace the Mouse LD50 Assay for Botulinum Toxin Testing. Report No. 08-6416, NIH. (2008).
  37. Bitz, S. The botulinum neurotoxin LD50 test - problems and solutions. ALTEX. 27, 114-116 (2010).
  38. Balls, M. Replacing the animal testing of botulinum toxin: time to smooth out the wrinkles. Altern. Lab. Anim. 38, 1-2 (2010).
  39. Balls, M. Botulinum toxin testing in animals: the questions remain unanswered. Altern. Lab. Anim. 31, 611-615 (2003).
  40. Singh, A. K., Stanker, L. H., Sharma, S. K. Botulinum neurotoxin: where are we with detection technologies. Crit. Rev. Microbiol. 39, 43-56 (2013).
  41. Liu, Y. Y., Rigsby, P., Sesardic, D., Marks, J. D., Jones, R. G. A functional dual-coated (FDC) microtiter plate method to replace the botulinum toxin LD50 test. Anal. Biochem. 425, 28-35 (2012).
  42. Ouimet, T., Duquesnoy, S., Poras, H., Fournie-Zaluski, M. C., Roques, B. P. Comparison of Fluorigenic Peptide Substrates PL50, SNAPtide, and BoTest A/E for BoNT/A Detection and Quantification: Exosite Binding Confers High-Assay Sensitivity. J. Biomol. Screen. (2013).
  43. Scotcher, M. C., Cheng, L. W., Stanker, L. H. Detection of botulinum neurotoxin serotype B at sub mouse LD(50) levels by a sandwich immunoassay and its application to toxin detection in milk. PLoS One. 5, (2010).
  44. Mason, J. T., Xu, L., Sheng, Z. M., O'Leary, T. J. A liposome-PCR assay for the ultrasensitive detection of biological toxins. Nat. Biotechnol. 24, 555-557 (2006).
  45. Ruge, D. R., et al. Detection of six serotypes of botulinum neurotoxin using fluorogenic reporters. Anal. Biochem. 411, 200-209 (2011).
  46. Hines, H. B., et al. Use of a recombinant fluorescent substrate with cleavage sites for all botulinum neurotoxins in high-throughput screening of natural product extracts for inhibitors of serotypes A, B, and E. Appl. Environ. Microbiol. 74, 653-659 (2008).
  47. Gilmore, M. A., et al. Depolarization after resonance energy transfer (DARET): a sensitive fluorescence-based assay for botulinum neurotoxin protease activity. Anal. Biochem. 413, 36-42 (2011).
  48. Capek, P., Dickerson, T. J. Sensing the deadliest toxin: technologies for botulinum neurotoxin detection. Toxins. 2, 24-53 (2010).
  49. Bagramyan, K., Barash, J. R., Arnon, S. S., Kalkum, M. Attomolar detection of botulinum toxin type A in complex biological matrices. PLoS One. 3, (2008).
  50. Wang, D., Baudys, J., Kalb, S. R., Barr, J. R. Improved detection of botulinum neurotoxin type A in stool by mass spectrometry. Anal. Biochem. 412, 67-73 (2011).
  51. Parks, B. A., et al. Quantification of botulinum neurotoxin serotypes A and B from serum using mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 9047-9053 (2011).
  52. Kalb, S. R., Goodnough, M. C., Malizio, C. J., Pirkle, J. L., Barr, J. R. Detection of botulinum neurotoxin A in a spiked milk sample with subtype identification through toxin proteomics. Anal. Chem. 77, 6140-6146 (2005).
  53. Kalb, S. R., et al. The use of Endopep-MS for the detection of botulinum toxins A, B, E, and F in serum and stool samples. Anal. Biochem. 351, 84-92 (2006).
  54. Boyer, A. E., et al. From the mouse to the mass spectrometer: detection and differentiation of the endoproteinase activities of botulinum neurotoxins A-G by mass spectrometry. Anal. Chem. 77, 3916-3924 (2005).
  55. Barr, J. R., et al. Botulinum neurotoxin detection and differentiation by mass spectrometry. Emerg. Infect. Dis. 11, 1578-1583 (2005).
  56. Dunning, F. M., et al. Detection of botulinum neurotoxin serotype A, B, and F proteolytic activity in complex matrices with picomolar to femtomolar sensitivity. Appl. Environ. Microbiol. 78, 7687-7697 (2012).
  57. Jones, R. G., Ochiai, M., Liu, Y., Ekong, T., Sesardic, D. Development of improved SNAP25 endopeptidase immuno-assays for botulinum type A and E toxins. J. Immunol. Methods. 329, 92-101 (2008).
  58. Ekong, T. A., Feavers, I. M., Sesardic, D. Recombinant SNAP-25 is an effective substrate for Clostridium botulinum type A toxin endopeptidase activity in vitro. Microbiology. 143 (pt 10), 3337-3347 (1997).
  59. Shone, C. C., Roberts, A. K. Peptide substrate specificity and properties of the zinc-endopeptidase activity of botulinum type B neurotoxin. Eur. J. Biochem. 225, 263-270 (1994).
  60. Piazza, T. M., et al. In vitro detection and quantification of botulinum neurotoxin type e activity in avian blood. Appl. Environ. Microbiol. 77, 7815-7822 (2011).
  61. Mizanur, R. M., Gorbet, J., Swaminathan, S., Ahmed, S. A. Inhibition of catalytic activities of botulinum neurotoxin light chains of serotypes A, B and E by acetate, sulfate and calcium. Int. J. Biochem. Mol. Biol. 3, 313-321 (2012).
  62. Sugii, S., Sakaguchi, G. Molecular construction of Clostridium botulinum type A toxins. Infect. Immun. 12, 1262-1270 (1975).
  63. Sharma, S. K., Ramzan, M. A., Singh, B. R. Separation of the components of type A botulinum neurotoxin complex by electrophoresis. Toxicon. 41, 321-331 (2003).
  64. Bryant, A. M., Davis, J., Cai, S., Singh, B. R. Molecular composition and extinction coefficient of native botulinum neurotoxin complex produced by Clostridium botulinum hall A strain. Protein. J. 32, 106-117 (2013).
  65. Kukreja, R. V., Singh, B. R. Comparative role of neurotoxin-associated proteins in the structural stability and endopeptidase activity of botulinum neurotoxin complex types A and E. 46, 14316-14324 (2007).
  66. Eisele, K. H., Fink, K., Vey, M., Taylor, H. V. Studies on the dissociation of botulinum neurotoxin type A complexes. Toxicon. 57, 555-565 (2011).
Isolering og kvantifisering av Botulinum Neurotoxin fra komplekse matriser med bruk av BoTest Matrix Analyser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dunning, F. M., Piazza, T. M., Zeytin, F. N., Tucker, W. C. Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays. J. Vis. Exp. (85), e51170, doi:10.3791/51170 (2014).More

Dunning, F. M., Piazza, T. M., Zeytin, F. N., Tucker, W. C. Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays. J. Vis. Exp. (85), e51170, doi:10.3791/51170 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter