Summary
Ce protocole détaille un test destiné à mesurer la chimiotaxie des neutrophiles humaine d'une gouttelette de sang total avec une reproductibilité robuste. Cette approche évite la nécessité d'une séparation des neutrophiles et ne nécessite que quelques minutes de test de temps de préparation. La puce microfluidique permet la mesure répétée de la chimiotaxie des neutrophiles au fil du temps chez les nourrissons ou les petits mammifères, où le volume de l'échantillon est limité.
Abstract
Les neutrophiles jouent un rôle essentiel dans la protection contre les infections et leur nombre dans le sang sont souvent mesurés à la clinique. Le nombre de neutrophiles plus élevés dans le sang sont généralement un indicateur des infections en cours, tandis que faible numération des neutrophiles sont un signe d'alerte pour des risques plus élevés pour les infections. Pour accomplir leurs fonctions, les neutrophiles doivent également être en mesure de se déplacer efficacement dans le sang où ils passent la plupart de leur vie, dans les tissus, où les infections se produisent. Par conséquent, tous les défauts de la capacité des neutrophiles de migrer peuvent augmenter les risques d'infections, même lorsque les neutrophiles sont présents en nombre suffisant dans le sang. Toutefois, la mesure de la capacité de migration des neutrophiles dans la clinique est une tâche difficile, qui prend du temps, nécessite volume important de sang, et les connaissances d'experts. Pour répondre à ces limitations, nous avons conçu un solide tests microfluidiques pour la migration des neutrophiles, qui nécessite une seule goutte de sang non traité, circumévents la nécessité d'une séparation des neutrophiles, et est facile à quantifier sur un simple microscope. Dans ce dosage, les neutrophiles migrent directement à partir de la goutte de sang, à travers de petits canaux, vers la source de chimio-attractif. Pour éviter que le flux granulaire de globules rouges par la même voie, nous avons mis filtres mécaniques avec des virages à angle droit qui bloquent sélectivement l'avance de globules rouges. Nous avons validé le test en comparant la migration des neutrophiles de gouttelettes de sang prélevés de piqûre au doigt et le sang veineux. Nous avons également comparé les sang total (WB) sources de la migration des neutrophiles à partir d'échantillons de neutrophiles purifiés et trouvé une vitesse constante et la directionnalité entre les trois sources. Cette plate-forme microfluidique permettra l'étude de la migration des neutrophiles humain dans la clinique et le contexte de la recherche pour faire avancer notre compréhension des fonctions des neutrophiles dans la santé et la maladie.
Introduction
trafic de neutrophiles joue un rôle déterminant dans l'évolution et la résolution de nombreuses affections inflammatoires, y compris l'athérosclérose 1, infection bactérienne ou une septicémie 2, et 3 de brûlures. Pour leur importante contribution à des conditions de santé et de maladie, le nombre de neutrophiles est partie de l'analyse de sang norme souvent considéré dans les laboratoires cliniques et de recherche. Toutefois, en dépit d'être l'un des tests les plus répandus, la valeur de la numération des neutrophiles dans le diagnostic de l'infection et de septicémie a été souvent interrogé 4. Par exemple, une étude de neutrophiles chez les patients atteints de brûlures a révélé que le nombre de neutrophiles et la fonction de la migration des neutrophiles ne concordent pas; ce qui signifie que nombre de neutrophiles seul n'est pas un indicateur précis de l'état immunitaire 3. Bien que plus difficile à mesurer, la compétence fonctionnelle des neutrophiles a été proposée comme plus précieuse dans un large éventail de conditions.
t "> Surtout, la plupart des défauts de neutrophiles sont transitoires et ne sont pas déclenché par des anomalies génétiques permanents, une distinction qui a été largement négligé dans la clinique jusqu'à récemment. Dans le cadre de brûlure, la migration des neutrophiles pourrait être surveillée au cours de le traitement d'un patient comme un indicateur de l'état inflammatoire ou une infection 3. tests traditionnels de migration actuellement utilisés dans le laboratoire (chambre de Boyden, chambre Dunn, micropipette essai) ne peut pas être traduite dans un cadre clinique, car ils nécessitent de grandes quantités de sang et encombrant temps Des techniques d'isolation des neutrophiles (tableau 1). Ces dosages peuvent également pas être utilisés pour surveiller des changements transitoires de la chimiotaxie des neutrophiles chez les petits animaux de laboratoire, tels que les souris, parce que le volume de sang nécessaire pour l'isolement des neutrophiles permet un seul échantillon, et souvent même exige la mise en commun d' le sang de plusieurs animaux pour un seul essai. Par exemple, une étude portant sur mconditions ultiple et des traitements sur plusieurs points dans le temps pourraient exiger des milliers de souris en utilisant des tests de chimiotactisme actuelles. Cela limite la recherche biologique de base qui peut être fait pour comprendre la dynamique complexe de la fonction immunitaire dans le cadre de blessure, une infection ou brûler souvent étudiée dans les modèles murins 5.Pour répondre à la nécessité d'un dosage fonctionnel des neutrophiles qui est rapide et robuste, tout en nécessitant un minimum de volume de sang, nous avons développé un dispositif microfluidique qui mesure directement la chimiotaxie des neutrophiles à partir d'une petite gouttelette de sang total. Il est connu que de nombreux facteurs dans le sang total, le sérum, y compris les plaquettes 6 et 7, affectent la fonction des neutrophiles. Il est donc avantageux que l'ensemble de dosage microfluidique de sang réduit au minimum le traitement des échantillons pour maintenir le micro-environnement in vivo de la neutrophiles lors de la mesure des variations de la chimiotaxie avec un essai in vitro 8. Cette approcheréduit le temps de collecte de sang pour des tests de migration des neutrophiles provenant heures en utilisant des techniques classiques, à quelques minutes (tableau 1). L'ensemble de la plate-forme de micro-fluidique de sang produit un gradient chimiotactique linéaire stable pour la durée de l'expérience, n'a pas de parties mobiles, et ne nécessite pas une source de pression externe (par exemple de la pompe à seringue). La caractéristique clé de la conception de l'ensemble du dispositif de microfluidique sanguin est l'incorporation d'un globule rouge (RBC) de peigne de filtration qui filtre mécaniquement les globules rouges de pénétrer dans le canal de migration du dispositif. Les virages à droite de ce peigne de filtration empêchent la nécessité pour la filtration d'exclusion de taille, qui serait susceptible d'être bouché par les globules rouges et donc bloquent le gradient chimiotactique d'atteindre les neutrophiles migrent activement à la Banque mondiale. L'incorporation de l'ensemble du dispositif de microfluidique de sang dans une plaque à 12 ou 24 puits facilite le criblage de multiples médiateurs de la chimiotaxie des neutrophiles si humaine ou murinemultanément.
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Protocol
1. Microfluidique fabrication de périphériques
- En utilisant des techniques de photolithographie standard fabriquer le moule maître plaquette dans une salle blanche de classe 1000. Motif du premier 3-um-mince couche de résine photosensible négative à base d'époxy pour définir les voies de migration selon les instructions du fabricant. Motif de la deuxième couche de 50 um d'épaisseur pour définir les cellules de chargement et de chimiokines chambres.
- Utilisez la plaquette motifs de jeter polydiméthylsiloxane appareils (PDMS). Mélanger vigoureusement PDMS (20 g) avec un initiateur (2 g) pendant 5 minutes en utilisant une fourchette en plastique dans un grand plateau de pesée en plastique.
- Versez délicatement PDMS sur moule.
- Dégazer le moule en plaçant PDMS avec PDMS coulé dans un dessiccateur sous vide pendant 1 heure.
- Cuire au four et guérir dispositifs microfluidiques PDMS pendant au moins 3 heures dans un four réglé à 65 ° C.
- Percez les WBLCs centrales utilisant un perforateur avec un diamètre de 1,5 mm de pointe.
- Punch out dispositifs en forme de beignet entiers en utilisant une ponctuaelle avec un diamètre de 5,0 mm de pointe.
- Retirer les particules de dispositifs de beignet avec du ruban adhésif.
- Rincer une plaque de 12 puits avec de l'eau déminéralisée et sécher avec de l'azote. Placer la plaque dans le four à 60 ° C pendant 5 min.
- plasma d'oxygène traiter la plaque de 12 puits à deux reprises; une fois seul pour 35 secondes, puis de nouveau avec les dispositifs de beignet pour un autre 35 secondes.
- Placez délicatement dispositifs dans les puits de la plaque à l'aide de pinces.
- Cuire au four avec plaque périphériques liés sur une plaque chauffante réglée à 80 ° C pendant 10 min.
2. Dosage microfluidique Préparation
- Premiers dispositifs microfluidiques immédiatement après le traitement par plasma d'oxygène, lorsque le dispositif est hydrophile et les effets capillaires peut favoriser l'amorçage des petits canaux dans le dispositif.
- Créer solution chimioattractive en mélangeant 5 pi fMLP [solution stock 10 uM] avec 5 pi fibronectine [solution mère à 1 mg / ml] et 490 ul de HBSS.
- Lentement pipette & #160; solution chemoattractant dans WBLC, en utilisant une pointe de chargement de gel (figure 1A). Une pipette 20 ul supplémentaires de l'agent chimio-attractif autour de l'extérieur du dispositif.
- Placer la plaque dans un dessiccateur pendant 15 min. Par application d'un vide à l'appareil, la solution est instillée dans les chaînes latérales de l'appareil et l'air déplacé diffuse à travers les PDMS.
- Retirer la plaque du dessiccateur et confirmer mouillage du canal de l'appareil sous le microscope. Regardez comme bulle devient plus petit que solution chimioattractive pénètre dans la chambre. Aucune bulle ne doit être présent dans le dispositif après traitement sous vide.
- Laver le WBLC et à l'extérieur de l'appareil à fond pour éliminer la solution de chemoattractant excès. Cette étape génère un gradient de chemoattractant de chacune des chambres chimiotactiques focaux (FCC) au centre de l'appareil.
- Remplir une seringue de 1 ml avec du PBS, ajouter une pointe d'aiguille émoussée 30 G à la seringue. Doucement, insérer la pointe de l'aiguille de la seringue dansau centre du trou de beignet. Poussez doucement 100 pi de PBS dans le trou de sorte qu'une goutte de formes PBS sur le dessus de l'appareil.
- la plaque d'inclinaison et la pipette 1 ml de PBS autour de dispositif de sorte que le liquide se rassemble au fond du puits. Aspirer le liquide de processus et de répétition pour un total de 3x en utilisant une solution tampon frais (utilisation des médias au lieu de tampon si les neutrophiles séparés seront chargés dans les médias) 9.
- Remplir chaque puits avec les médias jusqu'à ce que le dessus de l'appareil sont submergées par liquide. Laissez les dispositifs assis pendant 15 minutes pour permettre gradient de se stabiliser. Les résultats expérimentaux et théoriques données de simulations par éléments finis montrent que les gradients de ces dispositifs sont stables jusqu'à 24 heures pour les petites molécules (par exemple, fMLP) et jusqu'à plusieurs jours pour un plus grand poids moléculaire (par exemple, IL8).
- En utilisant des pointes gel de chargement, la pipette lentement 2 pl de sang (ou neutrophiles isolés) dans chaque ensemble de loa sangding chambre (WBLC) (figure 1A).
3. Préparation de l'échantillon
Les neutrophiles humains De sang capillaire
- Prélever le sang capillaire de piqûre au doigt de volontaires sains, qui est sur aucun des immunosuppresseurs. Tous les échantillons de patients ont été obtenus avec le consentement éclairé, et selon les procédures approuvées par le MGH et Shriners Institutional Review Boards.
- Pour la collecte de sang au bout du doigt, se laver les mains avec de l'eau et du savon et séchez la peau. Préparer une solution stock anti-coagulant/stain en ajoutant 1 ml de HBSS + 0,2% HSA et 10 pi de Hoechst tache (32,4 M) à l'héparine tube de collecte de sang (1,65 USP/50 ul de sang). Piquer le doigt avec une lancette de sécurité SurgiLance (profondeur de 2,2 mm, 22 G), essuyer la première goutte de sang et de recueillir 50 pi de sang dans tube Eppendorf contenant le stock d'anti-coagulant et solution fluorescente tache Hoechst (10 pi) et doucement mélanger.
Les neutrophiles humaines à partir de sang veineux
- Tracer 10 ml de sang périphérique, veineuse dans des tubes contenant de l'héparine USP 33.
- Ajouter 50 ul de sang veineux aux médias et Hoechst tache comme décrit précédemment. Incuber le sang et Hoechst tache pendant 10 min pour permettre la coloration fluorescente noyau. Exécutez échantillon dans 1 heure de la collecte de sang.
Neutrophiles Séparation De sang total - Contrôle positif
- Pour séparer les neutrophiles, en utilisant des techniques stériles pour isoler des neutrophiles à partir de la 10 ml veineux échantillon de sang entier en utilisant Hetastarch (6% p / v) à gradient de densité, suivie par une sélection kit d'isolation de bille magnétique négatif suivant le protocole du fabricant.
- Remis en suspension la fraction aliquote finale de neutrophiles à une concentration de 4.000 cellules / ul dans du HBSS 1X + 0,2% d'albumine de sérum humain. Maintenir les cellules à 37 ° C jusqu'au moment de lancer l'expérience.
4. Microscopie et analyse d'images pour les mesures chimiotaxie des neutrophiles
- Régler la température de biochambre à 37 ° C, humidité de 80%, et de CO 2 à 5%.
- Lancer immédiatement d'utiliser l'imagerie imagerie time-lapse sur un microscope (grossissement 10X ou ultérieure).
5. Analyse statistique
- Suivi manuel au moins 50 neutrophiles dans chaque échantillon.
- Compter les cellules qui entrent dans le FCC au cours du temps (figure 2).
- Calculer les vitesses de neutrophiles dans le canal entre WBLC et FCC en utilisant ImageJ (NIH) (Figure 2).
- Quantifier la directionnalité des neutrophiles en comptant le nombre de cellules qui passent à la bifurcation et en calculant le rapport entre le nombre de cellules qui se transforment vers le FCC et les cellules qui sortent èmee dispositif. Les cellules qui ne sont pas directionnel ne suivent pas le gradient chimiotactique et, par conséquent, en nombre égal migrent vers le FCC et le canal de sortie (Figure 2).
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Representative Results
Le sang total (WB) essai de chimiotaxie des neutrophiles a été validé par la mesure de l'accumulation des neutrophiles vers un gradient fMLP (Film S1). Les résultats confirment que les globules rouges sont piégés par le peigne de filtration alors que les neutrophiles (bleus) sont capables de migrer activement sur sang total (Figure 3A et Movie S1). Le gradient linéaire stable chimiotactique (vert), formé par l'ensemble du dispositif de microfluidique de sang a été confirmée à l'aide de dextrane marqué au FITC (figure 3A encart) et a mesuré les niveaux de fluorescence au cours du temps. Les gradients produits dans ces dispositifs étaient stables jusqu'à 24 heures pour les petites molécules et jusqu'à une semaine pour plus grand poids moléculaire. L'efficacité du protocole de lavage a été vérifiée par imagerie de signal fluorescent localisée dans le FCC, avec aucun signal dans le WBLC ou entourant le dispositif. Les appareils ont ensuite été utilisées pour évaluer les différences dans la migration des neutrophiles de différents blsources ood.
Les résultats obtenus en utilisant la nouvelle plate-forme de chimiotactisme BM révèlent que les neutrophiles d'une goutte au bout du doigt de la Banque mondiale, de la Banque mondiale veineux ou isolés à partir de sang veineux migrer à une vitesse uniforme (20 ± 2 mm / min, ligne bleue) et avec des cellules migratrices totales similaires ( 38 ± 10 cellules / h, barres grisées) de toutes les sources de sang (figure 3B). Nous avons également été en mesure de quantifier la directionnalité ou la capacité des neutrophiles à suivre correctement le gradient chimiotactique. La bifurcation incorporé dans la conception de l'ensemble du dispositif de sang nous a permis de quantifier les neutrophiles qui migrent le long directionnelle gradient chimiotactique vers la FCC par rapport aux neutrophiles qui ont migré au hasard sous chimiokinèse et sont sortis du dispositif. Les neutrophiles migrent à partir des trois sources de sang ont migré avec un indice de directivité de 0,9 (9 cellules vers la FCC pour chaque cellule qui est sorti de l'appareil).
Figure 1. Schéma de dispositif en forme de beignet. A) Chemoattractant est amorcée dans le dispositif et un gradient est formée le long du canal de migration vers les chambres de chimiotactisme focaux (FCC). Seize FCC entourent chaque WBLC. Après lavage, le chimioattractant seulement reste dans le FCC, et un gradient linéaire est formée le long du canal de migration. Le globule rouge (RBC) peigne de filtration empêche l'encrassement de globules rouges à partir de la chaîne et blocage de la migration des neutrophiles active. Voir Film S1. B) Les neutrophiles migrent activement de sang total et s'accumulent dans la FCC, et leur vitesse, la directivité et de numéros peuvent être quantifiés avec précision. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.
Figure 2. Schéma et aperçu de système de comptage de cellules de dispositif WB. Les neutrophiles migrent activement de 2 pi de sang total (WB) chargé dans la chambre de chargement de sang total (WBLC) passé le peigne rouge de filtration des cellules sanguines et dans l'entrée de l'appareil. Directionnalité de la cellule est mesurée sur la base de la décision de la cellule à la bifurcation. Neutrophiles directionnelles vont suivre le gradient chimiotactique menant vers les cellules de la chambre de chimiotactisme et non-directionnelles focaux ne suivra pas la pente et vont migrer au hasard soit vers le canal de sortie ou FCC, avec une répartition égale. Numération cellulaire finale est calculée à chaque point de temps en comptant les cellules dans le FCC.files/ftp_upload/51215/51215fig2highres.jpg "target =" _blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Mesurer la chimiotaxie des neutrophiles à partir d'une goutte de sang total (WB). A) WB (1 pi) est chargé dans l'ensemble de la chambre de chargement de sang (WBLC). Neutrophiles (bleu) migrent le long du gradient fMLP chimiotactique formé dans le canal de migration vers la FCC. B) Les neutrophiles à partir d'une goutte de piqûre au doigt de la Banque mondiale, de la Banque mondiale veineuse, ou isolés à partir du sang veineux migrer avec des chiffres cohérents (barres) et la vitesse (bleu ligne). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Tableau 1. Comparaison des protocoles pour la chimiotaxie des neutrophiles à l'aide de l'ensemble de plate-forme de micro-fluidique de sang par rapport à un dispositif microfluidique côté canal et dans la chambre de Boyden traditionnel. La quantité de temps et de réactifs pour effectuer chacune des étapes du protocole sont comparées entre les différentes méthodes pour mesurer la chimiotaxie des neutrophiles. L'ensemble de la plate-forme microfluidique de sang réduit le temps total nécessaire pour effectuer le dosage de 95% et le volume de sang nécessaire> 99%.
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Discussion
Dans ce travail, nous avons développé une plate-forme microfluidique pour mesurer la chimiotaxie des neutrophiles à partir d'une goutte de sang (2 pi). La filtration sur puce mécanique des globules rouges à partir de la migration des neutrophiles activement contourne le besoin de méthodes lourdes de séparation de cellules telles que les gradients de densité 10, 11 sélection positive, la sélection négative ou 12, qui sont susceptibles d'introduire des artefacts en activant les neutrophiles. La filtration mécanique des globules rouges qui distingue notre technologie à d'autres puces microfluidiques pour sonder la migration des neutrophiles. Par exemple, des travaux antérieurs de notre laboratoire 13 et Beebe et al. Sélectines 8 utilisés sur la puce, pour séparer des neutrophiles à partir de l'échantillon de sang entier, avant l'essai de chimiotaxie. Après la séparation sur des surfaces de sélectine, la migration des neutrophiles s'est produite dans la solution tampon. Dans ces conditions, aucun effet du sérum sur la chimiotaxie des neutrophiles a été éliminé. En outre, les sélectines sont connuspour activer les cellules en engageant des récepteurs spécifiques et donc susceptible de modifier dans les mesures de chimiotaxie in vitro. La séparation mécanique par le peigne de filtration RBC dans notre dispositif ne modifie pas l'état de neutrophiles mesurées par notre dispositif. Notre dispositif facilite les mesures robustes de la vitesse et de la cellule numéro d'accumulation ainsi que la directivité de la cellule.
Dans cette étude, nous avons montré que les neutrophiles migrent à partir de volontaires en bonne santé de tout le sang capillaire, une goutte de sang veineux, et séparé du sang veineux migrent avec la vitesse et la directionnalité 14 similaire. La mesure de la directivité des neutrophiles est important dans les états inflammatoires, tels que des brûlures 3, 15 et 16, où le traumatisme directivité est connue pour être altérée. Altérées et plus stimulés neutrophiles peuvent migrer loin du site de la lésion et causer des blessures aux tissus sains. Une limitation du dispositif présenteed dans cet article est que l'enrichissement de la cellule de l'appareil n'est pas possible et donc le nombre de cellules dépendent de la proportion qu'ils se trouvent dans le sang total natif. Ceci peut poser des problèmes dans l'acquisition des mesures à partir chimiotaxie un nombre important de cellules dans des conditions telles que la neutropénie, où le nombre de neutrophiles est faible. Un autre problème potentiel dans notre dispositif est l'encombrement stérique de la migration des cellules de globules rouges ou d'autres cellules qui migrent en même temps. Dans nos expériences, les neutrophiles peuvent se faufiler globules rouges dernières piégés dans les tours du peigne de filtration RBC sans changer leur vitesse de migration. En outre, la concentration et l'activité chimiotactique est extrêmement important dans l'induction de la migration cellulaire. Pour résoudre le dosage avec d'autres conditions, il peut être important d'exécuter courbes dose-réponse avec différentes grandeurs de chemoattractant. Manipulation et traitement chemoattractants plus instables tels que les médiateurs lipidiques est également crucial, il est donc important de dispositifs principauximmédiatement avant WB chargement. Enfin, il est également essentiel que l'ensemble du sang ne coagule pas avant l'amorçage du dispositif WB. Si ce n'est pas possible d'exécuter le test immédiatement après le prélèvement de sang de sang doit être conservé sur une bascule à l'héparine. Chargement de l'échantillon doit être fait lentement, avec soin de ne pas introduire une pression excessive dans le dispositif de la BM.
Dans l'avenir, notre dispositif peut être utilisé pour mesurer les perturbations de la fonction des neutrophiles dans brûlure ou patients victimes de traumatismes sans enlever le neutrophiles à partir de sérum d'origine du patient, qui joue probablement un rôle clé dans le dysfonctionnement des neutrophiles 17. Ce dispositif peut également être utilisé à l'avenir pour dépister thérapeutiques potentiels pro-résolution à restaurer la fonction des neutrophiles normale chez ces patients. Enfin, ce dispositif peut en outre être conçu pour mesurer la chimiotaxie des autres cellules migratrices telles que les monocytes, les macrophages et les cellules T.
En conclusion, nous avons développé une novel Procédé de mesure de la chimiotaxie des neutrophiles directement à partir d'une gouttelette de sang total. L'incorporation de l'ensemble du dispositif de microfluidique de sang dans une plaque à 12 ou 24 puits facilite le criblage de multiples conditions simultanément. Ce dispositif facilitera le développement de médiateurs de l'inflammation de la résolution pour traiter brûlures et d'autres états inflammatoires. Dans l'avenir, ce dispositif sera utilisé pour mesurer les perturbations en fonction chimiotactique des neutrophiles au fil du temps dans les échantillons de patients et des modèles murins où le volume de l'échantillon est limité.
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Disclosures
Il n'existe aucun conflit d'intérêt à divulguer.
Acknowledgments
Le soutien des National Institutes of Health (accorde GM092804, DE019938) et de l'Hôpital Shriners Burns.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Device Fabrication | |||
| SU-8 | Microchem | Y131273 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 1.1 lb. Kit | |
| Standard glass slides | Fisher Scientific | 125495 | 1 X 3 inches |
| Glass-bottom plate | MatTek | P12G-1.5-14-F | |
| Harris Uni-Core, Tip Diameter 5.0 mm | Ted Pella, Inc. | 15081 | |
| Harris Uni-Core, Tip Diameter 1.5 mm | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Microfluidic Assay Preparation and Analysis | |||
| Gel-loading pipet tip | Fisher Scientific | 02-707-139 | |
| Syringe | Fisher Scientfic | 309602 | |
| Blunt tip needle, 30 G ½ in. | Brico Medical Supply | BN3005 | |
| Vacutainer, Heparin | Becton Dickinson | ||
| HBSS | Sigma-Aldrich | ||
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A5843-5G | 0.2% final concentration in HBSS |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895-1MG | |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506-10MG | |
| SurgiLance safety lancet, 2.2-mm depth, 22 G | SLN240 | ||
| Hoescht stain | Life Technologies | H3570 | |
| Positive Control | |||
| HetaSep | STEMCELL Technologies Inc. | 7906 | |
| EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit | STEMCELL Technologies Inc. | 19257 | |
| Plasma Asher | March Instruments | P-250 | |
| Lindberg/Blue M Oven | Thermo Scientific | 13-258-30C | |
| Stainless Steel Precision Tweezers | Techni Tool | 758TW458 | |
| Bel-Art Scienceware Chemical-Resistant Vacuum Desiccator | Fisher Scientific | 08-594-15A | |
| Dataplate Digital Hot Plate | Alpha Multiservices | PMC 720 | |
| Nikon TiE inverted microscope | Nikon - Micro Video Instruments Inc. | MEA53100 | |
| CFI Plan Fluor DL 10X NA 15.2 wd Objective | Nikon - Micro Video Instruments Inc. | MRH20101 | |
| Lumen 200 with 2 Meter Light Guide for Nikon | Nikon - Micro Video Instruments Inc. | 500-L200NI2 | |
| DAPI/Hoechst/AMCA Narrow Band 32-mm Exciters - 25-mm Emitters | Chroma - Micro Video Instruments Inc. | 31013v2 | |
| Retiga R 2000 cooled CCD Camera 1,600 x 1,200 pixels | Qimaging - Micro Video Instruments Inc. | RET-2000R-F-M-12-C | |
References
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