Summary
Bu protokol, sağlam tekrarlanabilirlik ile, bütün haldeki kan, bir damla, insan nötrofil kemotaksisi ölçmek için tasarlanmış bir tahlil göstermektedir. Bu yaklaşım, nötrofil ayrılması için ihtiyaç dışı eden ve deney hazırlama zaman sadece birkaç dakika gerektirir. Mikroakışkan çip bebeklerde veya örnek hacmi sınırlıdır küçük memeliler, zamanla nötrofil kemotaksisinin tekrarlanan ölçü sağlar.
Abstract
Nötrofiller kanda enfeksiyonları ve sayıları karşı korunmada önemli bir rol oynamaktadır sıklıkla klinikte ölçülür. Düşük nötrofil enfeksiyonlar için yüksek riskler için bir uyarı işareti ise kandaki yüksek nötrofil, genellikle devam eden enfeksiyonların bir göstergesidir. Görevlerini başarmak için, nötrofiller de enfeksiyonları oluşabilir dokulara, hayatlarının çoğunu kandan etkili hareket edebilmek için var. Sonuç olarak, göç nötrofillerin yeteneğinde herhangi bir kusur nötrofiller kanda uygun bir sayıda mevcut olsa bile, enfeksiyon risklerini artırabilir. Ancak, klinikte nötrofil göç yeteneğini ölçmek, zaman alıcı, zor bir görev, bir büyük kan hacmi, ve uzman bilgi gerektirir. Bu sınırlamaları çözmek için, çevresi, işlenmemiş kan tek bir damlacık gerektirir, nötrofil göçü için sağlam bir mikroakışkan tahlilleri tasarlanmıştırnötrofil ayrılması için ihtiyaç delikleri, ve bir basit mikroskop ölçmek kolaydır. Bu deneyde, nötrofil kemoatraktan kaynağına doğru, küçük kanallar aracılığıyla, kan damlacık tarafından doğrudan geçiş. Aynı kanallardan kırmızı kan hücrelerinin granül akışını önlemek için, seçici olarak, kırmızı kan hücrelerinin ilerlemesini bloke eden döner dik açı ile mekanik filtreler uygulanmıştır. Biz parmak prick ve venöz kandan toplanan kan damlacıklarının nötrofil göçü karşılaştırarak tahlil valide. Biz de saflaştırılmış Nötrofillerin örneklerinden nötrofil göçü ile bu tam kan (WB) kaynaklar karşılaştırılmış ve üç kaynaklar arasında tutarlı hız ve yönlendirme bulundu. Bu mikroakışkan platformu sağlık ve hastalık nötrofil fonksiyonlarının anlayışımızı ilerletmek yardımcı olmak için klinik ve araştırma ortamında insan nötrofil göç çalışmayı sağlayacaktır.
Introduction
Nötrofil kaçakçılığı ateroskleroz 1, bakteriyel enfeksiyon veya sepsis 2 de dahil olmak üzere birçok enflamatuar koşulları, ilerleme ve çözünürlüğü belirlenmesinde önemli bir rol oynar, ve yaralanma 3 yakmak. Sağlık ve hastalık onların büyük katkılarından dolayı, nötrofil sayısı sıklıkla klinik ve araştırma laboratuvarlarında kabul standart kan analizinin bir parçasıdır. Ancak, en her yerde testlerden biri, enfeksiyon ve sepsis tanısında nötrofil sayısının değerini olmasına rağmen sık sık 4 sorgulanmıştır. Örneğin, yanık hastalarda nötrofil bir çalışma nötrofil sayısı ve nötrofil göç fonksiyon ilişkili olmadığı ortaya; nötrofil yalnız saymak anlamına bağışıklık durumu 3 doğru bir göstergesi değildir. Ölçülmesi daha zor olsa da, nötrofil fonksiyonel yetenek koşullarının geniş bir aralıkta daha değerli olarak önerilmiştir.
t "> En önemlisi, nötrofil kusurları birçok geçici ve kalıcı genetik bozukluklar, büyük ölçüde yakın zamana kadar klinikte göz ardı edilmiş bir ayrım tarafından tetiklenen değildir. yanık yaralanmaları bağlamında, nötrofil göç sırasında takip edilebilir enflamatuar durum ya da enfeksiyona 3 bir göstergesi olarak bir hastanın tedavi bunlar kan geniş hacimli gerektirdiğinden. şu laboratuarda (Boyden haznesi Dunn odası, mikropipet deney) kullanılan geleneksel göç deneyler, klinik bir ortamda çevrilemeyen ve hantal zaman alıcıdır nötrofil izolasyon için gerekli kan hacmi sadece bir örnek için izin veren ve çoğu zaman da havuzu gerektirir, çünkü nötrofil izolasyon teknikleri (Tablo 1). Bu deneyler, aynı zamanda, örneğin, fare gibi küçük laboratuar hayvanları, nötrofil kemotaksis, geçici değişiklikleri izlemek için kullanılamaz Tek bir deney için, çok sayıdaki hayvandan alınan kan. Örneğin, ilgili bir çalışma mBirden çok zaman puan üzerinden ultiple koşulları ve tedaviler potansiyel mevcut kemotaksı deneyleri kullanılarak farelerin binlerce gerektirebilir. Bu hasar, enfeksiyon bağlamında bağışıklık fonksiyonunun karmaşık dinamiklerini anlamak ya da çoğu sıçangil modellerinde 5 incelenmiştir yakmak için yapılabilir temel biyolojik araştırmaları kısıtlar.Az kan hacmi gerektiren süre, hızlı sağlam bir nötrofil fonksiyonel tahlil için ihtiyacı karşılamak için, biz tam kan küçük bir damlacık doğrudan nötrofil kemotaksisini ölçen bir mikroakışkan cihaz geliştirdik. Bu serum 6 ve 7 de dahil olmak üzere platelet tüm kan içinde bir çok faktör, nötrofil fonksiyonunu etkileyen bilinmektedir. Bu, bütün kan mikroakışkan deney, bir in vitro deneyi ile 8 kemotaksis değişimlerin ölçülmesi sırasında nötrofil in vivo mikro korumak için örnek işleme en aza indirir bu nedenle faydalıdır. Bu yaklaşım, kan toplama geleneksel teknikleri kullanarak saatler nötrofil geçiş deneyleri için süreyi azaltır sadece birkaç dakika (Tablo 1). Tam kan mikroakışkan platformu, deney uzunluğu için sabit bir doğrusal gradyan kemoatraktan üreten hareketli parça ve bir dış basınç kaynağı (örn. şırınga pompası) gerektirmez. Tam kan mikroakışkan cihazın tasarımında önemli özelliği mekanik cihazın göç kanalı girmesini RBCs filtreleyen bir kırmızı kan hücresi (RBC) filtrasyon tarak birleşme olduğunu. Bu filtrasyon tarağın doğru dönüşleri muhtemel eritrosit ile tıkanmış olacağını boyut dışlama filtrasyon, ihtiyacını engeller ve bu nedenle de aktif WB göç nötrofil kemoatraktan ulaşmasını gradyanı bloke eder. 12 ya da 24 oyuklu bir plaka içerisinde, bütün kan mikroakışkan cihazın birleşme insan veya murin nötrofil kemotaksis si birden aracılarının tarama kolaylaştırırmultaneously.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Mikroakışkan Cihaz İmalatı
- Standart fotolitografik teknikleri kullanarak, bir sınıf 1.000 temiz oda ana kalıp gofret imal. Desen üreticisinin talimatlarına göre göç kanalları tanımlamak için ilk 3-mikron ince epoksi esaslı negatif Fotorezist tabaka. Desen hücre yükleme ve kemokin odaları tanımlamak için ikinci bir 50 mikron kalınlığında bir tabaka.
- Polidimetilsiloksan (PDMS) cihazlar döküm desenli gofret kullanın. Şiddetle büyük plastik tartım tepsisine plastik çatal ile 5 dakika boyunca başlatıcı (2 g) ile PDMS (20 g) karıştırılır.
- Dikkatle kalıp üzerine PDMS dökün.
- 1 saat boyunca bir vakumlu desikatör içinde döküldü PDMS ile kalıp yerleştirerek PDMS gazdan arındırın.
- Ve fırında 65 ° C'ye ayarlanmış bir fırın içinde en az 3 saat boyunca PDMS mikroakışkan cihazları tedavi
- 1.5 mm uç çaplı bir zımba kullanılarak merkezi WBLCs dışarı Punch.
- Bir Punc kullanılarak bütün çörek şeklindeki cihazlar dışarı Punch5.0 mm uç çapı ile onu.
- Yapışkan bant kullanılarak çörek aygıtlardan parçacıkları kaldırmak.
- Iyonu giderilmiş su ve daha sonra kuru azot ile birlikte bir 12 oyuklu plaka durulayın. 5 dakika boyunca 60 ° C fırın içinde plaka koyun.
- Oksijen plazma iki 12-yuvalı plaka tedavi; kez yalnız 35 saniye ve daha sonra tekrar başka bir 35 saniye için çörek cihazlar ile.
- Dikkatlice cımbız kullanarak plakasının yuvaları içinde koyunuz.
- 10 dakika boyunca 80 ° C'ye set edilen bir sıcak plaka üzerinde bağlanmış aygıtlar ile Bake plakası.
2.. Mikroakışkan Assay hazırlanması
- Hemen oksijen plazma muamelesi, sonra, Prime mikroakışkan cihazlar, cihaz hidrofiliktir ve kılcal etkileri cihazda küçük kanalların hazırlanmasını teşvik zaman.
- 5 ul fibronektin [stok çözeltisi, 1 mg / ml] ve 490 ul HBSS ile 5 ul fMLP [stok çözeltisi, 10 uM] karıştırılarak kemo-çekici bir çözüm oluşturur.
- Yavaşça pipet & #160; WBLC içine kemoatraktan çözeltisi, jel yükleme ucu (Şekil 1 A) kullanılmıştır. Cihazın dış çevresinde kemoatraktan Pipet ilave bir 20 ul.
- 15 dakika boyunca bir desikatör içinde plaka koyun. Cihaza bir vakum uygulayarak, çözelti cihaz ve PDMS dışarı yayılan değiştiren hava yan kanal içine damlatılır.
- Desikatörde plakasını çıkarın ve mikroskop altında cihaz kanal ıslanmasını onaylayın. Kemoatraktan çözüm odasına girer gibi kabarcık küçülür olarak izleyin. Resim kabarcık vakum tedavi sonrası aygıt içinde mevcut olması gerekmektedir.
- WBLC yıkayın ve cihazın dışına iyice fazla kemo-çekici çözeltisi kaldırın. Bu adım, cihazın merkezi odak kemotaktik odalarına (FCCs) her birinden kemoatraktan gradyanı oluşturur.
- Şırınga, bir kör 30 G iğne ucu eklemek, PBS ile bir 1 ml şırınga doldurun. Yavaşça, şırınganın iğne ucu eklemekçörek delik merkezine. Yavaşça deliğe PBS içinde 100 ul itmek, böylece cihazın üstüne PBS formları bir damlacık.
- Cihaz etrafında PBS eğimli plaka ve pipet 1 ml sıvı, kuyunun altındaki toplar, böylece. Aspire (ayrılmış nötrofiller medyada yüklenecek eğer yerine tampon kullanımı medya) taze tampon çözeltisi kullanılarak 3x toplam sıvı ve tekrar süreci 9.
- Cihazların başında sıvı altında batık kadar medya ile her iyi doldurun. Cihazlar degrade dengeye gelmesi için 15 dakika bekletin. Deney sonuçları ve sonlu eleman simülasyonlar teorik veri, bu cihazlarda gradyanlar küçük moleküller (örneğin, fMLP) ve daha büyük bir molekül ağırlığına (örneğin, IL-8) için bir kaç güne kadar 24 saat kadar kararlı olduğunu göstermektedir.
- Jel yükleme ipuçlarını kullanarak, her biri yavaş yavaş bütün kan Boyu içine 2 ul kan (ya da izole edilmiş nötrofiller) pipetding odası (WBLC) (Şekil 1A).
3.. Numune Hazırlama
Kılcal Kan itibaren İnsan Nötrofiller
- Hiçbir immünsüpresifler üzerinde sağlıklı gönüllü, parmak prick kapiller kan toplayın. Tüm hasta numuneleri yazılı bilgilendirilmiş rıza ile elde ve MGH'de ve Shriners Kurumsal Değerlendirme Kurulları tarafından onaylanan prosedürleri aracılığıyla edildi.
- Parmak prick kan toplama, su ve sabunla ellerinizi yıkayın ve cilt kuru. Kan toplama tüpü (1.65 USP/50 ul kan) heparin 1 ml HBSS +% 0.2 HSA ve 10 ul Hoechst leke (32.4 uM) eklenmesi ile anti-coagulant/stain stok çözelti hazırlayın. Kan ilk damla silmekle yavaşça stok anti-koagülan ve Hoechst floresan boyası çözeltisi (10 ul) ihtiva eden Eppendorf tüpü içinde 50 ul kan toplanması, bir SurgiLance güvenlik neşter (2.2-mm derinlik, 22 G) kullanılarak parmak delin karıştırın.
Venöz Kan itibaren İnsan Nötrofiller
- 33 USP heparin ihtiva eden tüplere periferal venöz kan 10 ml çizin.
- Daha önce tarif edildiği gibi ortam ve Hoechst leke venöz kan 50 ul ekle. Çekirdek, floresan boyama için izin vermek için 10 dakika boyunca kan ve Hoechst leke inkübe edin. Kan toplama 1 saat içerisinde örnek çalıştırın.
Kandan Nötrofil Ayrılık - Pozitif Kontrol
- , Nötrofil ayrı Heta nişasta kullanılarak 10 mi venöz bütün bir kan örneğinden ayırmak için nötrofil steril teknikler kullanmak için (6% w / v) ile, üreticinin protokolü takip edilerek, bir negatif seçim manyetik boncuk izolasyon kiti, ardından yoğunluk gradyanlı.
- Bir concentr nötrofil nihai bir kısım Tekrar süspansiyon haline getirilen1X HBSS +% 0.2 insan serum albümin / ml 4000 hücre ation. Denemeyi çalıştırmak için hazır olana kadar 37 ° C hücreleri tutun.
Nötrofil Kemotaksi Ölçümleri 4. Mikroskopi ve Görüntü Analizi
- % 5 37 ° C,% 80 nem ve CO 2 biochamber sıcaklığını ayarlayın.
- Bir mikroskop (10X veya daha yüksek büyütme) zaman atlamalı görüntüleme kullanarak hemen görüntüleme başlayın.
5. İstatistiksel Analiz
- El ile her bir örnek olarak en az 50 nötrofil izler.
- Zamanla giren FCC hücreleri (Şekil 2) sayısı.
- ImageJ (NIH) (Şekil 2) kullanılarak WBLC ve FCC arasındaki kanalda nötrofil hızları hesaplayın.
- Çatallanma geçmek hücrelerin sayısını sayma ve çıkış inci FCC ve hücrelere karşı çevirmek hücre sayısı arasındaki oranı hesaplayarak nötrofillerin yönünü ölçmeke cihaz. Yönlü olmayan hücreler, kemotaktik gradyanı takip eder ve bu nedenle, FCC ve çıkış kanalı (Şekil 2) doğru eşit sayıda geçiş yoktur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tam kan (WB) nötrofil kemotaksi deneyi, fMLP gradyanı (Film S1) karşı nötrofil birikimini ölçülmesiyle doğrulandı. Sonuçlar nötrofiller (mavi) aktif olarak tam kan (Şekil 3A ve Film S1) dışına göç mümkün iken eritrositler filtrasyon tarak tarafından tuzak olduğunu onaylayın. Bütün kan mikroakışkan cihaz tarafından oluşturulan duyarlı doğrusal bir kemo-çekici gradyanı (yeşil) FITC-işaretli dekstran (Şekil 3A ek) kullanılarak doğrulandı ve zaman içinde floresans seviyelerini ölçülmüştür. Bu cihazların üretilen geçişlerini daha büyük moleküler ağırlığı küçük moleküller için 24 saate kadar ve bir hafta kadar stabildi. Yıkama protokolü etkinliği WBLC hiçbir sinyal ile FCC lokalize floresan sinyali görüntüleme veya cihazı çevreleyen ile doğrulanmıştır. Cihazlar sonraki farklı bl nötrofil göç farklılıkları değerlendirmek için istihdam edildiood kaynakları.
Yeni WB kemotaksis platformu kullanılarak elde edilen sonuçlar WB bir parmak prick damlacığından nötrofiller, venöz WB, veya (tutarlı hız (20 ± 2 mm / dak, mavi çizgi) ve benzeri toplam göçmen hücreler ile göç venöz kandan izole olduğunu ortaya koymaktadır 38 ± Tüm kan kaynakları (Şekil 3B) 10 / hr hücreleri, gölgeli çubuklar). Ayrıca yönünü veya doğru kemotaktik gradyanı takip nötrofil yeteneğini ölçmek mümkün. Çatallanma bize kemokinezinin altında rastgele göç ve cihazı çıkıldı nötrofiller ile karşılaştırıldığında FCC doğru Kemoatraktan gradyan boyunca yönlü göç nötrofiller ölçmek için izin tam kan cihazın tasarımına dahil. Her üç kan kaynaklardan göç Nötrofiller 0,9 (cihazı çıkıldı her hücre için FCC doğru 9 hücre) bir yön indeksi ile göç.
Şekil 1. Çörek şeklindeki cihazın şematik. A) Kemoatraktan cihazın içine dolana ve gradyan odak kemotaksi odalarında (FCCs) doğru geçiş kanalı boyunca oluşturulur. Onaltı FCCs her WBLC kuşatır. Yıkama işleminden sonra, kemoatraktan sadece FCC kalır, ve bir doğrusal gradyan taşıma kanalı boyunca oluşturulur. Kırmızı kan hücresi (RBC) filtrasyon tarak kanalı tıkanma ve nötrofil aktif göçü engelleme RBCs engeller. Nötrofiller aktif tam kanın dışarı göç ve FCC birikir ve bunların hız, yön ve sayılar doğru sayısal olabilir) Film S1. B Bkz. daha büyük görmek için lütfen buraya tıklayınız Bu rakamın sürümü.
Şekil 2. Şematik ve WB cihaz için hücre sayım düzeni bakış. Nötrofiller aktif (WB), kırmızı kan hücre filtrasyon tarak geçmiş ve cihazın girişine tam kan yükleme bölmesine (WBLC) yüklü 2 ul tam kan dışarı göç. Hücrenin directionality bifürkasyonunda hücrenin kararına dayanılarak ölçülür. Yönlü nötrofiller degrade takip etmeyecek ve rastgele eşit dağılımı ile çıkış kanalına doğru ya da FCC ya göç edecek odak kemotaksis odası ve yönsüz hücrelere doğru giden kemotaktik degrade takip edecek. Nihai hücre sayısı FCC hücreleri sayılarak her bir zaman noktasında hesaplanmaktadır.files/ftp_upload/51215/51215fig2highres.jpg "target =" _blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 3,. Tam kan (WB) bir damlacık nötrofil kemotaksisi ölçülmesi. A) WB (1 ul), bütün kan yükleme odası (WBLC) yüklenir. Nötrofiller (mavi) fMLP kemotaktik venöz WB WB bir parmak prick damlacığından FCC. B'ye doğru göç kanalda oluşturulan gradyan) Nötrofiller, ya da venöz kandan izole tutarlı numaraları (bar) ve hız ile göç (mavi boyunca göç çizgi). , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Tablo 1.. Yan-kanal mikroakışkan cihaz ve geleneksel Boyden odasının vs bütün kan mikroakışkan platformu kullanılarak nötrofil kemotaksisinden protokollerin karşılaştırılması. Her protokol adımı tamamlamak için zaman ve reaktiflerin miktarı nötrofil kemotaksisini ölçmek için farklı yöntemler arasında karşılaştırıldı. Tam kan mikroakışkan platformu% 95 tahlil çalıştırmak için gerekli toplam süreyi ve>% 99 kan gerekli hacmi azaltır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, kan bir damlacık (2 ul) nötrofil kemotaksisini ölçmek için microfluidic platform geliştirdi. Aktif nötrofiller göç gelen RBCs on-chip mekanik filtrasyon nötrofiller aktive ederek eserleri tanıtmak eğilimli olan bu tür yoğunluk 10 eğimleri gibi hantal hücre ayırma yöntemleri, olumlu seçimi 11 veya negatif seçimi 12, ihtiyacını circumvents. RBCs mekanik filtrasyon nötrofil göçü sondalama diğer mikroakışkan cips teknoloji ayırır. Örneğin, laboratuarımızda 13 ve ikinci önceki çalışmaları Beebe et al. Önce kemotaksi deneyi için, bütün bir kan örneğinden, nötrofiller ayırmak için ikinci bir çip üzerinde 8 kullanılan selektinleri. Selektin yüzeyler üzerinde ayrılmasından sonra, nötrofil göçü tampon çözelti oluştu. Bu koşullarda, nötrofil kemotaksis üzerinde serum herhangi bir etkisi uzaklaştırılmıştır. Ayrıca, selektinler bilinmektedirreseptörleri yaparak hücreleri aktive etmek için ve bu nedenle in vitro kemotaksi ölçümlerinde değiştirebilir. Cihazımızdaki RBC filtrasyon tarak tarafından mekanik ayırma eden bir cihaz tarafından ölçüldüğü nötrofillerin durumunu değiştirmez. Bizim cihaz hız ve hücre birikimi sayısı hem de hücre yönlere sağlam ölçümleri kolaylaştırır.
Bu çalışmada, kapiler tam kan, kanın alınması ve bir damla ve venöz kan ayrılır göç sağlıklı gönüllülerden alınan nötrofil benzer bir hızda ve doğrultuyla 14 ile geçiş göstermiştir. Nötrofil ölçüm yönlere bu Yön bozulmuş olduğu bilinmektedir yanıklar 3, 15 ve 16 travma gibi iltihabik şartlar, önemlidir. Bozulmuş ve üzerinde nötrofiller uzak yaralanma sitesinden göç ve potansiyel sağlıklı dokuların zarar görmesine yol açabilir uyarılır. Cihaz mevcut bir sınırlamaBu yazıda ed cihazda hücre zenginleştirme mümkün değildir ve bu nedenle hücre sayıları da doğal, tam kan bulunan oranlarına bağlı olmasıdır. Bu, nötrofil sayısı düşük olduğu nötropeni, gibi koşullarda hücrelerin önemli bir dizi kemotaksis ölçümleri kazanmakta sorunlar ortaya çıkabilir. Bizim cihazın başka potansiyel sorun aynı anda göç eritrosit veya diğer hücreler tarafından hücrelerin göç sterik engeldir. Deneylerde, nötrofiller göç hızını değiştirmeden RBC filtrasyon tarak dönüşlerde sıkışıp geçmiş RBCs sıkmak olabilir. Buna ek olarak, kimyasal çekici konsantrasyon ve etki gücü, hücre göçünü teşvik etmede son derece önemlidir. Tahlili gidermek için diğer koşullar ile bu kemoatraktan farklı büyüklüklerde doz-yanıt eğrileri çalıştırmak için önemli olabilir. Gibi lipit arabulucu olarak daha istikrarsız Kemoattraktantlar taşıma ve işleme de çok önemlidir, bu nedenle Başbakan cihazlar için önemlidirhemen önce WB yükleme. Son olarak, tam kan WB cihaz priming önce pıhtı olmadığı da önemlidir. Bu, aşağıdaki hemen tahlil çalıştırmak mümkün değilse, kan toplama kan heparin bir sallama düzeneği üzerinde saklanmalıdır. WB cihaza aşırı basınç tanıtmak için değil örnek yükleme dikkatle, yavaş yavaş yapılmalıdır.
Gelecekte, cihaz, büyük olasılıkla fonksiyon bozukluğu nötrofil 17'de önemli bir rol oynar, hastanın doğal serum, ikinci nötrofil çıkarmadan yanık ya da travma hastalarında meydana gelen pertübasyonları nötrofil fonksiyonu ölçmek için kullanılabilir. Bu cihaz aynı zamanda, bu hastalarda normal nötrofil fonksiyonu geri potansiyel pro çözünürlüklü terapötik taranması için gelecekte kullanılabilir. Son olarak, bu cihaz, bundan başka, monositler, makrofajlar ve T-hücreleri gibi diğer hücrelerin göç kemotaksis ölçmek için tasarlanmış olabilir.
Sonuç olarak, bir nove geliştirdiknötrofil ölçülmesi için l yöntem, bütün haldeki kan, bir damlacık şirketinden kemotaksis. 12 ya da 24 oyuklu bir plaka içerisinde, bütün kan mikroakışkan cihazın aynı anda birden çok birleşme koşulları tarama kolaylaştırır. Bu cihaz, yanık ve diğer enflamatuar hastalıkları tedavi etmek için çözünürlük iltihap aracılarının geliştirilmesini kolaylaştırır. Gelecekte, bu cihaz hasta numunelerinin ve örnek hacmi sınırlıdır murin modellerinde zamanla nötrofil kemotaktik fonksiyonunda pertübasyonları ölçmek için kullanılacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ifşa hiçbir çıkar çatışması vardır.
Acknowledgments
Ulusal Sağlık Enstitüleri Destek ve Shriners Burns Hastanesi (GM092804, DE019938 verir).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Device Fabrication | |||
| SU-8 | Microchem | Y131273 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 1.1 lb. Kit | |
| Standard glass slides | Fisher Scientific | 125495 | 1 X 3 inches |
| Glass-bottom plate | MatTek | P12G-1.5-14-F | |
| Harris Uni-Core, Tip Diameter 5.0 mm | Ted Pella, Inc. | 15081 | |
| Harris Uni-Core, Tip Diameter 1.5 mm | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Microfluidic Assay Preparation and Analysis | |||
| Gel-loading pipet tip | Fisher Scientific | 02-707-139 | |
| Syringe | Fisher Scientfic | 309602 | |
| Blunt tip needle, 30 G ½ in. | Brico Medical Supply | BN3005 | |
| Vacutainer, Heparin | Becton Dickinson | ||
| HBSS | Sigma-Aldrich | ||
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A5843-5G | 0.2% final concentration in HBSS |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895-1MG | |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506-10MG | |
| SurgiLance safety lancet, 2.2-mm depth, 22 G | SLN240 | ||
| Hoescht stain | Life Technologies | H3570 | |
| Positive Control | |||
| HetaSep | STEMCELL Technologies Inc. | 7906 | |
| EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit | STEMCELL Technologies Inc. | 19257 | |
| Plasma Asher | March Instruments | P-250 | |
| Lindberg/Blue M Oven | Thermo Scientific | 13-258-30C | |
| Stainless Steel Precision Tweezers | Techni Tool | 758TW458 | |
| Bel-Art Scienceware Chemical-Resistant Vacuum Desiccator | Fisher Scientific | 08-594-15A | |
| Dataplate Digital Hot Plate | Alpha Multiservices | PMC 720 | |
| Nikon TiE inverted microscope | Nikon - Micro Video Instruments Inc. | MEA53100 | |
| CFI Plan Fluor DL 10X NA 15.2 wd Objective | Nikon - Micro Video Instruments Inc. | MRH20101 | |
| Lumen 200 with 2 Meter Light Guide for Nikon | Nikon - Micro Video Instruments Inc. | 500-L200NI2 | |
| DAPI/Hoechst/AMCA Narrow Band 32-mm Exciters - 25-mm Emitters | Chroma - Micro Video Instruments Inc. | 31013v2 | |
| Retiga R 2000 cooled CCD Camera 1,600 x 1,200 pixels | Qimaging - Micro Video Instruments Inc. | RET-2000R-F-M-12-C | |
References
- Hansson, G. K., Robertson, A. K., Soderberg-Naucler, C.
- Phillipson, M., Kubes, P.
- Butler, K. L., et al. Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices. PloS one. 5, (2010).
- Lavrentieva, A., et al. Inflammatory markers in patients with severe burn injury. What is the best indicator of sepsis. Burns : journal of the International Society for Burn Injuries. 33, 189-194 (2007).
- De Filippo, K., et al. Mast cell and macrophage chemokines CXCL1/CXCL2 control the early stage of neutrophil recruitment during tissue inflammation. Blood. 121, 4930-4937 (2013).
- Mankovich, A. R., Lee, C. Y., Heinrich, V. Differential effects of serum heat treatment on chemotaxis and phagocytosis by human neutrophils. PloS one. 8, (2013).
- Palabrica, T., et al. Leukocyte accumulation promoting fibrin deposition is mediated in vivo by P-selectin on adherent platelets. Nature. 359, 848-851 (1992).
- Sackmann, E. K., et al. Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays. Blood. 120, (2012).
- Jones, C. N., et al. Microfluidic chambers for monitoring leukocyte trafficking and humanized nano-proresolving medicines interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 20560-20565 (2012).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods Mol Biol. 412, 15-20 (2007).
- Lyons, P. A., et al. Microarray analysis of human leucocyte subsets: the advantages of positive selection and rapid purification. BMC genomics. 8, (2007).
- Hasenberg, M., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PloS one. 6, (2011).
- Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. Neutrophil migration assay from a drop of blood. Lab on a chip. 8, 2054-2061 (2008).
- Hoang, A. N., et al. Measuring neutrophil speed and directionality during chemotaxis, directly from a droplet of whole blood. Technology. 0, 1-9 (2013).
- Kurihara, T., et al. Resolvin D2 restores neutrophil directionality and improves survival after burns. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. , (2013).
- Buffone, V., Meakins, J. L., Christou, N. V. Neutrophil function in surgical patients. Relationship to adequate bacterial defenses. Arch Surg. 119, 39-43 (1984).
- Malawista, S. E., de Boisfleury Chevance, A., van Damme, J., Serhan, C. N. Tonic inhibition of chemotaxis in human plasma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 17949-17954 (2008).
