Summary
Detta protokoll detaljer en analys som syftar till att mäta human neutrofil kemotaxi från en droppe helblod med robust reproducerbarhet. Detta tillvägagångssätt kringgår behovet av neutrofila separation och kräver bara några minuter av analys förberedelsetid. Den mikroflödessystem chip möjliggör upprepade mått på neutrofila kemotaxi över tid hos spädbarn eller små däggdjur, där provvolym är begränsad.
Abstract
Neutrofiler spelar en viktig roll i försvaret mot infektioner och deras nummer i blodet ofta mäts i kliniken. Högre neutrofila granulocyter i blodet är oftast ett tecken på pågående infektioner, medan lågt antal neutrofila granulocyter är en varningssignal för högre risker för infektioner. För att utföra sina uppgifter, neutrofiler måste också kunna röra sig effektivt från blodet där de tillbringar större delen av sitt liv, in i vävnader, där infektioner uppstå. Följaktligen kan eventuella defekter i förmågan hos neutrofiler att migrera öka riskerna för infektioner, även när neutrofiler är närvarande i lämpligt antal i blodet. Men mäter neutrofilmigrationen förmåga på kliniken är en utmanande uppgift, vilket är tidskrävande, kräver stor mängd blod, och expertkunskap. För att lösa dessa begränsningar, konstruerade vi en robust mikroflödesanalyser för neutrofil migration, vilket kräver en enda droppe av obehandlat blod, omständighetervents behovet av neutrofil separation, och är lätt att kvantifiera på ett enkelt mikroskop. I denna analys neutrofiler migrerar direkt från bloddroppe, genom små kanaler i riktning mot källan chemoattractant. För att förhindra att det granulära flöde av röda blodkroppar genom samma kanaler, genomförde vi mekaniska filter med rätt vinkel visar att selektivt blockera det för-av röda blodkroppar. Vi validerat analysen genom att jämföra neutrofilmigrationen från bloddroppar som samlats in från fingerprick och venöst blod. Vi jämförde även dessa helblod (WB) källor med neutrofil migration från prover av renade neutrofiler och fann konsekvent hastighet och riktning mellan de tre källorna. Denna mikroflödessystem plattform möjliggör studiet av mänskliga neutrofilmigrationen i kliniken och inställningen forskning för att förbättra vår förståelse av neutrofila funktioner i hälsa och sjukdom.
Introduction
Neutrofil handeln spelar en avgörande roll för att bestämma utvecklingen och upplösningen av många inflammatoriska tillstånd, däribland åderförkalkning 1, bakterieinfektion eller sepsis 2, och brännskador 3. För deras stora bidrag till hälso-och sjukdomstillstånd, är neutrofiler del av standarden blodanalys ofta som i kliniska och forskningslaboratorier. Men trots att en av de mest utbredda tester, värdet av neutrofiler vid diagnos av infektion och sepsis har ofta ifråga 4. Till exempel visade en studie av neutrofiler i brännskadepatienter som neutrofiler och neutrofil migration fungerar inte korrelerar; innebärande att neutrofilantal ensam inte är en exakt indikator på immunstatus 3. Även svårare att mäta, har neutrofila funktionell kompetens föreslagits som mer värdefull i ett brett spektrum av förhållanden.
t "> Viktigt många av neutrofila defekter är övergående och inte utlöses av permanenta genetiska defekter, en distinktion som har förbisetts i kliniken tills nyligen. I samband med brännskador, kan neutrofilmigration övervakas under en patients behandling som en indikator på inflammatorisk status eller infektion 3. Traditionella migrationsanalyser som för närvarande används i laboratoriet (Boyden kammare, Dunn kammare, mikropipett analys) kan inte översättas till en klinisk miljö eftersom de kräver stora mängder blod och besvärliga tidsödande neutrofilt isoleringstekniker (Tabell 1). Dessa analyser kan inte heller användas för att övervaka gående förändringar i neutrofil kemotaxi i små laboratoriedjur, såsom möss, eftersom volymen av blod som krävs för neutrofil isolering möjliggör endast ett prov och ofta till och med kräver sammanslagning av blod från flera djur för en enda analys. Exempelvis en studie med multiple villkor och behandlingar under flera tidpunkter skulle kunna kräva tusentals möss med dagens kemotaxi analyser. Detta begränsar den grundläggande biologisk forskning som kan göras för att förstå den komplexa dynamiken i immunförsvaret i samband med skada, infektion eller bränna ofta studerat i musmodeller 5.För att tillgodose behovet av en neutrofil funktionell analys som är snabba, robusta, samtidigt som den kräver minimal blodvolym, har vi utvecklat en mikrofluidanordning som mäter neutrofil kemotaxi direkt från en liten droppe helblod. Det är känt att många faktorer i helblod, däribland serum 6 och trombocyter 7, påverkar neutrofil funktion. Det är därför fördelaktigt att helblodet microfluidic assay minimerar provbearbetning för att bibehålla mikromiljön av neutrofil in vivo när man mäter variationer i kemotaxi med en in vitro analys 8. Detta tillvägagångssättreducerar tiden från blodsamling till neutrofil migration assays från timmar med användning av traditionella tekniker, för att bara några minuter (tabell 1). Hela blodmikroflödessystem plattform ger en stabil linjär chemoattractant gradient för längden av experimentet, har inga rörliga delar, och inte kräver en extern tryckkälla (dvs sprutpump). Den viktigaste funktionen i utformningen av helblod mikroflödessystem enhet är införlivandet av en röda blodkroppar (RBC) filtrerings kam som mekaniskt filtrerar röda blodkropparna från att komma in i migrationskanal på enheten. Rätt varv av denna filtrerings kam förebygga behovet av storleksuteslutande filtrering, vilket sannolikt skulle vara igensatt av de röda blodkropparna och därmed blockera chemoattractant gradient från att nå de aktivt flyttande neutrofiler i WB. Införlivandet av helblod mikroflödessystem enhet i en 12 eller 24-brunnar underlättar screening av multipla mediatorer för människa eller mus neutrofil kemotaxi simultaneously.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mikroflödessystem enhet Fabrication
- Med hjälp av fotolitografiska standardtekniker, tillverka master mögel rånet i en klass 1000 renrum. Mönster den första 3-nm-tunna epoxibaserad negativt fotoresistskikt att definiera migrationskanalerna enligt instruktionerna från tillverkaren. Mönster den andra 50-nm-tjockt lager för att definiera cell-lastning och kemokina kammare.
- Använd mönstrat skiv att gjuta polydimetylsiloxan (PDMS)-enheter. Kraftfullt Blanda PDMS (20 g) med initiator (2 g) under 5 minuter med hjälp av plastgaffel i stor plast väger facket.
- Häll försiktigt PDMS på mögel.
- Avgasa PDMS genom att placera formen med hälldes PDMS i en vakuumexsickator under 1 timme.
- Bakning och härdning PDMS mikrofluidikanordningar under minst 3 h i en ugn inställd på 65 ° C.
- Stansa ut de centrala WBLCs använder ett hålslag med en spets diameter på 1,5 mm.
- Stansa ut hela donut-formade enheter med en punktlighenne med en spets diameter på 5,0 mm.
- Ta bort partiklar från donut enheter med tejp.
- Skölj en 12-brunnar med avjoniserat vatten och torka sedan med kvävgas. Placera plattan i 60 ° C ugn under 5 min.
- Syre plasma behandla 12-brunnar två gånger; en gång ensam i 35 sekunder och sedan igen med donut anordningar för ytterligare 35 sek.
- Placera försiktigt anordningar i brunnarna på plattan med användning av pincett.
- Grädda tallrik med bundna enheter på en värmeplatta inställd på 80 ° C i 10 min.
2. Microfluidic analys Förberedelse
- Prime mikrofluidikanordningar omedelbart efter syreplasmabehandling, när anordningen är hydrofil och kapillära effekter kan främja primning av de små kanalerna i anordningen.
- Skapa chemoattractant lösning genom blandning av 5 pl fMLP [förrådslösning 10 uM] med 5 | il fibronektin [förrådslösning 1 mg / ml] och 490 | il HBSS.
- Sakta pipett & #160; chemoattractant lösning in WBLC, med användning av en gel loading spets (Figur 1A). Pipet ytterligare 20 | il av kemoattraherande runt utsidan av anordningen.
- Placera plattan i en exsickator under 15 min. Genom att anbringa ett vakuum till anordningen, lösningen instilleras in i sidokanaler hos anordningen och den undanträngda luften diffunderar ut genom PDMS.
- Ta bort plattan från exsickator och bekräfta vätning av enhet kanalen under mikroskop. Se när bubblan blir mindre som chemoattractant lösning kommer in i kammaren. Ingen bubbla bör finnas inom enheten efter vakuumbehandling.
- Tvätta WBLC och utsidan av anordningen noggrant för att avlägsna överskott av kemoattraherande lösning. Detta steg ger en lutning på kemoattrahent från var och en av de bränn kemotaktiska kammare (FCC) till enheten centrum.
- Fyll en 1-ml spruta med PBS, lägg till en 30 G trubbig nål tips till sprutan. Försiktigt in nålen sprutspetsen itill centrum av munken hålet. Tryck försiktigt 100 fil PBS i hålet så att en droppe PBS former på toppen av anordningen.
- Lutningsskiva och pipett 1 ml PBS i närheten av anordningen, så att vätskan samlas på botten av brunnen. Aspirera vätskan och upprepa processen för totalt 3x med färska buffertlösning (använd media istället för buffert om de separerade neutrofilerna kommer att laddas i media) 9.
- Fyll varje brunn med media tills topparna av enheterna är nedsänkt i vätska. Låt anordningarna sitta i 15 min för att medge lutning stabiliseras. Experimentella resultat och teoretiska data från finita elementsimuleringar visar att gradienter i dessa enheter är stabila upp till 24 timmar för små molekyler (t.ex. fMLP) och upp till flera dagar för större molekylvikt (t.ex. IL8).
- Med hjälp av gel lastning tips, långsamt pipett 2 l av blod (eller isolerade neutrofiler) i varje helblod loading kammaren (WBLC) (Figur 1A).
3. Provberedning
Mänskliga Neutrofiler Från kapillärblodet
- Samla kapillärblod från fingerprick på friska frivilliga, som är på inga immunosuppressiva. Alla patientprover erhölls med skriftligt informerat samtycke, och genom förfaranden som antas av MGH och Shriners Institutional Review Boards.
- För fingerprickblodinsamling, tvätta händerna med tvål och vatten och torka huden. Förbered anti-coagulant/stain förrådslösning genom tillsats av 1 ml HBSS + 0,2% HSA och 10 | il Hoechst färgämne (32,4 pM) till heparin bloduppsamlingsrör (1,65 USP/50 il blod). Prick fingret med hjälp av en SurgiLance Säkerhetslancetten (2,2-mm djup, 22 G), torka bort första bloddroppen och samla in 50 l av blod i Eppendorf-rör som innehåller lager antikoagulant och Hoechst fluorescerande färglösning (10 pl) och försiktigt blanda.
Mänskliga Neutrofiler Från Venös Blood
- Rita 10 ml perifert, venöst blod i rör innehållande 33 USP heparin.
- Addera 50 pl av venöst blod till media och Hoechst stain såsom tidigare beskrivits. Inkubera blodet och Hoechst fläck för 10 min för att möjliggöra för kärnan fluorescerande färgning. Kör prov inom 1 timme för blodinsamling.
Neutrofil Separation från helblod - positiv kontroll
- För att separera neutrofiler använda sterila tekniker för att isolera neutrofiler från 10 ml venöst helblodprov med användning av Hetastarch (6% vikt / volym) densitetsgradient följt av en negativ selektion magnetisk pärla isoleringskit efter tillverkarens protokoll.
- Resuspenderades den slutliga alikvoten av neutrofiler vid en concentration på 4000 celler / il i 1X HBSS + 0,2% humant serumalbumin. Håll cellerna vid 37 ° C tills redo att köra försöket.
4. Mikroskopi och bildanalys för neutrofila Chemotaxis Mätningar
- Konfigurera biochamber temperaturen till 37 ° C, fuktighet på 80%, och CO2 vid 5%.
- Starta omedelbart avbildning med time-lapse avbildning på ett mikroskop (10x eller högre förstoring).
5. Statistisk analys
- Spåra manuellt minst 50 neutrofiler i varje prov.
- Räkna celler som förs in i FCC över tiden (figur 2).
- Beräkna neutrofila hastigheter i kanalen mellan WBLC och FCC med ImageJ (NIH) (Figur 2).
- Kvantifiera rikt av neutrofiler genom att räkna antalet celler som passerar bifurkationen och beräkning av förhållandet mellan antalet celler som vänder mot FCC och celler som utgång: ee enhet. Celler som inte är riktad följer inte kemotaktiska lutning och därför vandrar i samma antal mot FCC och utloppskanalen (figur 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den helblod (WB) neutrofil kemotaxi analys valideras genom mätning av ansamling av neutrofiler mot en fMLP gradient (Film S1). Resultaten bekräftar att de röda blodkropparna fångas av filtrerings kammen medan neutrofiler (blå) har möjlighet att aktivt migrera ut ur helblod (Figur 3A och Film S1). Den stabila linjär kemoattraherande gradient (grön) som bildas av helblod mikrofluidikanordning bekräftades med användning av FITC-märkt dextran (figur 3A infälld) och mätte fluorescensnivåer över tiden. De gradienter som produceras i dessa enheter var stabila upp till 24 h för små molekyler och upp till en vecka för en större molekylvikt. Effektiviteten av tvättprotokoll verifierades genom avbildning lokaliserad fluorescerande signal i FCC med ingen signal i WBLC eller omger anordningen. Anordningarna bredvid används för att bedöma skillnaderna i neutrofil migration från olika blood källor.
Resultat som erhållits med hjälp av romanen WB kemotaxi plattform visar att neutrofiler från en fingerprick droppe WB, från venös WB, eller isoleras från venöst blod vandrar med konsekvent hastighet (20 ± 2 mm / min, blå linje) och med liknande totala flytt celler ( 38 ± 10 celler / tim, skuggade staplar) från alla blodkällor (Figur 3B). Vi har också kunnat kvantifiera riktverkan eller förmåga neutrofila att korrekt följa kemotaxi lutning. Bifurkationen införlivas i utformningen av hela blodenhet tillät oss att kvantifiera neutrofiler som migrerade riktat längs chemoattractant lutning mot FCC jämfört med neutrofiler som migrerade slumpmässigt i kemokines och lämnat enheten. Neutrofiler migrerar från samtliga tre blodkällor migrerade med en riktindex på 0,9 (9 celler mot FCC för varje cell som lämnat enheten).
Figur 1. Schematisk av munkformad enhet. A) kemoattrahent primas in i enheten och en gradient bildas längs migrationskanal mot bränn kemotaxi kamrarna (FCC). Sexton FCC som omger varje WBLC. Efter tvättning kemoattraktanten förblir endast i FCC, och en linjär gradient bildas utmed migrationskanal. Den röda blodkroppar (RBC) filtrering kam förhindrar RBCs täpper till kanalen och blockerar neutrofil aktiv migration. Se film S1. B) Neutrofiler migrerar aktivt av helblod och ansamlas i FCC, och deras hastighet, riktning och siffror exakt kan kvantifieras. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2. Schematisk och överblick av cellräkning system för WB-enhet. Neutrofiler migrerar aktivt ur 2 | il helblod (WB) laddas i helblod laddningskammaren (WBLC) förbi den röda blodkroppen filtrering kam och in i ingången av anordningen. Riktverkan av cellen mäts baserat på cellens beslut vid bifurkation. Riktnings neutrofiler kommer att följa kemotaktiska lutning som leder mot bränn kemotaxi kammare och oriktade celler kommer inte att följa lutning och kommer slumpmässigt vandrar antingen mot utgången kanal eller FCC med en jämn fördelning. Slutlig celltal beräknas vid varje tidpunkt genom räkning av celler i FCC.files/ftp_upload/51215/51215fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Mätning neutrofil kemotaxi från en droppe av helblod (WB). A) WB (1 | il) laddas in i helblod laddningskammaren (WBLC). Neutrofiler (blå) vandrar längs fMLP kemotaktisk gradient bildas i migrationskanal mot den. B FCC) Neutrofiler från en fingerprick droppe WB, från venös WB, eller isoleras från venöst blod vandrar med konsekventa siffror (staplar) och hastighet (blå linje). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1. Jämförelse av protokoll för neutrofil kemotaxi med användning av helblod microfluidic plattform kontra en sidokanal mikrofluidikanordning och den traditionella Boyden-kammare. Mängden tid och reagens för att avsluta varje protokoll steg jämförs mellan olika metoder för att mäta neutrofil kemotaxi. Helblodet microfluidic plattform reducerar den totala tid som krävs för att köra analysen med 95% och den erforderliga volymen av blod> 99%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta arbete har vi utvecklat en mikroflödessystem plattform för att mäta neutrofil kemotaxi från en droppe blod (2 pl). Den on-chip mekanisk filtrering av röda blodkroppar från att aktivt migrera neutrofiler kringgår behovet av krångliga cellseparationsmetoder såsom densitetsgradienter 10, positiv selektion 11 eller negativt urval 12, som är benägna att införa artefakter genom att aktivera neutrofiler. Den mekaniska filtrering av RBC skiljer vår teknologi från andra mikroflödessystem marker för sondering neutrofil migration. Till exempel, tidigare verk från vårt labb 13 och Beebe et al. 8 utnyttjas selektinerna på chipet, för att separera neutrofiler från helblodsprovet, före kemotaxi analysen. Efter separation på selektin ytor, inträffade neutrofil migration i buffertlösning. Under dessa förhållanden var ingen effekt av serum på neutrofil kemotaxi bort. Dessutom är selektiner kändatt aktivera cellerna genom att engagera specifika receptorer och kan därför ändra in vitro mätningar kemotaxi. Den mekaniska separationen av RBC filtrerings kam i vår enhet förändrar inte läget för neutrofiler mäts av vår enhet. Vår enhet underlättar robusta mätningar av hastighet och cellackumulering nummer samt cellriktverkan.
I denna studie har vi visat att neutrofiler från friska frivilliga som migrerar från kapillärt helblod, en droppe av venöst blod, och separeras från venöst blod vandrar med likartad hastighet och riktning 14. Mätningen av neutrofila riktverkan är viktig vid inflammatoriska tillstånd, såsom brännskador 3, 15 och trauma 16, där riktningen är kända för att vara nedsatt. Nedsatt och över stimulerade neutrofiler kan migrera bort från platsen för skadan och eventuellt orsaka skada på frisk vävnad. En begränsning av den enhet som finnsed i denna uppsats är att cell anrikning på enheten är inte möjligt och därför kroppar är beroende av den andel som de finns i den infödda helblod. Detta kan innebära problem att skaffa kemotaxi mätningar från ett stort antal celler i förhållanden såsom neutropeni, där antalet neutrofila granulocyter är låg. Ett annat potentiellt problem i vår enhet är den steriskt hinder att migrera celler av röda blodkroppar eller andra celler som migrerar samtidigt. I våra experiment, kan neutrofiler pressa tidigare RBC fångade i varv av RBC filtrerings kam utan att ändra deras migrationshastighet. Dessutom är oerhört viktigt i att inducera cellmigration kemoattraktanten koncentration och styrka. För att felsöka analysen med andra villkor kan det vara viktigt att köra dos-responskurvor med olika magnituder av chemoattractant. Hantering och bearbetning mer instabila kemoattraktanter såsom lipidmediatorer är också viktigt, så det är viktigt att prime enheteromedelbart före WB belastning. Slutligen är det också viktigt att hela blodet inte koagulerar före grundning WB enheten. Om det inte är möjligt att köra analysen omedelbart efter blodinsamling blod måste lagras på en vippa i heparin. Lastning av prov bör ske långsamt, med omsorg för att inte införa alltför högt tryck i WB-enheten.
I framtiden kan vår enhet användas för att mäta störningar i neutrofila funktion i brännskada eller traumapatienter utan att ta bort den neutrofila från patientens hemland serum, som sannolikt spelar en nyckelroll i neutrofila dysfunktion 17. Den här enheten kan också användas i framtiden för att skärmen potentiella pro-upplösning terapi för att återställa normal neutrofil funktion hos dessa patienter. Slutligen kan denna enhet vara ytterligare konstruerad för att mäta kemotaxi från andra flytt celler såsom monocyter, makrofager och T-celler.
Sammanfattningsvis har vi utvecklat ett novel. Förfarande för mätning av neutrofil kemotaxi direkt från en liten droppe helblod. Införlivandet av helblod mikroflödessystem enhet i en 12 eller 24-brunnar underlättar screening av flera villkor samtidigt. Denna enhet kommer att underlätta utvecklingen av inflammationsmediatorer upplösning för att behandla brännskador och andra inflammatoriska tillstånd. I framtiden kommer enheten att användas för att mäta störningar i neutrofil kemotaktisk funktion över tid i patientprover och musmodeller där provvolym är begränsad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det finns inga intressekonflikter att lämna ut.
Acknowledgments
Stöd från National Institutes of Health (beviljar GM092804, DE019938) och Shriners Burns Hospital.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Device Fabrication | |||
| SU-8 | Microchem | Y131273 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 1.1 lb. Kit | |
| Standard glass slides | Fisher Scientific | 125495 | 1 X 3 inches |
| Glass-bottom plate | MatTek | P12G-1.5-14-F | |
| Harris Uni-Core, Tip Diameter 5.0 mm | Ted Pella, Inc. | 15081 | |
| Harris Uni-Core, Tip Diameter 1.5 mm | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Microfluidic Assay Preparation and Analysis | |||
| Gel-loading pipet tip | Fisher Scientific | 02-707-139 | |
| Syringe | Fisher Scientfic | 309602 | |
| Blunt tip needle, 30 G ½ in. | Brico Medical Supply | BN3005 | |
| Vacutainer, Heparin | Becton Dickinson | ||
| HBSS | Sigma-Aldrich | ||
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A5843-5G | 0.2% final concentration in HBSS |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895-1MG | |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506-10MG | |
| SurgiLance safety lancet, 2.2-mm depth, 22 G | SLN240 | ||
| Hoescht stain | Life Technologies | H3570 | |
| Positive Control | |||
| HetaSep | STEMCELL Technologies Inc. | 7906 | |
| EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit | STEMCELL Technologies Inc. | 19257 | |
| Plasma Asher | March Instruments | P-250 | |
| Lindberg/Blue M Oven | Thermo Scientific | 13-258-30C | |
| Stainless Steel Precision Tweezers | Techni Tool | 758TW458 | |
| Bel-Art Scienceware Chemical-Resistant Vacuum Desiccator | Fisher Scientific | 08-594-15A | |
| Dataplate Digital Hot Plate | Alpha Multiservices | PMC 720 | |
| Nikon TiE inverted microscope | Nikon - Micro Video Instruments Inc. | MEA53100 | |
| CFI Plan Fluor DL 10X NA 15.2 wd Objective | Nikon - Micro Video Instruments Inc. | MRH20101 | |
| Lumen 200 with 2 Meter Light Guide for Nikon | Nikon - Micro Video Instruments Inc. | 500-L200NI2 | |
| DAPI/Hoechst/AMCA Narrow Band 32-mm Exciters - 25-mm Emitters | Chroma - Micro Video Instruments Inc. | 31013v2 | |
| Retiga R 2000 cooled CCD Camera 1,600 x 1,200 pixels | Qimaging - Micro Video Instruments Inc. | RET-2000R-F-M-12-C | |
References
- Hansson, G. K., Robertson, A. K., Soderberg-Naucler, C.
- Phillipson, M., Kubes, P.
- Butler, K. L., et al. Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices. PloS one. 5, (2010).
- Lavrentieva, A., et al. Inflammatory markers in patients with severe burn injury. What is the best indicator of sepsis. Burns : journal of the International Society for Burn Injuries. 33, 189-194 (2007).
- De Filippo, K., et al. Mast cell and macrophage chemokines CXCL1/CXCL2 control the early stage of neutrophil recruitment during tissue inflammation. Blood. 121, 4930-4937 (2013).
- Mankovich, A. R., Lee, C. Y., Heinrich, V. Differential effects of serum heat treatment on chemotaxis and phagocytosis by human neutrophils. PloS one. 8, (2013).
- Palabrica, T., et al. Leukocyte accumulation promoting fibrin deposition is mediated in vivo by P-selectin on adherent platelets. Nature. 359, 848-851 (1992).
- Sackmann, E. K., et al. Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays. Blood. 120, (2012).
- Jones, C. N., et al. Microfluidic chambers for monitoring leukocyte trafficking and humanized nano-proresolving medicines interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 20560-20565 (2012).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods Mol Biol. 412, 15-20 (2007).
- Lyons, P. A., et al. Microarray analysis of human leucocyte subsets: the advantages of positive selection and rapid purification. BMC genomics. 8, (2007).
- Hasenberg, M., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PloS one. 6, (2011).
- Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. Neutrophil migration assay from a drop of blood. Lab on a chip. 8, 2054-2061 (2008).
- Hoang, A. N., et al. Measuring neutrophil speed and directionality during chemotaxis, directly from a droplet of whole blood. Technology. 0, 1-9 (2013).
- Kurihara, T., et al. Resolvin D2 restores neutrophil directionality and improves survival after burns. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. , (2013).
- Buffone, V., Meakins, J. L., Christou, N. V. Neutrophil function in surgical patients. Relationship to adequate bacterial defenses. Arch Surg. 119, 39-43 (1984).
- Malawista, S. E., de Boisfleury Chevance, A., van Damme, J., Serhan, C. N. Tonic inhibition of chemotaxis in human plasma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 17949-17954 (2008).
