Summary
Bakteriecellevæggen består af peptidoglycan, et makromolekylært netværk af sukkerstrenge, der krydses af peptider. Ultra Performance Liquid Chromatography giver høj opløsning og gennemløb for nye opdagelser af peptidoglycan sammensætning. Vi præsenterer en procedure for isolering af cellevægge (sacculi) og deres efterfølgende forberedelse til analyse via UPLC.
Abstract
Bakteriecellevæggen er afgørende for bestemmelsen af celleform under vækst og division og opretholder cellernes mekaniske integritet i lyset af turgortryk flere atmosfærer i størrelse. På tværs af de forskellige former og størrelser af bakterieriget, er cellevæggen består af peptidoglycan, et makromolekylært netværk af sukker tråde crosslinked af korte peptider. Peptidoglycans centrale betydning for bakteriel fysiologi ligger til grund for dets anvendelse som et antibiotikummål og har motiveret genetiske, strukturelle og cellebiologiske undersøgelser af, hvordan det er robust samlet under vækst og division. Ikke desto mindre er der stadig behov for omfattende undersøgelser for fuldt ud at karakterisere de vigtigste enzymatiske aktiviteter i peptidoglycansyntese og den kemiske sammensætning af bakteriecellevægge. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) er en kraftfuld analysemetode til kvantificering af forskelle i den kemiske sammensætning af væggene i bakterier dyrket under en række miljømæssige og genetiske forhold, men dens gennemløb er ofte begrænset. Her præsenterer vi en enkel procedure for isolering og forberedelse af bakteriecellevægge til biologiske analyser af peptidoglycan via HPLC og Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), en udvidelse af HPLC, der bruger pumper til at levere ultrahøje tryk på op til 15.000 psi sammenlignet med 6.000 psi til HPLC. I kombination med forberedelsen af bakterielle cellevægge præsenteret her, vil lavvolumenprøveinjektorer, detektorer med høje prøvetagningshastigheder, mindre prøvemængder og kortere køretider for UPLC muliggøre høj opløsning og gennemstrømning for nye opdagelser af peptidoglycan sammensætning og grundlæggende bakteriecellebiologi i de fleste biologiske laboratorier med adgang til en ultracentrifuge og UPLC.
Introduction
Målet med den metode, der er beskrevet heri, er at isolere intakte bakteriecellevægge (sacculi) og fordøje peptidoglycan (PG), således at Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) kan bruges til at give oplysninger såsom identiteten af muropeptidkomponenterne og deres koncentrationer, den gennemsnitlige længde af glykaflestrenge og den brøkdel af materiale, der er involveret i krydsninger mellem tråde. For en detaljeret diskussion af PG biokemi og muropeptide arter er der flere fremragende anmeldelser, der beskriver PG-struktur og dens rolle i infektion, resistens, morfogenese og vækst1-6. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) til PG-analyse blev oprindeligt udviklet af Glauner og Schwarz i 1980'erne og er for nylig blevet forbedret og anvendt i vid udstrækning i laboratorierne i Miguel de Pedro og Waldemar Vollmer. Tidligere metoder udnyttede aminosyreanalyse eller papirkromatografi, tidskrævende og kedelige teknikker, der ikke giver nøjagtige eller fuldstændige vurderinger af cellevægskomponenter.
UPLC-analyse kan nemt implementeres i ethvert grundforskningslaboratorium, der har adgang til en ultracentrifuge og UPLC. Uplc-metoden, som vi præsenterer nedenfor, isolerer komplette sacculi og giver dermed omfattende, kvantitative oplysninger om alle kemiske arter deri. Denne metode giver præcis kvantificering af alle muropeptider på tværs af en population af bakterier, alt sammen inden for en 20 minutters UPLC-kørsel. Gennemførelsen af denne metode involverer kun grundlæggende laboratoriefærdigheder uden betydelige finansielle investeringer i materialer. For at udføre trinene i denne metode behøver forskerne kun at være dygtige til pipetter, forberede buffere og enzymer og justere pH, hvilket gør det tilgængeligt for en lang række videnskabelige discipliner. Valget af enzymer, der anvendes i denne protokol, afhænger af den bakterieart, der analyseres. den her beskrevne protokol er nyttig for Escherichia coliog har generelt vist sig at være tilstrækkelig til at isolere sacculi fra andre Gram-negative organismer. Høring af litteraturen anbefales, når du anvender denne metode på Gram-positive bakterier; i disse arter har sacculus rensning traditionelt været vanskeligere. Især kan denne metode skal ændres med hensyn til enzymvalg og længden af fordøjelsestider for at imødekomme de tykkere vægge og tilbehørspolymerer såsom teikolesyrer af gram-positive bakterier. Det første enzym i denne protokol kløver ydre membran lipoprotein (såsom Braun's lipoprotein, eller Lpp) vedhæftet fil til peptidoglycan, og dermed frigive alle, men C-terminal di- (eller tri-) peptid af Lpp fra cellevæggen. Dette trin er nødvendigt ved undersøgelse af Enterobacteria, men mange andre Gram-negative bakterier har ingen Lpp-ækvivalenter, og derfor kan dette trin springes over. Et andet enzym kløver specifikt efter den muramiske syrekomponent i peptidoglycanen og opløser den disaccharidunderenhed, der danner muropeptidarten. For at give en nøjagtig vurdering af PG's arkitektur skal man være omhyggelig med at fordøje sacculi for at forhindre spaltning af krydsbroerne eller nogen anden del af peptidstammen.
Selvom de kemiske sammensætninger af peptidoglycan fra over 100 stammer af ~ 40 bakteriearter er blevet analyseret af HPLC, er der ikke udført analyser med UPLC-teknologi. Derudover har tidligere arbejde karakteriseret peptidoglycan fra kun en lille brøkdel af det bakterielle domæne, delvis begrænset af gennemløbet af HPLC. Derfor vil formidling af denne metode til så mange forskere som muligt og implementering på UPLC-platforme være afgørende for at drive fysiologiske undersøgelser af den store del af bakteriearter, hvis peptidoglycan endnu ikke er kategoriseret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dyrk bakteriekulturer i 2,5 ml medier natten over
Tilbage-fortyndet kulturer 1:100 i 250 ml friske medier og vokse til OD600 af 0,7-0,8. Forbered en opløsning på 6% natrium dodecyl sulfat (SDS) i vand.
ADVARSEL: SDS-pulver er farligt - undgå at indånde SDS-pulver; bære en maske over næse og mund.
2. Dag 1 - Lysing bakteriekulturer udføres i løbet af en dag og natten over
- Mens fortyndede kulturer vokser, skal du oprette et kogende vandbad på en kogeplade i et 1 L-bægerglas. Når vandet koger, tilsættes 6 ml 6 ml 6% SDS til 50 ml polypropylenrør, der tilsættes en lille rørestang til hvert rør, fastgør rørlåg til fingertætte, placer rør i vandbad og tænd omrøring til 500 omdrejninger på kogepladen.
- 250 ml kulturer ved 5.000 × g i 10 minutter ved stuetemperatur og genbrugte pellets i 3 ml medier eller 1x fosfatbufferet saltvand. Rør langsomt celleaffjedring i 50 ml rør med 6% kogende SDS til lyse cellerne (endelig koncentration 4% SDS), mens rørene er nedsænket i det kogende vandbad, og genlukke lågene til finger-stram. Celleaffjedring skal hurtigt overføres til kogende SDS, når de er blevet genbrugt. Pludselige miljøændringer bør undgås, da dette kan forårsage fejlagtig ændring af cellevægsstruktur.
- Dæk kogende vandbad og lad celler koge i 3 timer, kontroller vandstanden med jævne mellemrum og genopfyldning af vandbadet, når det er nødvendigt. Efter 3 timer skal du slukke for varmeelementet på kogepladen og fortsætte med at røre natten over ved 500 omdrejninger i minuttet.
3. Dag 2 - Enzymatiske fordøjelser udføres i løbet af en dag
- Hvis SDS er udfældet i 50 ml rørene natten over, skal vandbadet koge i yderligere 1-2 timer. Tænd en varmeblok til 60 °C. Der fremstilles en 1 mg/ml pronase E i 10 mM Tris-HCl (pH 7,2) + 0,06% w/v NaCl, og Pronase E aktiveres ved 60 °C i mindst 30 min.
- Brug en ultracentrifuge sat til 400.000 × g til at dreje prøver i 20 minutter ved stuetemperatur for at pellet de store PG polymerer og dermed rense dem fra andre cellulære komponenter. Fjern supernatant omhyggeligt, og derefter genbruges hver pellet i stuetemperatur ultrapure vand. BEMÆRK: Resuspensionsvolumen afhænger af mængden af de anvendte ultracentrifugerør; brug et volumen, der fylder rørene mindst halvvejs, men ikke overstiger den maksimale volumen af rørene. Gentag centrifugering/vask, indtil vandet ikke danner bobler under genopførelsen, hvilket indikerer, at SDS er helt fjernet (typisk tre vaske). Stop vask af pellet, hvis der dannes et hvidt bundfald, da dette indikerer, at sacculierne klumper sammen. Klumpning er ikke katastrofalt, men klumper binder sig meget stærkt til plast og glasvarer, der forårsager stort prøvetab. I dette tilfælde skal du fortsætte med protokollen ved hjælp af den klumpede sacculi-prøve.
- På det sidste centrifugerings-/vasketrin blev prøverne genbrugt i 900 μl på 10 mM Tris-HCl (pH 7,2) + 0,06% w/v NaCl og overført til 2 ml rør, der tidligere var stukket med huller i toppe med en lille nål. Der tilsættes 100 μl 1 mg/ml aktiveret Pronase E (100 μg/ml endelig koncentration) til hver prøve og inkuberes ved 60 °C i 2 timer. Indstil en anden varmeblok til 100 °C.
- Pronase E-fordøjelsen standses ved at tilsætte 200 μl 6 % SDS til hver prøve, og prøverne koges i varmeblokken på 100 °C i 30 min. Sæt en anden varmeblok til 37 °C, og lav en 1 mg/ml bestand af muramidase (mutanolysin) i 50 mM fosfatbuffer (pH 4.9).
- Som i trin 3.2 skal du bruge en ultracentrifuge, der er indstillet til 400.000 × g, til at dreje prøver i 20 minutter ved stuetemperatur og vaske med stuetemperatur ultrapure vand, indtil SDS er helt fjernet (typisk tre vasker). Resuspensionsvolumen afhænger af mængden af de anvendte ultracentrifugerør; brug et volumen, der fylder rørene mindst halvvejs, men ikke overstiger den maksimale volumen af rørene.
- På det sidste centrifugerings-/vasketrin blev der udtaget genindsugningsprøver i 200 μl på 50 mM natriumphosphatbuffer (pH 4.9). Dette volumen kan justeres i forhold til mængden af peptidoglycan i prøven og kan være artsafhængige. Hvis der tidligere foreligger rapporter om HPLC-analyse for de pågældende arter, kan dette bind anslås på grundlag af disse kvantantitationer (en samling af HPLC PG-undersøgelser findes i de supplerende oplysninger under reference7). For andre arter kan sacculus prep udføres op til dette trin, og derefter kan forskellige mængder resuspensionsmængder tilføjes for at replikere prøver for at bestemme det minimale volumen, der gør det muligt for PG at forblive i opløsning (se Diskussion for yderligere estimater). Hvis prøven indeholder mere peptidoglycan, øges suspensionsvolumenet; hvis prøven har ringe peptidoglycan, skal resuspensionsvolumen reduceres til mindst 50 μl.
- Prøverne overføres til 1,5 ml rør, og der tilsættes 1 mg/ml muramidase for at give en endelig koncentration på 40 μg/ml. 6-8 timer eller natten over ved 37 °C.
4. Dag 3 - Forberedelse af prøver til UPLC udføres den sidste dag
- Tænd en varmeblok til 100 °C. Kog prøverne uden SDS i 5 minutter for at stoppe den muramidase fordøjelse. Centrifugeprøver i 10 minutter ved 16.000 × g ved stuetemperatur, og overfør derefter supernatanten (muropeptider er nu opløselige) til 13 mm x 100 mm glasrør. Prøv at inddrive så meget supernatant som muligt, at komme meget tæt på pellet uden at forstyrre det.
- PH-værdi justeres ved at tilsætte 500 mM boratbuffer (pH 9) til prøven for en endelig koncentration på 100 mM boratbuffer. Boratbufferen er kompatibel med reduktionsmidlet natrium borohydrid. Tilsæt 1-2 graner natriumborohydrid for at reducere hver prøve og lad reaktionen fortsætte i mindst 30 minutter ved stuetemperatur. ADVARSEL: Natriumborohydrid er meget reaktivt og farligt at håndtere - undgå kontakt med huden (slidhandsker) og undgå kontakt med øjnene (brug sikkerhedsbriller).
- Prøverne justeres til pH 3-4 (det muropeptide isoelektriske punkt er ~3,5) med 50% v/v orthophosphorinsyre ved hjælp af trin på 20 μl indtil pH 6, målt med pH-indikatorpapir, derefter ved hjælp af 2 μl trin. ADVARSEL: Orthophosphorinsyre er ætsende og farlig at håndtere - undgå kontakt med huden (slidhandsker) og undgå kontakt med øjnene (brug sikkerhedsbriller). Prøven skal boble som reaktion på tilsætning af orthophosphorsyre Når prøven holder op med at boble, indikerer dette typisk, at en pH-værdi på 6 er nået. Hvis der ikke forekommer boblende i prøven, kan dette indikere, at mængden af natriumborohydrid tilsat var for lille. I dette tilfælde skal du stoppe med at sænke pH, forsigtigt tilføje et eller to korn af natriumborohydrid, lad reagere i 5-10 minutter og derefter genoptage pH-justering.
- Filterprøven gennem et 0,22 μm sprøjtefilter direkte ind i et UPLC-hætteglas. Hvis der er dannet et bundfald, opvarmes røret med flere gennem en flamme, før det filtreres. Hvis prøven ikke vil blive sprøjtet ind i UPLC-instrumentet inden for dagen, skal den fryses ved -20 °C natten over. Prøverne kan opbevares i op til et år ved -80 °C. Prøven kan optøs ved at passere gennem en flamme flere gange.
- Der indsprøjtes 10 μl af hver prøve på et UPLC-instrument udstyret med en C18 1,7 μm omvendt fasekolonne og en absorbansdetektor, der er indstillet til at overvåge 202-208 nm. Prøver injiceres sekventielt, men autosampler kapaciteter tillader op til 96 prøver, der skal behandles i batch. Der anvendes 50 mM natriumphosphat (pH 4,35) + 0,4% v/v natriumanzid for opløsningsmiddel A og 75 mM natriumphosphat (pH 4,95) + 15% v/v methanol for opløsningsmiddel B. BEMÆRK: Natriumanzid tilsættes for at kompensere for 205 nm absorption af methanol for at undgå baseline afdrift. Sæt strømmen til 0,25 ml/min og brug en lineær hældning over 25 minutter for at opnå 100% opløsningsmiddel B og sekventiel udligning af muropeptider inden for 30 min. Hvis massespektrometri vil blive brugt til at karakterisere muropeptider efter UPLC, skal du samle brøkdele af toppen af interessen for en fraktioneringsopsamler og tørre fraktionerne ved hjælp af en centrifugalfordamper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter fremgangsmåden i figur 1skal den endelige prøve bestå af mindst 200 μl klar opløsning, der er filtreret direkte ind i et UPLC-hætteglas (trin 4.4). UPLC-adskillelsen af de forskellige muropeptider i en bakteriel prøve afhænger af deres relative opløselighed mellem den flydende mobile fase og kolonnens stationære fase. Omvendte fase C18-kolonner giver en stærkt hydrofobisk matrix til adskillelse af muropeptidarterne baseret på hydrofobitet og størrelse8; polære monomerer med lav molekylvægt elute først og apolar, højere molekylære oligomerer elute efter (Figur 2). Et typisk UPLC-resultat er vist i figur 2med detektion via UV-absorbans ved 202-208 nm som en funktion af tiden, der etablerer en bestemt muropeptids retentionstid. Dette repræsentative resultat viser en klar opløsning mellem de fleste muropeptidarter og stærk signalstyrke på tværs af spektret, hvilket muliggør analysiz og gennemsnitlig glycanstrenglængde.
Det sidste trin, der er skitseret i figur 1, omfatter justering af pH og filtrering af fine partikler, der kan tilstoppe de små dimensioner af slangen, der anvendes i UPLC. Hvis en prøve er superkoncentreret, f.eks. Dette tab af opløselighed vil resultere i tilstopning af sprøjtefilteret, der anvendes i trin 4.4, hvilket forhindrer aflejring af muropeptider i UPLC-hætteglasset og/eller tilstopning af UPLC-maskinledningerne og -kolonnen, som er dyre genstande at udskifte. Figur 3viser et eksempel på kromatogram, der afspejler denne afvigende prøvebehandling; der ikke er udviskning af toppe, hvilket resulterer i, at der ikke foreligger data om PG's sammensætning. Hvis pH-vinduet justeres til et godt stykke under muropeptidernes isoelektriske punkt(f.eks. til en pH-værdi på 2), kan det også resultere i udfældning af muropeptider og dermed fraværet af mærkbare toppe fra UPLC-analyse.
Figur 1. Skematisk over sacculi forberedelse. Denne metode er afhængig af iterative runder af ultracentrifugation for at rense SDS væk fra pelleted sacculi.
Figur 2. Eksempel UPLC-kromatogram af PG fra sacculi fordøjet fra E. coli MG1655 celler. Bemærk, at sammenlignelig opløsning af alle muropeptider opnås på 10% af tiden for en typisk HPLC-kørsel. Muropeptidetiketter - M = monomer, D = dimer, T = trimer; (2,3,4,5) angiver antallet af aminosyrestamme peptider modifikationer - G = glycin, der erstatter L-alanin, L = to yderligere aminosyrer fra Pronase E-kavalergang, D = 3,3-diaminopimelic syre (DAP)-DAP crossbridge, N = afslutning af anhydro-muropeptid. For eksempel er D33DL en dimer med 3-aa stilk peptider, forbundet gennem en DAP-DAP crossbridge, der indeholder yderligere to aminosyrer fra Pronase E kavalergang.
Figur 3. Mislykket UPLC-analyse af sacculi fordøjet fra E. coli MG1655 celler. Fraværet af toppe, der tyder på, at der ikke var muropeptider til stede i prøven, skyldes, at muropeptider bryder ud af opløsningen før ekstraktion i et UPLC-hætteglas (trin 4.4). Denne nedbør kan skyldes overkoncentration af muropeptider eller pH er for lav.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et kritisk skridt i denne procedure er trin 3.1 i den anden dag i prøveforberedelsen. Hvis SDS er udfældet natten over, eller hvis prøverne er blevet opbevaret i 4% SDS i flere uger ved stuetemperatur, skal prøverne koges igen i mindst 1 time for at gensoliere SDS. En almindelig årsag til SDS nedbør er brugen af medier med kaliumsalte, så kalium bør undgås i medierne, hvis det er muligt. Som nævnt i afsnittet Repræsentative resultater er det også afgørende at justere pH-normen inden for det isoelektriske punkt i muropeptider (~3.5), men ikke for meget lavere end pH 3, eller materialet kan udfældes. Endelig skal prøvens suspension forekomme i den relevante mængde natriumphosphatbuffer (trin 3.5), som skal bedømmes af forskeren. Når du vælger resuspensionsvolumen af natriumphosphatbuffer, er det vigtigt at overveje, hvor meget muropeptidmateriale der sandsynligvis vil blive genereret fra en bestemt bakteriekultur. Hvis det endelige dyrkningsvolumen f.eks. Hvis forskeren ændrer metoden til 50 ml kulturer, kan prøverne genbruges i 100 μl natriumphosphatbuffer eller derunder. Det er også vigtigt at overveje de forventede mængder peptidoglycan i en art; F.eks. indeholder E. coli-spheroplasts væsentligt mindre peptidoglycan (ca. 7 % af mængden i vilde E. coli-celler 10), og derfor er det hensigtsmæssigt at genopstå i 100 μl eller derunder af natriumphosphatbuffer. Hvis det er vanskeligt at dyrke en bestemt bakterieart eller stamme til store mængder (250 ml), kan det endelige dyrkningsvolumen reduceres, og/eller fortyndingen af nattens kultur kan reduceres. Endelig kræver injektion på et HPLC-system et volumen på mindst 200 μl, mens 10 μl er tilstrækkeligt til et UPLC-system.
Rensningen af PG-komponenter i forskellige organismer eller til forskellige anvendelser kan indstilles ved at variere typen af mobil fase, kolonne og gradient på UPLC-instrumentet. Mobile faser, der er opløsningsmiddelbaserede, såsom acetonometri, kan bruges til at afsalte prøver før massespektrometri. Forskellige kolonne kemier kan også være forpligtet til grundigt at afsalte prøver til efterfølgende analyse. Figur 2 viser den fælles elueringsprofil for muropeptider for den gram-negative stangformede bakterie E. coli MG1655; analysen af PG fra Gram-positive bakterier og/eller arter med andre former kan kræve finjustering af den gradient, der er skitseret i trin 4.5. Selv om UPLC-spektre som den, der er vist i figur 2, genererer mange klasser af oplysninger om peptidoglycan, såsom muropeptididentitet, crosslinking procent og glycan strenglængde, har metoden flere begrænsninger, herunder manglende evne til at kortlægge den geografiske fordeling af strukturelle træk på tværs af sacculi. For eksempel kan hverken placeringen af krydsning langs en glycankæde eller placeringen af bundne lipoproteiner skelnes via HPLC eller UPLC.
Fordelene ved at analysere den kemiske sammensætning af PG med HPLC omfatter højere opløsning, kortere analysetid og nøjagtig kvantantitation11 sammenlignet med traditionelle teknikker som aminosyreanalyse12-14 eller papirkromatografi15,16. UPLC tilbyder højere hastighed og følsomhed end HPLC på grund af højere tryk, der muliggør hurtigere flow og derfor kortere køretider. Opløsningen ofres ikke med UPLC, da kolonnerne i partikelstørrelseskolonner under 2 μm, detektorer med høj samplinghastighed og injektorer med lavt volumen er i stand til at modstå meget høje tryk og dermed fungere nøjagtigt ved høje hastigheder17,18. Dette resulterer i evnen til at analysere prøvemængder i størrelsesordenen 1 μl på ti minutter sammenlignet med 200 μl og timer for HPLC.
Teknikker, der supplerer UPLC, omfatter muropeptidmasseanalyse ved massespektrometri. UPLC er ikke en destruktiv teknik; eluatet fra kolonnen kan opsamles efter UV-detektion og tørres ved hjælp af en centrifugalfordamper, der er almindeligt tilgængelig i de fleste laboratorier. Selv om prøven kan afsalteres for at forberede den til massespektrometri (trin 4.5), matrixassisteret laserafsorption/ionisering - Time Of Flight Mass Spectrometry muliggør analyse uden megen følsomhed over for saltkoncentration19og giver massedata, der er i stand til endelig identifikation af muropeptider. Omkostningerne ved at forberede en cellevægsprøve til UPLC er ca. $ 6-7, inklusive omkostningerne ved enzymer, kemikalier og anvendte forsyninger. I betragtning af dens billige driftsomkostninger, tilgængelighed og demonstrerede nytte for undersøgelser af bakteriecellevæggen, bør UPLC blive den foretrukne metode til høj opløsning, høj gennemløb, nøjagtig kvantificering af peptidoglycan sammensætning på tværs af bakterieriget.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Produktionsomkostningerne for denne artikel blev sponsoreret af Waters Corporation.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH Director's New Innovator Award DP2OD006466 (til K.C.H.). Forfatterne takker Russell Monds for en praktisk demonstration af metoden og for videnskabelige diskussioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pronase E | Amresco | E629 | |
| Mutanolysin from Streptomyces | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452882 | Sodium borohydride is highly reactive and dangerous to handle |
| Orthophosphoric acid | Sigma-Aldrich | 79607 | Orthophosphoric acid is corrosive and dangerous to handle |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 31146 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Sodium azide is a poison |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | |
| Millex 0.22 μm syringe filters | Fisher | SLGVR04NL | |
| pH strips (pH range 0-6) | Fisher | M95863 | |
| 50 ml polypropylene Falcon tubes | VWR | 21008-951 | |
| 13 mm x 100 mm glass tubes | Kimble Chase | 60CM13 | |
| 12 mm x 32 mm screw neck glass recovery vial | Waters | 186000327C | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Ambion | AM9820 | SDS powder is hazardous |
| Instrumentation | |||
| Waters Acquity UPLC H-Class system, including: | |||
| Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN | |||
| Acquity UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager | |||
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm column | |||
| Acquity UPLC PDA Detector | |||
| Waters Fraction Collector III | |||
| Acquity UPLC 30 cm Column Heater/Cooler |
References
- den Blaauwen, T., de Pedro, M. A., Nguyen-Disteche, M., Ayala, J. A.
- Holtje, J. V. Growth of the stress-bearing and shape-maintaining murein sacculus of Escherichia coli. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 181-203 (1998).
- Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology. Nat. Rev. Microbiol. 10, 123-136 (2011).
- Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A.
- Davis, K. M., Weiser, J. N. Modifications to the peptidoglycan backbone help bacteria to establish infection. Infect. Immun. 79, 562-570 (2011).
- Healy, V. L., Lessard, I. A., Roper, D. I., Knox, J. R., Walsh, C. T. Vancomycin resistance in enterococci: reprogramming of the D-ala-D-Ala ligases in bacterial peptidoglycan biosynthesis. Chem. Biol. 7, 109-119 (2000).
- Desmarais, S. M., De Pedro, M. A., Cava, F., Huang, K. C. Peptidoglycan at its peaks: how chromatographic analyses can reveal bacterial cell wall structure and assembly. Mol. Microbiol. 89, 1-13 (2013).
- Glauner, B., Holtje, J., Schwarz, U.
- Glauner, B. Separation and quantification of muropeptides with high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 172 (2), 451-464 (1988).
- Joseleau-Petit, D., Liebart, J. C., Ayala, J. A., D'Ari, R. Unstable Escherichia coli L forms revisited: growth requires peptidoglycan synthesis. J. Bacteriol. 189, 6512-6520 (2007).
- Hakenbeck, R., Holtje, J. V., Labischinski, H. The target of penicillin: the murein sacculus of bacterial cell walls architecture and growth. , Walter De Gruyter Incorporated. (1983).
- Boylen, C. W., Ensign, J. C. Ratio of teichoic acid and peptidoglycan in cell walls of Bacillus subtilis following spire germination and during vegetative growth. J. Bacteriol. 96, 421-427 (1968).
- Sutow, A. B., Welker, N. E. Chemical composition of the cell walls of Bacillus stearothermophilus. J. Bacteriol. 93, 1452-1457 (1967).
- Wang, W. S., Lundgren, D. G. Peptidoglycan of a chemolithotrophic bacterium, Ferrobacillus ferrooxidans. J. Bacteriol. 95, 1851-1856 (1968).
- de la Rosa, E. J., de Pedro, M. A., Vazquez, D. Penicillin binding proteins: role in initiation of murein synthesis in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 5632-5635 (1985).
- Kandler, O., Schleifer, K. H., Dandl, R. Differentiation of Streptococcus faecalis Andrewes and Horder and Streptococcus faecium Orla-Jensen based on the amino acid composition of their murein. J. Bacteriol. 96, 1935-1939 (1968).
- Kumar, A., Saini, G., Nair, A., Sharma, R. UPLC: a preeminent technique in pharmaceutical analysis. Acta Poloniae Pharmaceutica. 69, 371-380 (2012).
- Wilson, I. D., et al. High resolution "ultra performance" liquid chromatography coupled to oa-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies. J. Proteome Res. 4, 591-598 (2005).
- Wieser, A., Schneider, L., Jung, J., Schubert, S. MALDI-TOF MS in microbiological diagnostics-identification of microorganisms and beyond (mini review). Appl. Microbiol. Biotechnol. 93, 965-974 (2012).
