Den BoTest Matrix botulinum neurotoxin (BoNT) detektionsanalyser snabbt rena och kvantifiera BoNT från en rad olika provmatriser. Här presenterar vi ett protokoll för detektion och kvantifiering av BoNT från både fasta och flytande matriser och visar analysen med Botox, tomater, och mjölk.
Det krävs noggrann detektering och kvantifiering av botulinumtoxin (BoNT) i komplexa matriser för läkemedels-, miljö-, och livsmedelsprov testning. Behövs Rapid BoNT testning av livsmedel under utbrottskriminalteknik, patientens diagnos, och livsmedelssäkerhet testning medan exakt potens tester krävs för BoNT-baserade läkemedlet produkttillverkning och patientsäkerhet. Den används flitigt bioassay med möss för BoNT testning är mycket känslig men saknar precision och kapacitet som behövs för snabb och rutin BoNT testning. Dessutom har bioassay användning av djur lett till samtal med läkemedelsprodukt tillsynsmyndigheter och förespråkare djur-rättigheter i USA och utomlands för att ersätta musen bioassay för BoNT testning. Flera in vitro ersättningsanalyser har utvecklats som fungerar bra med renat BoNT i enkla buffertar, men de flesta har inte visat sig gälla för att testa i mycket komplexa matriser. Här, ett protokoll för detektion avBoNT i komplexa matriser med hjälp av BoTest Matrix analyserna presenteras. Analysen består av tre delar: Den första delen handlar om förberedelse av proverna för testning, är den andra delen ett immunoprecipitation steg med hjälp av anti-BoNT antikroppsbelagda paramagnetiska kulor för att rena BoNT från matrisen, och den tredje delen kvantifierar isolerade BoNT s proteolytiska aktivitet med användning av ett fluorogent reporter. Protokollet som är skriven för hög genomströmning testning i 96-brunnars plattor med användning av både flytande och fasta matriser och kräver ca 2 h av manuell beredning med totala analystider 4-26 h beroende på den provtyp, toxin belastning, och önskad känslighet. Data presenteras för BoNT / A-testning med fosfatbuffrad koksaltlösning, en läkemedelsprodukt, odlingssupernatant, 2% mjölk, och färska tomater och inkluderar diskussion av kritiska parametrar för analys framgång.
Botulinneurotoxiner (BoNTs) är de dödligaste ämnen som är kända, med intravenösa humana dödliga doser beräknas till 1-3 ng / kg 1,2. Sju strukturellt liknande serotyper av BoNT, märkta A till och med G, föreligger, var och en bestående av en tung kedja-domänen är ansvarig för cellbindning, upptag och translokering in i cytosolen och en lätt kedja som kodar för ett zink-endopeptidas 3-5. Den utsökta toxicitet BoNT resultat av delvis dess specifika bindande och träder i motoriska nervceller i den neuromuskulära förbindelsen 6. Väl inne i neuron, den lätta kedjan endopeptidas specifikt klyver en eller flera av den lösliga N-etylmaleimid-känslig faktor fastsättning proteinreceptor (SNARE) proteiner som krävs för vesikelfusion, hämmande neurotransmittorfrisättning och som leder till förlamning 7-14. Allmänt känd som sjukdomen "botulism", förlamning av membranet och interkostal muskler av BoNT slutändan resulterar iandningssvikt och död om inte tidig diagnos och behandling mottas.
Human livsmedelsburna botulism är oftast förknippas med BoNT serotyperna A, B, E, och F (BoNT / A, BoNT / B, etc) och oftast resulterar från intag av förorenad mat 15,16, även om flera fall av sårbotulism rapporterades bland sprutnarkomaner 17,18. I USA, är spädbarn botulism till följd av intag av Clostridium sporer av barn under ett års ålder den vanligaste formen av botulism 19-21. Dock var livsmedelsburna BoNT utbrott till följd av felaktig hemkonservering och livsmedelsförädling rapporterats i både USA och utomlands. Mellan 2000-2009 var minst 338 fall av livsmedelsburna botulism rapporterats över hela världen inklusive sex dödsfall 22. Förmågan att snabbt och känsligt upptäcka livsmedelsburna botulism utbrott är en viktig indikation på att kunna bistå tidig diagnos 23,24. Dessutom kommer detektionsmetoder som tillåter kostnadseffektiv och rutin mat testning leda till förbättrad livsmedelssäkerhet.
BoNT s neuronal specificitet och lång biologisk halveringstid gör det också en potent terapeutiskt. I USA, är BoNT-baserade läkemedel som godkänts av Food and Drug Administration för behandling av kosmetiska villkor och neuromuskulära relaterade sjukdomar inklusive glabellaveck, cervikal dystoni, migrän, överaktiv blåsa och skelning. Många program "off-label" är dokumenterade, inklusive höga doser behandlingar för svår muskeldysfunktion 25-28. Exakt toxin kvantifiering är avgörande för korrekt dosering, eftersom underdosering kan leda till ineffektiv behandling medan överdosering sätter patienter med risk för potentiellt skadliga biverkningar. Tyvärr är ingen standardiserad potens analysprotokoll delas mellan tillverkare, vilket resulterar i definitionsenhet ojämlikheter mellan BoNT-baserade läkemedlet produCTS 29-31.
Den standardtest för BoNT är bioassay med möss där BoNT-innehållande prover injiceras intraperitonealt på möss och antalet dödsfall registrerats under 1-7 dagar 16,32,33. Musen bioassay är mycket känslig med detektionsgräns (LOD) på 5-10 pg BoNT / A 34, men etiska oro över djuranvändning, de höga kostnaderna för att utbilda personal och upprätthålla djuranläggningar, långa analystider, och bristen på standardiserade protokoll ledde till samtal för att utveckla standardiserade, djurfria BoNT testning och kvantifieringsmetoder 35-39. Nyligen har flera alternativa BoNT kvantifieringsmetoderna utvecklats som erbjuder mus eller nästan bioassay på möss känslighet 40-49. Dessa metoder använder ofta fluorescens, masspektrometri, eller immunologiska metoder och erbjuda analystider avsevärt kortare än bioassay med möss utan djur. Mass-spektrometri strategier i kombination med immunologisk techniqderingar har visat att detektera och kvantifiera BoNT som finns i livsmedel och andra komplexa prover, men krav utbildning av personal och specialutrustning gräns dessa analyser 50-55. De flesta andra alternativa analyser inte är lätt tillämpliga på komplexa provtestning eller saknar kapacitet som krävs för rutin BoNT testning. Den mycket varierande karaktär av livsmedelsprov viskositet, pH, salthalt, och matrisbeståndsdelar utgör en särskilt svår utmaning när man försöker utveckla in vitro analysmetoder med känslighet för att matcha den extrema styrkan av BoNT. Dessutom, även enkla och förhållandevis godartade buffertsystem, såsom de som följer av resuspension av BoNT-baserade läkemedelsprodukter, innehåller salt, albumin, och socker stabilisatorer (dvs. hjälpämnen) som väsentligt påverkar in vitro BoNT potens 56. Toxin rening krävs för noggrann aktivitetstestning av alla utom de enklaste av proverna 56-59.
DenBoTest Matrix-analyser var utformade för snabb, hög genomströmning, och konsekvent kvantifiering av BoNT från mycket komplexa prover med utrustning som vanligen finns i forskningslaboratorier 56,60. Dessa analyser använder paramagnetiska pärlor kovalent kopplade till serotyp-specifika anti-Bont antikroppar att binda och binda BoNT ur ett prov och sedan ta bort störande matrisföreningar genom tvättning. Efter tvätt, är bunden BoNT proteolytiska aktiviteten sedan kvantifieras i en optimerad reaktionsbuffert med hjälp av en reporter kompatibelt med BoNT serotyp som testas. Dessa reportrar är fluorogena proteiner som består av en N-terminal cyan fluorescerande protein (GFP)-grupp och en C-terminal gula fluorescerande proteinderivat (Venus)-del förenade genom en BoNT substrat, SNAP25 rester 141-206 eller synaptobrevin rester 33-94 utgör den BoTest A / E eller B / D / F / G reportrar, respektive 45. Reporter klyvning med BoNT övervakas med Försters resonansenergiöverföring (FRET). När than reporter är intakt, excitation av den gemensamma fiskeripolitiken leder FRET till Venus, härdning CFP utsläpp och spännande Venus utsläpp. Klyvning av reporter av BoNT förhindrar FRET, vilket leder till en ökning av GFP emission och minskning i Venus emission. BoNT aktivitet kan sedan mätas kvantitativt med hjälp av förhållandet mellan den gemensamma fiskeripolitiken och Venus utsläpp. LOD under 3 pg är möjligt från en mängd olika livsmedel med en hög genomströmning 96-brunnar format 56. Ökad känslighet kan erhållas med användning av större provvolymer, eftersom analysen möjliggör koncentration av toxinet på pärlans yta.
De BoTest Matrix analyser för BoNTs A, B, E, och F har utvecklats och testats med livsmedel, läkemedel, och miljöprover 56,60. Här beskriver vi rutiner för att utföra dessa analyser för detektion av BoNT i låg komplexitet (t.ex. läkemedel, BoNT i buffert) och hög komplexitet (t.ex. livsmedel, miljö) prover. Särskilda bearbetningsmetoderflera provtyper behandlas i detta protokoll och provtyper som inte beskrivs här kan oftast anpassas med hjälp av en kombination av de presenterade metoderna. Protokollet har utvecklats och testats med BoNT / A, men kan anpassas till andra BoNT serotyper använder sina respektive analyser som visats på annat håll 56,60.
Detta protokoll beskriver förfaranden för att kvantifiera BoNT / Komplex, holotoxin eller Clostridium odlingssupematant i komplexa matriser. Protokollet är densamma, men när man testar andra BoNT serotyper (t.ex. BoNT / B, E, och F) med deras respektive Matrix analyser 56,60, även om analyskänsligheten varierar mellan serotyper och analyser. Detta protokoll tar inte hänsyn till varje typ av prov är möjligt och vissa modifieringar kan krävas beroende på det specifika provet sammans…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka H. Olivares och D. Ruge för värdefulla diskussioner och rådgivning. Denna forskning stöds delvis av en NSF SBIR utmärkelse (IIP-1.127.245 till BioSentinel Inc.) samt en försvarsdepartementet kontrakt (W81XWH-07-2-0045 till BioSentinel Inc.).
BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit | BioSentinel | A1015 | Detection kits for BoNT/B and F are also available. |
Varioskan Flash fluorescence microplate reader | Thermo-Fisher Scientific | 5250040 | Most monochromator- or filter-based units with 434 nm excitation and 470 and 526 nm emission capability can be used. |
96-well Magnetic Bead Separation Plate | V&P Scientific | VP771H | Other magnetic plates may be used, but the plate should be designed to separate the beads to the side of the well. |
Magnetic Bead-Compatible Plate Washer | BioTek | ELx405 VSRM | Optional, only required for automated plate washing. Other magnetic bead-compatible plate washers may also be used, but should be tested before use. |
Microcentrifuge | Various | N/A | Optional, only required for samples needing centrifugation. |
MixMate plate mixer | Eppendorf | 22674200 | |
Orbital Shaker | Various | N/A | Used at room temperature or at 25 °C If temperature control is available |
EDTA-free Protease Inhibitor Tablets | Roche | 4693132001 | Only required for food or environmental testing. Protease inhibitors must be EDTA-free. |
BoNT/A | Metabiologics | N/A | Optional, only required for standardization and quantification purposes |
Black, Flat-bottomed 96-well Plates | NUNC | 237105 | Plates should not be treated |
96-well Plate Sealing Tape | Thermo Scientific | 15036 |