Summary
이 프로토콜은 강력한 재현성 전체 혈액 한 방울에서 인간 호중구의 화학 주성을 측정하기위한 분석을 자세히 설명합니다. 이 접근법은 호중구의 분리의 필요성을 우회하고 분석 준비 시간의 몇 분을 필요로한다. 마이크로 유체 칩은 유아 또는 샘플의 양이 제한되어 작은 포유 동물에 시간이 지남에 따라 호중구의 화학 주성의 반복 측정을 가능하게합니다.
Abstract
호중구가 혈액 감염과 그들의 숫자에 대한 보호에 필수적인 역할을 자주 병원에서 측정됩니다. 낮은 호중구 카운트 감염에 대한 높은 위험에 대한 경고 표시하는 동안 혈액에있는 높은 호중구의 수는 일반적으로 지속적인 감염의 지표입니다. 자신의 기능을 수행하기 위해, 호중구는 감염이 발생 조직으로, 그들의 생활의 대부분을 보내는 혈액에서 효율적으로 움직일 수있다. 따라서, 마이그레이션하는 호중구의 기능에 결함이 호중구가 혈액에 해당 번호에 존재하는 경우에도, 감염에 대한 위험을 증가시킬 수있다. 그러나, 병원에서 호중구의 이동 능력을 측정하는 것은, 시간이 소요되는 어려운 작업이며 많은 혈액의 양 및 전문 지식이 필요합니다. 이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 circum, 처리되지 않은 혈액 한 방울을 요구하는 호중구의 이동에 대한 강력한 마이크로 유체 분석 설계호중구의 분리의 필요성을 통풍구 및 간단한 현미경 정량화하기 쉽다. 이 분석에서, 호중구 화학 주성의 소스를 향해 작은 경로를 통하여 혈액 방울에서 직접 이동한다. 같은 채널을 통해 적혈구의 세부적인 흐름을 방지하기 위해, 우리는 선택적으로 적혈구의 진행을 차단하는 것이집니다 직각으로 기계적인 필터를 구현했습니다. 우리는 손가락 찌르기와 정맥 혈액에서 수집 된 혈액 방울에서 호중구의 이동을 비교하여 분석을 확인. 우리는 또한 정제 된 호중구의 샘플에서 호중구의 마이그레이션이 전혈 (WB) 소스를 비교 세 가지 소스에 일관된 속도와 방향성을 발견했다. 이 미세 유체 플랫폼은 건강과 질병에서 호중구의 기능에 대한 우리의 이해를 발전에 도움이되는 병원과 연구 환경에서 인간의 호중구 이주의 연구를 가능하게 할 것이다.
Introduction
호중구의 인신 매매는 죽상 경화증 1, 세균 감염이나 패혈증 2을 (를) 포함하여 많은 염증성 질환의 진행과 해상도를 결정하는 중요한 역할을하고, 부상 3을 구울 수 있습니다. 건강과 질병 상태에 대한 그들의 큰 기여를 들어, 호중구는 종종 임상과 연구 실험실에서 고려 된 표준 혈액 분석의 일부입니다. 그러나, 대부분의 유비쿼터스 테스트 중 하나, 감염과 패혈증의 진단에 호중구의 가치에도 불구하고 자주 4 의문을 제기하고있다. 예를 들어, 화상 환자의 호중구의 한 연구는 호중구 수와 호중구 마이그레이션 기능은 상관 관계가없는 것으로 나타났습니다; 그 호중구 혼자 계산 의미하는 것은 면역 상태 3의 정확한 표시되지 않습니다. 측정하기 더 어렵게되지만, 호중구 기능적 능력 조건의 넓은 범위에서보다 가치로서 제안되었다.
t는 "> 중요한 것은, 호중구 결함의 대부분은 일시적이며 영구적 인 유전 적 결함, 대부분 최근까지 병원에서 간과 된 차이에 의해 실행되지 않습니다. 화상 부상의 맥락에서, 호중구 이주의 과정을 모니터링 할 수 염증 상태 또는 감염 3의 지표로서 환자의 치료는 혈액의 대용량을 필요로하기 때문이다. 현재 실험실 (보이 덴 챔버 던 챔버, 마이크로 피펫 분석)에 사용 된 전통적인 이동 분석법은 임상로 변환 할 수없는 번거로운 시간 소모적 호중구의 분리에 필요한 혈액의 양이 하나의 샘플 수 및 종종 심지어 풀링 필요하기 때문에 호중구의 분리 기법 (표 1). 이러한 분석법은 또한, 예컨대 생쥐 같은 작은 실험실 동물의 호중구 화학 주성에서 일시적인 변화를 모니터링하기 위해 사용될 수 없다 하나의 분석에 대해 여러 동물의 피. 예를 들어, 관련된 연구는 M여러 시간 지점에 ultiple 조건과 치료는 잠재적으로 현재 화성 분석을 사용하여 마우스의 수천을 필요로 할 수 있습니다. 이 부상, 감염의 맥락에서 면역 기능의 복잡한 역학을 이해하거나 자주 쥐 모델 5에서 공부를 레코딩 할 수있는 기본적인 생물학 연구를 제한합니다.최소한의 혈액량을 요구하면서, 급속한 견고 호중구 기능적 분석을위한 필요성을 해결하기 위해, 우리는 전체 혈액의 작은 방울로부터 직접 호중구 주 화성을 측정 미세 유동 장치를 개발했다. 그것은 혈청 6 혈소판 7을 포함하여 전체 혈액에있는 많은 요인이, 호중구의 기능에 영향을 미치는 것으로 알려져있다. 그것은 전혈 미세 분석은 시험 관내 분석으로 8 주 화성의 변동을 측정 할 때 호중구의 생체 내 미세 환경을 유지하는 시료 처리를 최소화하는 것이되므로 유리하다. 이 방법혈액 컬렉션에서 기존의 기술을 사용하여 시간에서 호중구 마이그레이션 분석에 시간이 줄어 듭니다 단지 분 (표 1)에. 전체 혈액의 미세 유체 플랫폼은 실험의 길이 안정적인 선형 화학 유인 물질 구배를 생성 움직이는 부분이 없으며, 외부 압력 소스 (즉, 주사기 펌프)를 필요로하지 않습니다. 전혈 마이크로 유체 장치의 디자인에서 중요한 특징은 기계적 장치의 이주 채널 입력에서 적혈구를 필터링 적혈구 (RBC) 여과 빗의 혼입이다. 이 여과 빗 우회전 가능성 적혈구 의해 막히는 것 크기 배제 여과의 필요성을 방지하고, 따라서 WB에서 적극적 마이그레이션 호중구 도달 화학 유인 물질 그라데이션 블록. 12 또는 24 - 웰 플레이트의 전체 혈액의 미세 유체 장치의 결합은 인간이나 쥐의 호중구의 화학 주성시의 여러 매개 물질의 검사를 용이하게로 섞고.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 미세 유체 디바이스 제조
- 표준 포토 리소그래피 기술을 이용하여, 클래스 1000 청정실 마스터 몰드 웨이퍼를 제조. 본 제조자의 지시에 따른 이동 채널을 정의하는 제 3 μm의 얇은 에폭시 계 네거티브 포토 레지스트 층. 패턴 셀 로딩 및 케모카인 챔버를 정의하는 두 번째 50 μm의 두꺼운 층.
- 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 장치를 캐스팅 패턴 웨이퍼를 사용합니다. 적극적 큰 플라스틱 무게 트레이에 플라스틱 포크를 사용하여 5 분 동안 개시 (2g)와 PDMS (19 g)을 혼합.
- 조심스럽게 금형에 PDMS를 붓는다.
- 1 시간 동안 진공 데시 케이 부어 PDMS와 금형을 배치하여 PDMS를 탈기.
- 빵을 65 ° C로 설정 오븐에서 적어도 3 시간 동안 PDMS 마이크로 유체 장치 치료
- 1.5 mm의 선단 직경 펀칭기를 사용하여 중앙 WBLCs 펀치 아웃.
- punc를 사용하여 전체 도넛 모양의 장치를 펀치5.0 mm의 팁 직경을 가진 그녀.
- 접착 테이프를 사용하여 도넛 장치에서 입자를 제거합니다.
- 탈 물과 질소로 다음 건조로 12 - 웰 플레이트를 씻어. 5 분 60 ° C 오븐에서 접시를 놓습니다.
- 산소 플라즈마는 두 번 12 - 웰 플레이트를 치료; 한 번 단독으로 35 초 후 다시 다른 35 초 동안 도넛 장치.
- 조심스럽게 핀셋을 사용하여 판의 우물에 장치를 배치합니다.
- 10 분 동안 80 ° C로 설정 핫 플레이트에 결합 장치와 빵 접시.
2. 미세 유체 분석 준비
- 즉, 산소 플라즈마 처리 후 프라임 미세 유동 장치 장치가 친수성 모세관 효과 장치에서 작은 채널 프라이밍을 촉진 할 수있을 때.
- 5 ㎕의 피브로넥틴 [원액을 1 ㎎ / ㎖] 490 ㎕의 HBSS에 5 μL fMLP [원액 10 μM]을 혼합하여 화학 유인 물질 솔루션을 만듭니다.
- 천천히 피펫 & #160; WBLC에 화학 유인 물질 용액, 젤 로딩 팁 (그림 1A)를 사용하여. 장치의 외부 주변 화학 유인 물질의 피펫은 추가적인 20 μL.
- 15 분 동안 건조기에서 접시를 놓습니다. 장치에 진공을 적용하여, 용액 장치와 PDMS 통해 확산 된 공기의 사이드 채널로 주입된다.
- 데시 케이 터에서 접시를 제거하고 현미경 장치 채널의 습윤을 확인합니다. 화학 유인 물질 용액 챔버를 입력으로 거품이 작아짐 손목 시계. 아무 거품은 진공 처리 후 장치 내에서 본 제품을 장착 할 수 없습니다.
- WBLC 세척 장치의 외부에 철저를 초과하는 화학 유인 물질 솔루션을 제거 할 수 있습니다. 이 단계는 디바이스 중심 초점 화학 주성 챔버 (FCCS) 각각으로부터 화학 유인 물질의 구배를 생성한다.
- 주사기에 30 G 무딘 바늘 팁을 추가, PBS로 1 ML의 주사기를 채우십시오. 온화있는 주사기의 바늘 끝을 삽입도넛 구멍의 중심에. 조심스럽게 구멍에 PBS 100 μl를 밀어 있도록 장치의 상단에 PBS 형태의 물방울.
- 장치 주변의 PBS의 경사판 피펫 1 ㎖ 액체 웰의 바닥에 수집되도록. 대기음 (분리 된 호중구가 미디어에로드 할 경우 대신 버퍼의 사용 미디어) 신선한 완충 용액을 사용하여 3 배의 총 액체 반복 과정 9.
- 장치의 정상 액체에서 침수 될 때까지 미디어와 잘 각을 입력합니다. 장치가 그라데이션이 안정 될 수 있도록 15 분 동안 앉아 보자. 실험 결과와 유한 요소 시뮬레이션 이론적 데이터는 이러한 장치의 그라데이션이 작은 분자 (예를 들면, fMLP)과 큰 분자량 (예를 들어, IL8)에 대한 몇 가지 일 최대 24 시간까지 안정되어 있음을 보여줍니다.
- 젤 로딩 팁을 사용하여, 천천히 각 전혈 LOA에 2 ㎕의 혈액 (또는 고립 된 호중구를) 피펫딩 챔버 (WBLC) (그림 1A).
3. 샘플 준비
모세관 혈액에서 인간의 호중구
- 아니 면역 억제제에 건강한 자원 봉사의 손가락 찌르기에서 모세관 혈액을 수집합니다. 모든 환자의 샘플을 작성 동의서를 얻을, 그리고 MGH와 라이너스 기관 검토 보드의 승인 절차를 통해되었습니다.
- 손가락 찌르기 혈액 수집을 위해, 물과 비누로 손을 씻어 피부를 건조. 혈액 수집 관 (1.65 USP/50 ㎕의 혈액을) 헤파린에 1 ㎖의 HBSS + 0.2 % HSA 10 μL 훽스트 얼룩 (32.4 μM)를 추가하여 anti-coagulant/stain 주식 솔루션을 준비합니다. 혈액의 첫 번째 드롭을 닦아 부드럽게 주식 항응고제 및 훽스트 형광 염색 용액 (10 μL) 등을 포함하는 에펜 도르프 튜브에 혈액의 50 μl를 수집, SurgiLance 안전 바소 (2.2-mm의 깊이, 22 G)를 사용하여 손가락을 찔러 혼합.
정맥 혈액에서 인간의 호중구
- 33 USP 헤파린을 포함하는 튜브에 말초 정맥 혈액 10 ㎖를 그립니다.
- 전술 한 바와 같이 미디어와 헥스 얼룩에 정맥 혈액의 50 μl를 추가합니다. 핵 형광 염색 수 있도록 10 분 동안 혈액과 훽스트 얼룩을 품어. 혈액 수집의 1 시간 이내에 샘플을 실행합니다.
전체 혈액에서 호중구의 분리 - 긍정적 인 제어
- , 호중구를 분리 헤 타스 타치를 사용하여 10 ㎖ 정맥 전체 혈액 샘플에서 호중구를 분리하기 위해 무균 기술을 사용하려면 (6 % W / V) 제조 업체의 프로토콜을 다음과 같은 음의 선택 자기 비드 분리 키트 다음에 밀도 구배.
- concentr에서 호중구의 최종 나누어지는 재현 탁1X HBSS + 0.2 % 인간 혈청 알부민 / μL 4,000 세포의 ATION. 실험을 실행할 준비가 될 때까지 37 ° C에서 세포를 유지합니다.
호중구 화성 측정을위한 4. 현미경 및 이미지 분석
- 5 %에서 37 ° C, 80 %의 습도 및 CO 2 biochamber 온도를 설정합니다.
- 현미경 (10 배 이상 확대)에 시간 경과 이미징을 사용하여 즉시 이미징 시작합니다.
5. 통계 분석
- 수동으로 각 샘플의 적어도 50 호중구를 추적 할 수 있습니다.
- 시간이 지남에 따라 FCC들이 세포 (도 2)를 카운트.
- ImageJ에 (NIH) (그림 2)를 사용하여 WBLC 및 FCC 사이의 채널에서 호중구의 속도를 계산합니다.
- 분기점을 전달 세포의 수를 카운트하고 종료 번째 FCC와 세포를 향해 회전하는 셀의 수 사이의 비율을 계산하여 호중구의 방향성을 정량화전자 장치. 방향없는 세포는 화성의 기울기를 따라 때문에 FCC 및 출구 채널 (그림 2)을 향해 동일한 개수의 마이그레이션되지 않습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
전혈 (WB) 호중구 주 화성 분석은 fMLP 구배 (동영상 S1)쪽으로 호중구의 축적을 측정함으로써 입증 하였다. 결과는 호중구 (파란색)이 적극적으로 전혈 (그림 3a 및 영화 S1) 중 마이그레이션 할 수있는 동안 적혈구가 여과 빗에 의해 갇혀 있는지 확인합니다. 전혈 미세 유동 장치에 의해 형성된 안정 화학 유인 물질 선형 구배 (그린)를 FITC-표지 된 덱스 트란 (도 3a의 삽입)을 이용하여 확인하고 시간에 따른 형광 수준을 측정 하였다. 이러한 장치에서 생성 된 그라데이션 큰 분자량 작은 분자에 대한 24 시간까지 일주일까지 안정. 세척 프로토콜의 효율은 WBLC의 신호가 없으면 FCC에서 지역화 된 형광 신호를 영상화하거나 장치 주변에 의해 확인되었다. 장치는 다음에 다른 BL로부터 호중구 이동의 차이를 평가하기 위해 사용되었다짐 우드 소스.
소설 WB 화성 플랫폼을 사용하여 얻은 결과는 WB의 손가락 찌르기 물방울에서 호중구, 정맥 WB에서, 또는 (일관된 속도 (20 ± 2mm / 분, 파란 선)와 비슷한 총 철새 세포로 마이그레이션 정맥 혈액에서 분리 된 것으로 나타났다 38 ± 모든 혈액 소스 (그림 3B)에서 10 / 시간 셀, 회색 바). 또한 방향성 또는 올바르게 화성 구배를 따르지 호중구의 능력을 정량화 할 수 있었다. 분기점은 우리가 chemokinesis에서 무작위로 마이그레이션 및 장치를 종료 호중구와 비교하여 FCC 화학 유인 물질을 향해 경사를 따라 방향성 마이그레이션 호중구를 정량화 할 수 전혈 장치의 디자인에 통합. 세 가지 혈액 소스 마이그레이션 호중구 0.9 (장치를 종료 모든 셀에 대한 FCC쪽으로 9 셀)의 방향성 지수 마이그레이션.
그림 1. 도넛 모양의 장치의 개략도. A) 화학 유인 물질은 장치에 프라이머되고 구배 초점 주 화성 챔버 (FCCS)쪽으로 이동 채널을 따라 형성된다. 열 여섯 FCCS 각 WBLC을 둘러싸고 있습니다. 세정 후, 화학 유인 물질는 FCC에 남아 있고, 선형 구배 이주 채널을 따라 형성된다. 적혈구 (RBC) 여과 빗 채널을 막힘 및 호중구 활성 마이그레이션을 차단하는 적혈구를 방지 할 수 있습니다. 호중구가 적극적으로 전체 혈액에서 마이그레이션 및 FCC에 축적, 그들의 속도, 방향성와 숫자를 정확하게 정량화 할 수있다) 영화 S1. B를 참조하십시오. 큰를 보려면 여기를 클릭하세요 이 그림의 버전입니다.
그림 2. 회로도 및 WB 장치의 셀 카운팅 방식의 개요. 호중구는 적극적으로 (WB)은 적혈구 여과 빗 과거와 장치의 입구에 전체 혈액의로드 실 (WBLC)에로드 2 μL 전체 혈액에서 마이그레이션 할 수 있습니다. 세포의 방향성은 분기점에있는 셀의 결정에 따라 측정된다. 방향 호중구 그라데이션을 따르지하고 무작위로 동일한 분포 출구 채널 향해 또는 FCC 하나를 마이그레이션 할 초점 화성 챔버와 무 지향성 세포쪽으로 이어지는 화성의 기울기를 따릅니다. 최종 세포 수는 FCC에 세포를 카운트함으로써 각 시점에서 산출된다.files/ftp_upload/51215/51215fig2highres.jpg "대상 ="_blank ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 전혈 (WB)의 물방울에서 호중구의 화학 주성을 측정합니다. A) WB (1 μL)은 전체 혈액의로드 실 (WBLC)에로드됩니다. 호중구 (파란색) fMLP 화학 주성 정맥 WB에서 WB의 손가락 찌르기 물방울에서 FCC. B쪽으로 이동 채널 형성 그라데이션) 호중구, 또는 정맥 혈액에서 분리 일관된 번호 (바)와 속도로 마이그레이션 (파란색 함께 마이그레이션 선). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1. 측 채널 미세 유체 소자와 전통적인 보이 덴 챔버 대 전혈 미세 유체 플랫폼을 사용하여 호중구 화학 주성에 대한 프로토콜의 비교. 각 프로토콜의 단계를 완료하는 시간과 시약의 양은 호중구 주 화성을 측정하는 다른 방법 사이에서 비교된다. 전체 혈액의 미세 유체 플랫폼은 95 %로 분석을 실행하는 데 필요한 총 시간> 99 % 혈액의 필요한 양을 줄일 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 작품에서 우리는 혈액의 액체 방울 (2 μL)에서 호중구의 화학 주성을 측정 할 수있는 미세 유체 플랫폼을 개발했다. 적극적으로 호중구를 마이그레이션에서 적혈구의 온 - 칩 기계적 여과는 호중구를 활성화하여 유물을 소개하는 경향이 이러한 밀도가 10 그라디언트 등의 번거로운 세포 분리 방법, 긍정적 인 선택 (11), 또는 음의 선택 (12)에 대한 필요성을 우회. 적혈구의 기계적 여과는 호중구의 이동을 프로빙 다른 미세 유체 칩에서 우리의 기술을 구분합니다. 예를 들어, 우리가 실험실 13에서 이전 작품 비비 등. 전에 화성 분석에 전체 혈액 샘플에서 호중구를 분리하는 칩 8 이용 셀렉틴. 셀렉틴 표면에서 분리 한 후, 호중구의 이동은 완충 용액에서 발생했습니다. 이러한 조건에서, 호중구의 화학 주성에 혈청의 효과가 제거되었습니다. 더욱이, 셀렉틴이 알려져있다특정 수용체와 결합하여 세포를 활성화하기 때문에 체외 화성 측정에서 변경할 수있다. 우리의 장치에서 RBC 여과 빗에 의해 기계적 분리는 우리의 장치에 의해 측정 된 호중구의 상태를 변경하지 않습니다. 우리의 장치는 속도와 세포 축적 번호뿐만 아니라 세포의 방향성 강력 측정을 용이하게한다.
이 연구에서, 우리는 모세관 전혈, 정맥 혈액 한 방울, 정맥 혈액에서 분리 마이그레이션 건강한 지원자에서 호중구 비슷한 속도와 방향성 (14)와 마이그레이션 것으로 나타났습니다. 호중구 방향성의 둘레는 방향성을 손상하는 것으로 알려져있다 화상 3, 15과 외상 (16)과 같은 염증성 질환에서 중요하다. 장애인 이상 호중구가 떨어져 부상의 사이트에서 마이그레이션하고 잠재적으로 건강한 조직에 상해를 입을 수 있습니다 자극. 장치의 현재의 한계이 논문의 에드 장치의 세포 농축 할 수없는, 따라서 세포 수 그들이 네이티브 전체 혈액에서 발견되는 비율에 의존하는 것입니다. 이는 호중구 감소증이 낮은, 등의 조건에있는 세포의 상당수에서 화성 측정을 획득하는 문제를 제시 할 수있다. 우리의 장치의 또 다른 잠재적 인 문제를 동시에 마이그레이션 적혈구 또는 다른 세포에 의해 세포를 마이그레이션하는 입체 장애입니다. 우리의 실험에서, 호중구는 그들의 이동 속도를 변경하지 않고 RBC 여과 빗의 회전에 갇혀 과거 적혈구를 짤 수 있습니다. 또, 화학 유인 물질 농도 및 효능은 세포 이동을 유도하기에 매우 중요하다. 분석 문제를 해결하려면 다른 조건으로는 화학 유인 물질의 변화, 등급과 용량 - 반응 곡선을 실행하는 것이 중요 할 수있다. 지질 매개체로 불안정 chemoattractants 취급 및 처리도 매우 중요하다, 그래서 주요 장치에 중요직전 WB로드합니다. 마지막으로, 전혈 WB 장치 프라이밍 전에 응고되지 않는 것이 중요하다. 그것은 바로 다음에 분석을 실행할 수없는 경우 채혈 혈액은 헤파린의 로커에 저장해야합니다. WB 장치에 과도한 압력을 소개하지로 샘플의 로딩주의, 천천히 수행해야합니다.
장래에, 우리는 디바이스 가능성 호중구 부전 17에 중요한 역할을 환자의 네이티브 혈청, 호중구으로부터 제거없이 화상 또는 외상 환자의 호중구 기능 섭동을 측정하는데 사용될 수있다. 이 장치는 또한 이러한 환자에서 정상 호중구 기능을 복원 전위 계 해상도 치료제를 스크리닝하기 위해 미래에 이용 될 수있다. 마지막으로,이 장치는 또한 예컨대 단핵구, 대 식세포, 및 t-세포와 같은 기타 이동성 세포 주 화성을 측정하도록 설계 될 수있다.
결론적으로, 우리는 노브를 개발호중구를 측정하는 방법은 L 전혈의 액적으로부터 직접 주 화성. 12 또는 24 - 웰 플레이트의 전체 혈액의 미세 유체 장치의 결합은 동시에 여러 조건의 검사를 용이하게한다. 이 장치는 화상 및 다른 염증성 질환을 치료하는 염증 매개체의 해상도의 발전을 촉진 할 것이다. 장래에,이 장치는 환자 샘플 및 샘플 량에 한계가 뮤린 모델 경시 호중구 화학 주성 함수에 섭동을 측정하기 위해 이용 될 것이다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
공개 할 관심의 충돌이 없습니다.
Acknowledgments
건강의 국립 연구소에서 지원하고 이너스 화상 병원 (GM092804, DE019938을 부여합니다.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Device Fabrication | |||
| SU-8 | Microchem | Y131273 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 1.1 lb. Kit | |
| Standard glass slides | Fisher Scientific | 125495 | 1 X 3 inches |
| Glass-bottom plate | MatTek | P12G-1.5-14-F | |
| Harris Uni-Core, Tip Diameter 5.0 mm | Ted Pella, Inc. | 15081 | |
| Harris Uni-Core, Tip Diameter 1.5 mm | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Microfluidic Assay Preparation and Analysis | |||
| Gel-loading pipet tip | Fisher Scientific | 02-707-139 | |
| Syringe | Fisher Scientfic | 309602 | |
| Blunt tip needle, 30 G ½ in. | Brico Medical Supply | BN3005 | |
| Vacutainer, Heparin | Becton Dickinson | ||
| HBSS | Sigma-Aldrich | ||
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A5843-5G | 0.2% final concentration in HBSS |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895-1MG | |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506-10MG | |
| SurgiLance safety lancet, 2.2-mm depth, 22 G | SLN240 | ||
| Hoescht stain | Life Technologies | H3570 | |
| Positive Control | |||
| HetaSep | STEMCELL Technologies Inc. | 7906 | |
| EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit | STEMCELL Technologies Inc. | 19257 | |
| Plasma Asher | March Instruments | P-250 | |
| Lindberg/Blue M Oven | Thermo Scientific | 13-258-30C | |
| Stainless Steel Precision Tweezers | Techni Tool | 758TW458 | |
| Bel-Art Scienceware Chemical-Resistant Vacuum Desiccator | Fisher Scientific | 08-594-15A | |
| Dataplate Digital Hot Plate | Alpha Multiservices | PMC 720 | |
| Nikon TiE inverted microscope | Nikon - Micro Video Instruments Inc. | MEA53100 | |
| CFI Plan Fluor DL 10X NA 15.2 wd Objective | Nikon - Micro Video Instruments Inc. | MRH20101 | |
| Lumen 200 with 2 Meter Light Guide for Nikon | Nikon - Micro Video Instruments Inc. | 500-L200NI2 | |
| DAPI/Hoechst/AMCA Narrow Band 32-mm Exciters - 25-mm Emitters | Chroma - Micro Video Instruments Inc. | 31013v2 | |
| Retiga R 2000 cooled CCD Camera 1,600 x 1,200 pixels | Qimaging - Micro Video Instruments Inc. | RET-2000R-F-M-12-C | |
References
- Hansson, G. K., Robertson, A. K., Soderberg-Naucler, C.
- Phillipson, M., Kubes, P.
- Butler, K. L., et al. Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices. PloS one. 5, (2010).
- Lavrentieva, A., et al. Inflammatory markers in patients with severe burn injury. What is the best indicator of sepsis. Burns : journal of the International Society for Burn Injuries. 33, 189-194 (2007).
- De Filippo, K., et al. Mast cell and macrophage chemokines CXCL1/CXCL2 control the early stage of neutrophil recruitment during tissue inflammation. Blood. 121, 4930-4937 (2013).
- Mankovich, A. R., Lee, C. Y., Heinrich, V. Differential effects of serum heat treatment on chemotaxis and phagocytosis by human neutrophils. PloS one. 8, (2013).
- Palabrica, T., et al. Leukocyte accumulation promoting fibrin deposition is mediated in vivo by P-selectin on adherent platelets. Nature. 359, 848-851 (1992).
- Sackmann, E. K., et al. Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays. Blood. 120, (2012).
- Jones, C. N., et al. Microfluidic chambers for monitoring leukocyte trafficking and humanized nano-proresolving medicines interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 20560-20565 (2012).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods Mol Biol. 412, 15-20 (2007).
- Lyons, P. A., et al. Microarray analysis of human leucocyte subsets: the advantages of positive selection and rapid purification. BMC genomics. 8, (2007).
- Hasenberg, M., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PloS one. 6, (2011).
- Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. Neutrophil migration assay from a drop of blood. Lab on a chip. 8, 2054-2061 (2008).
- Hoang, A. N., et al. Measuring neutrophil speed and directionality during chemotaxis, directly from a droplet of whole blood. Technology. 0, 1-9 (2013).
- Kurihara, T., et al. Resolvin D2 restores neutrophil directionality and improves survival after burns. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. , (2013).
- Buffone, V., Meakins, J. L., Christou, N. V. Neutrophil function in surgical patients. Relationship to adequate bacterial defenses. Arch Surg. 119, 39-43 (1984).
- Malawista, S. E., de Boisfleury Chevance, A., van Damme, J., Serhan, C. N. Tonic inhibition of chemotaxis in human plasma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 17949-17954 (2008).
