ヒト神経の集合体のためのcGMP適用可能な展開法は、幹細胞および前駆細胞は、多能性幹細胞や胎児の脳組織由来

Summary

このプロトコルは、単一の細胞懸濁液に解離することなく、球状の神経幹細胞および前駆細胞集合体の拡大を可能にする新たな機械的なチョッピング方法が記載されている。細胞/細胞接触を維持することは、40以上の継代するための迅速かつ安定的な成長を可能にします。

Abstract

研究実験および臨床試験のための単一の試料から多数の細胞を蓄積するための細胞増殖技術が大幅に幹細胞のコミュニティに利益をもたらす。現在の多くの拡張方法は、労力を要し、高価であり、かつ完全な解離を伴うものは、いくつかの幹細胞および前駆細胞型の分化または早期老化を受ける可能性があります。これらの問題を克服するために、我々は、簡単かつ安価である「チョッピング」と呼ばれる自動化された機械的な継代方法を開発した。この手法は、単一の細胞に化学的または酵素的解離を回避し、代わりに一定の細胞/細胞接触を維持中断、スフェロイド培養の大規模な拡張が可能になります。チョッピング方式は、主に胎児脳由来の神経前駆細胞又はニューロスフィアのために使用されており、最近では、胚及び誘導多能性幹細胞由来の神経幹細胞で使用するために公開されている。プロシージャinvolvES組織培養ペトリ皿にニューロスフェアを播種し、その後効果的に手動で機械的に球を解離させる退屈なプロセスを自動化するセルを鋭い、無菌刃を通す。培養中で細胞を懸濁する良好な表面積対体積比を提供する。 50万の細胞は直径が0.5mm未満の単一神経球内で成長させることができるように。 1 T175フラスコ中に、5000万個以上の細胞でのみ1500万接着培養中に比べて懸濁培養で成長することができます。重要なのは、チョッピング手順は、臨床グレードの細胞産物の大量量産を可能とする、現在の適正製造基準（cGMP）の下で使用されています。

Introduction

単層^1-3または集約ニューロスフェア^4-7のいずれかとして、培養中のげっ歯類の神経幹細胞を増殖の長い歴史があります。また、現像^8-17中枢神経系の種々の領域から単離されたヒト神経前駆細胞（hNPCs）をインビトロで増殖されている。これらの細胞は、双方向性、強力、星状細胞及び神経細胞の両方に分化することができると神経の発達^18,19及び疾患メカニズム^20,21を研究する上で非常に有用なツールとなっている。 hNPCsまた、統合、生存および機能的効果^22〜24種々のレベルの中枢神経系疾患の多くの異なる動物モデルに移植されている。

多くの場合、上皮成長因子（EGF）および/ ​​または線維芽細胞増殖因子^{-2（FGF-2）25-28} – – 、付着^29、三両方伝統的には、齧歯類またはヒト胎児由来のNPCは、増殖因子に暴露される次元スフェロイドシステムは、典型的には単一細胞懸濁液^30-34に酵素的解離を使用して継代する。研究や臨床用細胞を拡大する標準的な方法は、容易な操作のために接着単層としてある。しかし、我々は、酵素的または化学的溶液で継代単層およびニューロスフェアhNPCs、早期老化³⁵をもたらしたことを示した。加えて、酵素的解離は、胚性幹細胞^36〜38で実証されたデータに基づいて、分化および核型異常のレベルの増加をもたらし得る。継代hNPCsの標準的な方法は、現在の適正製造基準相に1臨床試験（細胞株、Neuralstem社幹細胞）行っている（cGMP）のグレードの製品を生産しているが、この方法では限界、細胞増幅のほんの数ラウンドを許可銀行の可能性。

明らかに、大規模な研究の実験と今後の臨床試験では、能力から利益を得ることができる大規模な増殖および細胞バンキングを可能にするためにバルク及び遅延された老化で細胞を伝播する。この必要性に対処するために、我々は細胞間接触を維持する小さなクラスターにそれらを「チョッピング」によって、新規かつ機械的に継代無傷の神経球の自動化された方法を開発した。この方法は、大幅に代替3Dバイオリアクター培養方法⁴⁰で見られるようなそれらの寿命³⁹および懸濁培養物は、単層培養物と比較して、インキュベータ·スペースのより効率的な使用を可能にする増加した。チョッピング設けプロトコルは、通路10よりも1つ大きい胎児試料、標準継代方法を用いて難い偉業から大規模銀行の産生を可能にする。継代hNPCsためのこの方法は、型破りであるが、人気が高まっており、最近では、ヒト胚性及び誘導多能性幹細胞由来の神経幹細胞のような他の細胞型、V INを含む様々な用途のための大規模拡大を可能にしてパブリッシュされた病気のモデリング^41-46 itro。重要なことに、cGMPのグレードHNPC細胞バンクは、既に技術は、将来の臨床応用に向けて適用することができることを実証し、チ​​ョッピング方法で製造されている。

Protocol

1。倫理声明と安全この手順は、ヒトまたは動物由来の細胞培養物の使用を含む。すべての派生組織は、適切な治験審査委員会（S）および/または施設の動物実験委員会（S）で使用する前に承認されなければならない。 すべてのバイオ有害廃棄物は、それぞれの機関が合意決定安全規則に従って廃棄しなければならない。この手順全体でしっくり来るの安全および廃棄に関する…

Representative Results

図5。代表的なデータ。A）は、チョッピングメソッドを介して継代したニューロスフェアに比べて酵素的解離を使用して接着単層として解凍し、拡大し、P19で凍結hNPCsの細胞数を予測した。細胞はP20で解凍したとき、0日目に表しています。B）は球の代表的?…

Discussion

図6。チョッピング回路図 。機械的なチョッピング法を用いて、培養中の回転楕円体幹/前駆細胞を拡大する。

重要なステップ

チョッピング膨張パラダイムの概要を図6に示す。HNPC球サイズがニューロスフェアを継?…

Materials

Beaker, 50 mL	Fisherbrand	FB-100-50	multiple manufacturers/suppliers
Bio-Safety Cabinet, class II	Baker	SG-603A	4 ft. or 6 ft. model.  6 ft. model recommended; multiple manufacturers/suppliers
Blades, Double-edge Prep	Personna	74-0002	multiple manufacturers/suppliers.  CAUTION: Sharp
Cell Freezing Media	Sigma-Aldrich	C6295-50ML	DMSO, serum-free
Centrifuge, swing-bucket with 15 mL inserts	Eppendorf	5810 R	multiple manufacturers/suppliers
Conical Tubes, 15 mL	Fisherbrand	S50712	multiple manufacturers/suppliers
Conical Tubes, 50 mL	BD Falcon	352074	multiple manufacturers/suppliers
Controlled Rate Freezer	Planer	Kryo 750	multiple manufacturers/suppliers
Cryovials, 2 mL	Corning	430488	multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T12.5	BD Falcon	353107	multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T25	BD Falcon	353081	multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T175	BD Falcon	353045	multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T75	BD Falcon	353110	multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 1 L	Millipore	SCGPU11RE	multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 150 mL	Millipore	SCGVU01RE	multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 500 mL	Millipore	SCGPU05RE	multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 50 mL	Millipore	SCGP00525	multiple manufacturers/suppliers
Filter Paper, 8.5 cm circles	Whatman/GE	1001-085
Forceps, Standard Pattern – Serrated/Curved/18 cm	Fine Science Tools	11001-18
Freezing Chamber, Isopropyl Alcohol	Nalgene	5100-0001	"Mr. Frosty"
Incubator, 37°C/5% CO2	Forma	370 series	multiple manufacturers/suppliers
Hemacytometer, Phase	Hausser Scientific	1475	multiple manufacturers/suppliers
McIlwain Tissue Chopper	Lafayette Instruments	TC752-PD	Petri dish modification required.   CAUTION:  Moving, sharp blade.
Micropipettor, 1 – 10 μL	Gilson	F144562	multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 100 – 1000 μL (starter kit)	Gilson	F167700	multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 2 – 20 μL (starter kit)	Gilson	F167700	multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 20 – 200 μL (starter kit)	Gilson	F167700	multiple manufacturers/suppliers
Nutdriver, Autoclavable, 5/16"	Steritool	10302
Pasteur Pipets, cotton-plugged	Fisherbrand	13-678-8B	multiple manufacturers/suppliers
Petri Dish, Glass, Autoclavable	Corning	3160-100
Pipet Aid	Drummond	4-000-101	multiple manufacturers/suppliers
Shim disc	McMaster-Carr	VARIABLE	multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 10 μL	AvantGuard	AV10R-H	multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 1000 μL	AvantGuard	AV1000	multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 20 μL	AvantGuard	AV20-H	multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 200 μL	AvantGuard	AV200-H	multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 10 mL	Fisherbrand	13-676-10J	multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 2 mL	Fisherbrand	13-675-3C	multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 25 mL	Fisherbrand	13-676-10K	multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 5 mL	Fisherbrand	13-676-10H	multiple manufacturers/suppliers
Sterilization Pouches, 19 x 33 cm	Crosstex	SCL	multiple manufacturers/suppliers
Strainer, 40 µm	BD Falcon	352340
Tissue Culture Dishes, 60 mm	BD Falcon	351007
Tube Racks, Interlocking Four-Way	Fisherbrand	03-448-17
Water Bath	Fisherbrand	S52602Q	multiple manufacturers/suppliers
Neural Progenitor Cell-Specific Processing Reagents
Neural Stem Cell Expansion Medium (Stemline)	Sigma-Aldrich	S3194-500ML	Important to use the Stemline brand
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)	Millipore	GF316	multiple manufacturers/suppliers
Recombinant Human Leukemia Inhibitory Factor (LIF)	Millipore	LIF1010	multiple manufacturers/suppliers
Trypan Blue (0.4%)	Sigma-Aldrich	T8154-100ML	multiple manufacturers/suppliers
TrypLE Select (1X)	Life Technologies	12563-011