Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

İnsan Nöral Agregalarının bir cGMP uygulanabilir Açılım Yöntemi kök hücrelerin pluripotent kök hücreleri veya Fetal Beyin dokusundan türetilen

doi: 10.3791/51219 Published: June 15, 2014

ERRATUM NOTICE

Summary

Bu protokol, tek bir hücre süspansiyonu için ayrışma olmadan küresel nöral kök ve projenitör hücre agrega genişlemesini sağlayan bir yeni mekanik bir kesme yöntemi tarif etmektedir. Hücre / hücre teması sürdürmek üzerinde 40 geçişleri için hızlı ve istikrarlı bir büyüme sağlar.

Abstract

Araştırma deneyleri ve klinik denemeler için tek bir örnekten hücrelerinin çok sayıda toplamak için bir hücre genişleme tekniği büyük ölçüde kök hücre topluluğuna yarar sağlayacak. Birçok mevcut genişleme yöntemler zahmetli ve masraflı ve tam ayrılma içeren bu birkaç kök ve progenitör hücre tipleri farklılaşmasını ya da erken yaşlanmayı geçmesi neden olabilir. Bu sorunların üstesinden gelmek için, basit ve ucuz olan "kesme" olarak adlandırılan bir otomatik mekanik pasajı bir yöntem geliştirdik. Bu teknik, tek bir hücre içine, kimyasal ya da enzimatik ayrışma önler ve bunun yerine sabit bir hücre / hücre teması muhafaza süspansiyon, küremsi kültürlerin büyük ölçekli bir genişleme sağlar. Doğrama yöntem öncelikle fetal beyin kaynaklı nöral progenitör hücreleri veya neurospheres süredir kullanılan ve son zamanlarda embriyonik ve uyarılmış pluripotent kök hücrelerinden elde edilen nöral kök hücreler ile kullanım için yayımlanmıştır. Prosedür involves bir doku kültürü Petri kabı üzerine neurospheres tohumlama ve sonradan etkin elle mekanik olarak her küre Ayrıştırıcı sıkıcı sürecini otomatize hücreleri aracılığıyla keskin, steril bir bıçak geçirerek. Kültür içinde hücreleri süspansiyon uygun bir yüzey alanı-hacim oranı sağlar; 500.000 'den fazla hücre çapı en az 0.5 mm, tek neurosphere içinde yetiştirilebilir gibi. Bir T175 bir şişe içinde, 50000000 fazla hücreleri sadece 15000000 yapışık kültürlerinde göre süspansiyon kültürlerinde büyüyebilir. Önemlisi, kıyma prosedür klinik dereceli hücre ürünlerin kütle miktarı üretimine izin veren, güncel iyi üretim uygulamaları (cGMP) altında kullanılmıştır.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bir tek tabaka 1-3 veya toplam neurospheres 4-7 ya gibi kültür kemirgen sinir kök hücreleri genişleyen uzun bir geçmişi vardır. Buna ek olarak, gelişmekte olan merkezi sinir sisteminin 8-17 çeşitli bölgelerinden izole insan nöral progenitör hücrelerin (hNPCs) in vitro genişletilmiştir. Bu hücreler iki güçlü, astrositlerde ve nöronlar hem de farklılaşma yeteneğine sahiptirler ve nöral gelişme 18,19 ve hastalık mekanizması 20,21 okuyan çok yararlı bir araç olmuştur. hNPCs ayrıca entegrasyon, hayatta kalma ve fonksiyonel etkileri 22-24 çeşitli düzeylerde ile santral sinir sistemi hastalığı birçok farklı hayvan modellerinde naklediliyor edilmiştir.

Genellikle epidermal büyüme faktörü (EGF) ve / veya fibroblast büyüme faktörü-2 (FGF-2), 25-28 - - ve yapışkan 29 ve hem de üç Geleneksel olarak, kemirgen ya da insan fetal NPC-türevi büyüme faktörleri maruzBoyutlu küremsi sistemleri tipik olarak bir tek hücre süspansiyonu halinde 30-34 enzimatik ayrılma ile pasajlanır. Araştırma ya da klinik kullanım için hücreleri genişletmek için bir standart yöntem kolay manipülasyon nedeniyle yapışkan bir tek tabaka olduğu gibi. Bununla birlikte, enzimatik veya kimyasal çözeltiler ile pasajı tek tabaka ve neurosphere hNPCs erken yaşlanma 35 ile sonuçlandığını göstermiştir. Buna ek olarak, enzimatik ayrışma embriyonik kök hücreler 36-38 ile gösterilen verilere dayalı olarak farklılaşma ve kromozomlarda anormallikleri artan seviyeleri ile sonuçlanabilir. Pasajlanması hNPCs standart yöntem mevcut iyi imalat uygulamaları fazına 1 klinik çalışmalarda (Hücreler Inc, Neuralstem Inc Stem) gitti (cGMP) sınıf ürünler üretti rağmen, yöntem sınırlayıcı, hücre büyütme sadece birkaç mermi izin potansiyeli bankacılık.

Açıkçası, büyük araştırma deneyleri ve gelecekteki klinik denemeleri yeteneği yararlanabilecekbüyük ölçekli büyüme ve hücre bankacılığı izin toplu olarak ve gecikmeli yaşlanması ile hücreleri yaymak. Bu ihtiyacı karşılamak için, hücre-hücre teması korumak için küçük kümeler halinde onları "kesme" bir roman ve mekanik Pasajlanması bozulmamış neurospheres otomatik bir yol geliştirdi. Bu yöntem büyük bir alternatif 3 boyutlu biyoreaktör kültürü yöntemi 40 ile görüldüğü gibi bunların ömrü 39 ve süspansiyon kültürü, tek tabakalı kültürler ile karşılaştırıldığında kuluçka alanı daha verimli kullanımına izin verir artmıştır. Resim kıyma protokol geçişi 10, standart yöntemler kullanılarak bir pasajı olası bir feat daha büyük bir fetal numuneden büyük ölçekli bankaların üretimine olanak sağlamaktadır. Pasajı hNPCs için bu yöntem alışılmamış iken, popülaritesi artmaktadır ve yakın zamanda, bu tür insan embriyonik ve uyarılmış pluripotent kök hücrelerinden elde edilen nöral kök hücreleri gibi diğer hücre tiplerinde, v dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için geniş ölçekli bir genişleme sağlayan yayınlanmıştıritro hastalık modelleme 41-46. Daha da önemlisi, bir cGMP dereceli hNPC hücre bankası zaten tekniğin gelecekteki klinik uygulamalar karşı uygulanabilir olduğunu gösteren, kesme yöntemi ile üretilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1.. Etik Beyanı ve Güvenlik

  1. Bu prosedür, insanlardan veya hayvanlardan elde edilen hücre kültürü ürünleri kullanımını gerektirir. Türetilen tüm dokular uygun Kurumsal Değerlendirme Kurulu (ler) ve / veya Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu (ler) tarafından kullanımdan önce onaylanması gerekir.
  2. Bütün biyo-tehlikeli atıklar, ilgili kurum tarafından kararlaştırılan güvenlik yönetmeliklerine uygun olarak imha edilmelidir. Bilmek ve bu işlem boyunca münasip güvenliği ve atılması tüm kurallara uyun.

Ekipman 2. Hazırlanması, Malzemeleri, Reaktifler ve Gözlemler

  1. Hazırlık
    1. Bir cam Petri kabı, 8.5 cm filtre kağıdı çevreleri ve çift-kenar hazırlık bıçakları edinin.
    2. Petri kabındaki bir filtre kağıdı parçası koyun ve Petri kabındaki filtre kağıdı üzerine birkaç kılıfsız bıçakları aktarın.
    3. Petri kabı kadar tekrar tekrar tabaka filtre kağıdı ve bıçaklar kabaca% 75 dolu, kapak zekâh Petri kapağı ve otoklav. Sterilliği korumak için bir steril ya da kapalı bir ortamda saklayın.
    4. Otoklav 18 cm forseps ve sterilizasyon kese içinde bir otoklavlanabilen somun sürücü. CGMP üretimi için, sterilizasyon torbalar çeşitli paslanmaz çelik şim diskleri otoklav. Şim diskin ilgili daha fazla bilgi için, adım 3.5 'e bakınız.
    5. % 70 izopropil alkol (IPA) ile biyo-güvenlik kabini (BSC) sterilize.
    6. Bütün prosedürler sterilliği korumak için, bir BSC gerçekleştirilmelidir. Aseptik BSC aşağıdaki transferi:
      1. McIlwain Doku Chopper (kıyıcı). % 70 IPA, özellikle helikopter kolu (Şekil 1B) ile tüm yüzeylerini silin. Tüm kıyıcı gerekirse, etilen oksit kullanarak dekontamine edilebilir.
      2. Bir Otoklavlanmış somun sürücüsü veya fındık anahtarı (kıyıcı, Şekil 1I dahil), bir 18 cm forseps, standart ölçü Mikropipetler (20 ul-1, 000 ul), bir pipetaid ve tüp rafları bir set.
      3. Steril tek serolojik pipet, bariyer pipet uçları, 15 ml konik tüpler, 60 mm Petri kapları, çift kenar hazırlık bıçaklar ve uygun büyüklükte T matara. DİKKAT: Yalnızca bir forseps ile keskin bıçakları ele.
  2. Reaktifler
    1. 100, 10 ng / ml 'de ng / ml ve lösemi inhibitör faktörü (LİF) ya da hücre genleşme maddesi, EGF Stem Nöral oluşan bakım Media (MM) içinde hNPCs aç. BSC içine ortamını hazırlamak için gerekli reaktifler ve filtrasyon cihazı (ler) aktarın.
    2. Sinir Hücresi Büyüme Ortamı Kök ve en fazla 1 yıl boyunca -80 ° C'de saklamak için 100 ug / ml 'de alikotları hazırlamak kullanılarak liyofilize EGF yeniden askıya. 6 aya kadar veya üretici tarafından verilen son tarih için 4 ° C'de satın olarak LİF saklanır.
    3. BSC içine MM reaktif aktarın. Bir vakum cihazı kullanılarak uygun büyüklükte bir filtrasyon cihazı ile filtre tüm reaktifler birleştirin. Kadar 3 hafta boyunca 4 ° C'de depolayın.
    4. hNPC Gözlemler
      1. Doğrama önce adresine en önemli iki faktör küre çapı ve medya klima veya renktir. Koşullu ortam (CM) kuluçka makinesi (37 ° C,% 5 CO2,% 95 rutubet) şartlar altında kültür hNPCs tarafından metabolize edilmiş ortamı olarak tanımlanmaktadır. Hücreler medyayı metabolize olarak fenol kırmızı bileşen bir daha asidik bir ortam (Şekil 5D) simgeleyen sarı renk bir pembe kayacak.
      2. (Ayrıntılar için bakınız tartışma) medya rengini gidermek için ışığa kadar hNPCs bir balon (ler) tutun.
      3. Hücreleri gözlemlemek için bir mikroskop ile şişe içinden tarayın. Küre boyutunu incelemek için bir retikülü kullanın. Birçok küreler 300 um'lik veya daha büyük bir çapa sahip ise, kesme işlemi ile devam edin. Her 7-10 gün hücreleri doğrayın.
      4. Bir pirzola garanti değilse, taze medya her 3-4 gün hücreler medyayı metabolize edilir ne kadar hızlı bağlı olan CM değişimi% 25-75. Aleyhteküreler geçişi için yeterince büyük olana kadar ortam değişimi için devam ediniz.
      5. hNPCs genel olarak daha küçük şişelerden daha büyük şişeler için, 1:2 'lik bir oranda doğranır. Şişeyi boyut ve hacim önerileri için bir başvuru kılavuzu olarak Tablo 1 kullanın.
    2 T175s
    Cep şişesi Toplam medya hacmi Pre-Chop Post-Chop
    1 T12.5 5 mi 1 T12.5 1 T25
    1 T25 10 mi 1 T25 1 T75
    1 T75 20 mi 1 T75 1 T175
    1 T175 40 mi 1 T175 2 T175s
    80 mi 2 T175s * 4 T175s
    * 2 T175s bir anda doğranmış olabilir matara maksimum sayıdır. 2 T175s setler halinde doğrayın ve 7. adıma bakın.

    Tablo 1. HNPC genişletme paradigma. HNPCs için tipik bir genişleme düzeninin açıklaması. Her 7-10 gün hacimsel iki kat genişletmek için standarttır.

    3.. Chopper Kurulum

    Şekil 1
    Şekil 1.. McIlwain Doku Chopper. A)) Petri kabı, D plaka tutucuya Hook kalınlık ayarı mikrometre, B) Chopper kol tabanı ve bağlı kol, C) doğrayın Tablo bırakma düğmesi ve tepsiKıyıcı, J) Blade / toka somun, K) Blade toka, L ile birlikte, E) Blade kuvvet kontrol düğmesi, F) Sıfırlama anahtarı, G) Plaka sahibi, bıçak, toka ve somun H) Bolt eki I) Somun anahtarı ) Otomatik kesme hız kontrol düğmesi, M) Manuel doğrama kol çalıştırma düğmesi, N) Güç anahtarı.

    1. BSC bir prize takın helikopteri ve güç anahtarı (Şekil 1N) açın. 200 mikron (Şekil 1A) için kesme uzaklığını ayarlayın. Topuzu bir saat (Şekil 1E) ise 270 ° ya da 9:00 bıçak kuvvet ayarlayın. Otomatik hız topuzu kadar saat yönünün mümkün döndürülmüş olduğunu onaylayın. (Şekil 1 L).
    2. Sağa şekilde tüm tablo serbest hareket plaka tutucu (Şekil 1D) stabil olduğunu onaylayın.
    3. Manu döndürmekEl kol manipülatör maksimum düzeyde (Şekil 1M) için kolunu yükseltmek için saat yönünde. Manuel kol manipülatör sadece döndürülmüş saat yönünde olması gerekir.
    4. Aseptik bir çift forseps (Şekil 1H) kullanarak helikopter kolu cıvata üzerine steril, çift taraflı doğrama bıçağı aktarın.
    5. Yalnız Petri araştırma dereceli işleme için yeterli olduğu gibi, sadece cGMP geçiş için bu adımı tamamlayın. Adım 2.1.4 belirtildiği gibi, Petri çanağı tabanının içine yerleştirilen dolgu cGMP diskleri için gereklidir. Şim disk kesme işlemi sırasında küreler içine birleşmeyle gelen plastik cam kırıklarını önler. Planlanan her pirzola, her Petri kabı ve kapak tabanına bir şim disk transfer.
    6. Aseptik forseps kullanarak bıçak üzerinde toka (Şekil 1K) yerleştirin. Toka kavisli kısmı, kolun üst kenarı üzerinde olmalıdır. Somun güvenli moda olmuştur kadar toka kol üzerinde kalmayacaktır. Clas tutmak için forseps kullanınp koluna ve steril somun sürücüsü ile cıvata üzerine somunu (Şekil 1J) sabitleyin. Soyunursa ¼ somun a bırakın.

    4. Pre-pirzola Prosedürü

    1. Tablo 2, Sütun C başına yeni bir balona (ler) içine MM önerdi hacmini aktarın.
    2. Aseptik BSC içine inkübatör hücreleri aktarın. Bir tüp raf (Şekil 2A) üzerine balon (ler) yalın ve küreler şişeye (ler) yerleşmek için izin verir.
    3. Bir kez kurulmuş, 5 ml veya 10 ml serolojik pipet ile süpernatanın 12 ml kadar aspire ve şişeye (ler) yüzeyinden tüm gevşek yapışkan alanları yıkayın. Gerektiği kadar tekrarlayın ve durulama aralarında küreler yerleşmek.
    4. İki veya daha fazla T175 şişeleri pasaj durumunda. Tablo 2, Sütun D'ye göre, yeni bir şişe (ler) içine CM önerilen ses aktarma aşamasını 7.1.
    5. Yeni bir 15 ml konik tüp içine kalan tüm CM ve küreler aktarın. Küreler se verttle ve kullanılan balon (ler) atın.
    6. Kritik Adım: Yavaş 60 mm Petri kabı veya düşük mümkün hacminde takoz diske 15 ml konik tüp küreleri aktarmak; 0.1-0.5 ml (Şekil 2B) tavsiye edilir. Bu çanak sonrası pirzola gelen hücreleri yıkamak için kullanılacak gibi CM kalan hacmi tutun. Çanak (Şekil 2C) medya ve küre ile kaplı yüzey alanını en aza indirmek için deneyin.

    Şekil 2,
    Şekil 2). Şişe. B köşesinde küreler yerleşmek Petri konik tüp yoğun mümkün olduğunca küreler Transfer için bir tüp raf veya benzer bir madde karşı balon (ler) Yalın. A) doğrama için Sphere hazırlık çanak. C) t konik tüp küreleri Poolo Petri kabı. D orta) toplanmış kürelerin üst mümkün olduğunca süpernatantı. E)), bir plastik mikropipet ucu. F yan kullanılarak küreler yayın yavaşça havuzun bir tarafında küreler taşımak . medya çıkarılmasını kolaylaştırmak için havuzun bir tarafına taşındı küreler G) Örnek. H) Yoğun küreler doğrama hazır Petri kabı, üzerinde yayılmış. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

    1. Daha sonra, küreler aşama 4.6 üzerinden aktarılır süpernatant kaldırarak kondanse edilmesi gerekir. Bir aerosol bariyer uçlu mikropipetöre (Şekil 2B) ile geriye 15 ml konik tüp içine süpernatant aktarın, kürelerin kaldırılmasını önlemek. Ortam / hücre havuzu üstünden mümkün olduğunca medya kaldırarak başlayın. Bu mümkün olmadığındaküreler olmadan ortamı çıkarmak için, aşağıdaki adıma geçin.
    <td> 0 ml
    Sütun A Sütun B Sütun C Sütun D Sütun E Sütun F
    Pre-Chop Ebatı Post-Chop Flask (ler) Boyut Yeni bir balona (ler) pre-kes aktarmak MM Önerilen hacmi Yeni bir balona (ler) pre-kes aktarmak CM Önerilen hacmi Yeni bir balona (ler) post-pirzola içine aktarmak için küreler medya / Önerilen hacmi Nihai hacim Tohumlu / Flask
    T12.5 T25 5 mi 0 mi 5 mi 10 mi
    T25 T75 10 mi 10 mi 20 mi
    T75 T175 20 mi 10 mi 10 mi 40 mi
    1 T175 2 T175s Kap başına 20 mi Kap başına 15 mi Kap başına 5 ml 40 mi
    2 T75s 4 T175s Kap başına 20 mi Kap başına 17.5 mi Kap başına 2.5 mi 40 mi

    Tablo 2.. Medya aktarma kılavuzu öncesi / sonrası doğrayın. Önerilen hacimleri kesme işlemi sırasında kullanmak için.

    1. Yüzey alanı (Şekil 2E) artırmak için pipet ucu yan kullanılarak havuz yayıldı.
    2. Kritik Adım: kendinize doğru hafifçe Petri İpucu ve hafifçe sl pipet ucu tarafını kullanınhavuz (Şekil 2F, G) bir tarafına kürelerin her ide.
    3. Kritik Adım: tüm hücreleri taşındı zaman, yavaş yavaş petri ters yöne devrilebilir. Bu süreç sırasında, tek başına ortam uzak alanlarda akacaktır. Geri 15 ml konik tüp içine medya aktarın. Minimal küre kaldırma kabul edilebilir.
    4. Yavaşça böylece havuz 0,5-2,4 cm (Şekil 2H) bir çapa sahiptir geri Petri kabı merkezine kürelerin her kaymasına pipet ucunun yan kullanın. Bu küre havuz sığ derinliği tutmak önemlidir. Havuz çok derin ise, küreler sadece kıyma esnasında kenara itilmiş olacaktır. Not: küre havuzunun çapı 2.5 cm 'den daha büyük olamaz veya bıçak hücreleri eksik, Petri kabı kenarlarını temasa geçecektir.

    5.. Chop Prosedürü

    1. Plaka tutucu (Şekil 1G) üzerine Petri aktarın ve çanak sağlamakplaka tutucu kanca (Şekil 1C) altında sabitlenir.
    2. Tablo bırakma topuzu o vitese uyacak çentikler vardır. Böylece bıçak küre açıktır ve dişli (Şekil 1D) kilitli sola plaka yuvasını kaydırın için tablo serbest bırakma düğmesini kullanın.
    3. Kritik Adım: bıçak Petri kabı üzerine aşağı düz oturana kadar saat yönünde manuel manipülatör topuzu (Şekil 1M) çevirerek helikopter kolu indirin. Nutdriver ile somunu sıkarken kol montaj (Şekil 1B) üzerine bastırın tek bir elinizi kullanın.
    4. (Şekil 1F) bir kere reset düğmesine basın. Topuzu bir saat ise 90 ° pozisyonunda veya 12:00 otomatik kol manipülatör topuzu (Şekil 1L) saat yönünde dönerken tek elle Petri sürekli. DİKKAT: uzakta her zaman hareket bıçaktan parmaklarınızı tutun.
    5. Kürelerin havuzu ile tam bıçağı geçirin. Plaka tutucusunu döndürmek90 °.
    6. Cıvatasını gevşetin ve adımı 5.3-5.5 tekrarlayın.
    7. Aseptik BSC bir çalışma alanı üzerine plakası sahibinin Petri aktarın.

    6. Post-pirzola Prosedürü

    1. Prime daha sonra bir 10 ml serolojik aşama 4,6 konik bir tüp içinde CM ile pipet ve kıyılmış küreler üzerine 1 ml aktarın. Yavaşça yeniden askıya alma ve yeni bir 15 ml konik tüp içine aktarın. Kabarcıklar önlemek ve doğranmış küreler toplamak için gerekli olduğu kadar birçok kez tekrarlayın.
      İPUCU: plastik parçaları kaldırın olabilir çanak kazıma en aza indirin. Bu paslanmaz çelik takoz diskleri kullanarak bir endişe değildir. Plastik serolojik pipet içine takılarak hücrelerin sakının. Bu durumda, aspire kabarcıklar aralıklı pipet medya aracılığıyla hücreleri ayırmak için.
    2. CM hacmi ve doğranmış küreler ölçün. Tablo 2'de listelenen hacim, Sütun E elde etmek için MM uygun hacim.
    3. ÇiğnemekHerhangi bir gevşek erimiş küreler kırmaya 2-3x küreler.
    4. Kritik Adım: Her yeni bir balona küre süspansiyon kısım. Sadece bir defada bir balona küre süspansiyonu transfer ve transfer arasında küreler yeniden askıya. Aynı anda birden fazla şişeleri aliquoting her bir şişe içinde küreler orantısız bir dizi ile sonuçlanır. Her bir şişe içinde nihai hacmi, Tablo 2, Sütun F birimleri eşit olmalıdır. 'Den daha büyük, iki T175 Şişelere konmadan zaman adım 7.2 bakınız.
    5. Fındık sürücü ve steril forseps ile daha sonra toka ile somunu sökün. % 70 IPA veya eşdeğeri uygun dekontamine. DİKKAT: Yalnızca bir forseps ile kullanılan doğrama bıçağını çıkarın ve bir biyo-tehlike kesici kapta atın.
    6. % 70 IPA ile helikopterde tüm yüzeyleri dezenfekte.

    . 7 Proses Çeşitlemeler - Çoklu matara

    İkiden T175s pasaj çeşitli farklılıklar vardır. AdımAşağıdaki s başvurulan aşamasının değişiklikler bulunmaktadır.

    1. 4.4 adıma Referanslar:
      1. İki T175s pasaj zaman, bir T175 şişeler içine medya ve küre tüm birleştirmek. Tablo 2'de belirtildiği gibi küreler yeni şişelere her birine CM uygun hacmi yerleşmek ve daha sonra bir kısım izin verin, sütun D. Aşama 4.5 'e geçin.
      2. Den daha fazla iki T175s pasaj zaman, CM şişeye olarak yeni T175 şişesi ve etiket elde edin. Komple adım 7.1.1 ama CM balona CM aktarın. Bütün şişeler kıyılmış kadar bütün şişelerden CM toplamak için kullanılacak BSC tarafında şişe saklayın. Sonra CM eşit yeni şişelere her içine örnek olacaktır.
    2. Referans adım 6.4 - aynı hücre hattını birden çok kez doğrama, yeni bir T75 şişesi etiketli küreler post-pirzola içine doğranmış küre süspansiyonu transfer ve transfer hacmi rekor. Bu hücrelerin bir araya devamHer şişeye pirzola sonra ve 37 ° C'de,% 5 CO2,% 95 nemde inkübatör şişeyi saklayın. Tüm eti tamamlandıktan sonra, her yeni bir şişeye hacmindeki küre süspansiyon kısım. 6.5 adıma geçin.

    8. Kryoprezervasyon

    Aşağıdaki protokol kriyojenik hNPCs korumak içindir.

    1. 37 ° C de bir temiz su banyosu içinde hücre donma orta çözülme ve daha sonra buz üzerinde saklayın. Hücre ortamı, donma kadar 6 ay boyunca parçalara ayrılmış ve -80 ° C'de ˚ saklanabilir.
    2. Bir alev pipetlemeyin açılmasını çevirerek lehçe cam Pasteur pipetlerini ateş. Hazırlayın büyük ve iki küçük delik yangın cilalı pipetler (Şekil 3), en az iki. Küreler Büyük küçük kalibreli pipetleri taşıyarak ayrışmış olacak.
    3. 5 dakika boyunca 37 ° C'de su banyosunda TrypLE Seç yerleştirin. Çıkarın ve kullanıma hazır olana kadar oda sıcaklığında tutulması.


    Şekil 3. Yangın-parlatma cam Pasteur pipetler. A) için geniş çaplı yangın parlatılmış cam pipet ve eşit olarak cam pipet kenarları yuvarlak. B) Örnek olarak alev ve spin üst kısmında pipetlemeyin tutun. küçük çaplı bir yangın parlatılmış cam pipet C) Örnek.

    1. Aseptik BSC içine neurospheres aktarın. Küreler bir tüp raf karşı balon (ler) yaslanmış tarafından yerleşmek ve herhangi gevşek yapışık küreler kaldırmak için şişenin dibini durulayın izin verin. Küreler yeniden yerleşmek için izin verin.
    2. Steril şişe içine CM her ancak 5-10 ml transferi ve toplam hacmini ölçün. Konik bir tüp içine, geri kalan küreler ve ortam yerleştirin.
    3. Tüm hücreler yapıldıktan sonra, şişeye CM küçük bir menisküs ama aktarmak ve vol summateume.
    4. Aseptik transferi konik tüp içine ısıtılmış TrypLE Select 5-10 ml ve yeniden askıya hücre pelet. 15-20 dk için 37 ° C su banyosu içine konik tüp aktarın. 7.5-10 dakika sonra hafifçe konik tüp karıştırmak için sallayın.
    5. Aşama 8.5 ölçülen CM ve MM hacmini kullanarak eşit hacimde hazırlanır. 50% CM ve% 50 MM solüsyonu (CM / MM çözelti) birleştirin ve filtre.
    6. Aseptik bir 50 ml konik tüp içine 40 mikron süzgeç transfer.
    7. Kuluçka tamamlandıktan sonra, 100 x g de 15 saniye için 15 ml konik tüp dönerler.
    8. Dikkatle aspire ve TrypLE Seç ve herhangi lifli tabakayı atın. Küçük bir menisküs bırakın. Pelet rahatsız değil iken kalan TrypLE Seç sulandırmak için CM / MM 4 ml - nazikçe 2. ekleyin. Herhangi bir yerinden hücreleri yıkama atmadan önce yeniden halledelim.
    9. 2-5 ml CM / tüp kürelere MM solüsyonu ekleyin. 10x en fazla öğütülerek bir 5 ml pipet ile küreler ayrıştırmaları. BM izinayrışmış küreler 1-2 dakika dinlendirilir. Tam ayrışmamış kümeleri kaldırmak için 40 mikron süzgeç üzerine ayrışmış hücre süspansiyonu aktarın.
    10. Bir yangın cilalı geniş çaplı cam pipet ve daha sonra küçük çaplı bir cam pipet ile adımı 8.12 tekrarlayın.
    11. CM / AA çözeltisi 2-5 ml süzgeç durulayın.
    12. Hücre süspansiyonu karıştırın ve canlılık analiz için numunelerin alınması.
    13. Uygun bir seyreltme faktöründe tripan mavisi ile örnekleri sulandırmak ve saymak. Ortalama canlı hücre konsantrasyonunu hesaplamak ve toplam canlı hücreleri hesaplamak için aşağıdaki standart denklemi kullanın.
      Denklem 1
    14. 5.0 x 10 6 hücre / ml 'de yeniden askıya hücreler için gerekli hücre dondurma ortamının toplam hacmi hesaplayın. Hücre 1 ml her bir dondurarak saklama viali içine ekildi olacaktır. BSC içine kriyotüplerin aktarın.
    15. 15 m, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'de hücre süspansiyonu santrifüjEn iyi verim için l konik tüpler. 50 ml konik tüp, aşağıya doğru büyük ölçekli bir dondurma için kullanılması halinde, 10 dakika boyunca 400 x g ile hızı ve süresi artar.
    16. 5,0 x 10 6 hücre / ml 'de, hücre dondurma ortamı kullanılarak hücre pelletini yeniden askıya. Her bir dondurarak saklama viali içine hücre süspansiyonu kısım 1 mi. Süspansiyonu ve 5 kısım cryovials x 1 mi eşit bir dağılımı, aspirat 6 ml için. Geri hücre havuza süspansiyonu geriye kalan 1 ml aktarın. Tüm küçük şişeler doldurulmuş kadar tekrarlayın.
    17. Aseptik tüm seribaşı kriyotüplerin mühür ve 5-10 dakika süreyle buz üzerine aktarabilirsiniz.
    18. İzopropil Alkol Odası: hNPCs korumak için dondurulması stratejileri için aşağıdakilerden birini kullanın
      1. Oda sıcaklığında% 100 IPA ile odasının gerekli sayıda (ler) doldurun.
      2. Oda (lar) içine buz tohumlanmış cryovials aktarın ve gece boyunca -80 ° C dondurucu içine bölmeyi (ler) aktarılır. Hücreler, ancak -80 ° C kadar bir hafta boyunca stabildirBu ertesi gün uzun süreli sıvı azot depolama şişeleri aktarmak için önerilmektedir.

      Kontrollü Oranı Dondurucu

      1. Kontrollü hız freezer yazılımına uygun bir dondurma programı yükleyin. Bir örnek programı Tablo 3'te listelenmiştir. Şekil 4, hNPCs için tipik bir dondurma eğrisini gösterir. Ancak, tam program her dondurucu model için değişecektir. Donma hızı olabilir -40 ° C, ulaşana dek en az -80 ° artmış, standart genel örnek oranı -1 ° C / dk yakın olmalıdır C.
    Adım Oranı (° C) Uç Sıcaklık (° C) Tut (dk sn) Tetik
    1 </ Td> - - 5 dk 0 sn Oda
    2 - 1.3 - 5 - Örnek
    3 - - 1 dk 0 sn Oda
    4 - 45 - 58 - Oda
    5 + 10 - 26 - Oda
    6 + 3 - 23 - Oda
    7 - 0.8 - 40 - Örnek
    8 - 10 - 100 - Oda
    9 - 35 - 160 - Oda

    Tablo 3. Kontrollü r hNPCs dondurma adımlarıdondurucu yedik. Hızı kontrollü dondurucu üzerinde hNPC dondurulması için önerilen bir program.

    Şekil 4,
    Şekil 4. Örnek donma eğrisi. Hızı kontrollü dondurucu üzerinde hNPCs için tipik donma eğrisi.

      1. Kontrol oranı dondurucu ile ilişkili sepet içine buz kriyotüplerin aktarın. Yalnızca hücre ortam numune sıcaklık probu için kullanmak dondurma ile bir cryovial yüklemek için emin olun. Dondurma bölmesinin içine sepet transferi ve prob şişe içine örnek sonda yerleştirin. Programını başlatın.
      2. Protokol tamamlandığında, uzun süreli sıvı azot depolama içine şişeleri aktarın.

    9. Çözülme Prosedürü

    Aşağıdaki protokol eritme kriyojenik p içindirhNPCs saklıdır.

    1. Derhal kuru buz üzerine sıvı azot depolama cryovials aktarın. DİKKAT: Flakon çatlak ya da sıvı azot flakon girmek için izin gevşek kapakları olabilir. Derin dondurucu koşullarda çıkarken, sıvı derhal şişeyi patlayan, kaynatın. Şişeleri çıkarırken uygun KKE kullanın.
    2. Vaktinden aşağıdaki reaktifler ve malzemeleri tüm hazırlayın. Çözülme süreci başladıktan sonra, verimli üzerinden takip etmek önemlidir.
      1. Sinir Hücresi Genişleme Orta, MM, 15 ml konik bir tüp, bir 2 ml ve 10 ml BSC içine her cryovial için serolojik pipet Stem aktarın.
      2. Nöral 9 ml en az hücre genleşme maddesi Kök ve MM 5 ml her şişe için gereklidir. Gerekirse, her medya hazırlayın.
    3. Sadece bir seferde hNPCs bir flakon çözülme. Temiz bir 37 ° C su banyosu içine, kuru buz, donmuş hücreleri transferi ve sürekli olarak bir su banyosunda şişeyi karıştırın. Hacmini Monitöreridi buz. Şişede kalan buz yaklaşık 0.5 cm'lik bir parça olduğunda, sprey ve% 70 izopropil alkol ile silin ve BSC içine aktarın.
    4. 2 ml'lik bir pipet ile serolojik bir 15 ml konik tüp dondurarak saklamaya uygun vialler içeriğini aktarın. Boş kriyotüpe Hücre Genişleme Orta Kök Nöral 1 ml ekleyin ve sonra yavaş olarak çözülmüş hücreleri üzerine Hücre Genişletme Orta Kök Nöral 8 ml transferi, tüp hafifçe sallayarak ise akıllıca bir şekilde bırakın. Bu ozmotik şok riskini azaltmak için yapılır.
    5. Hücre süspansiyonu 9 ml dondurarak saklamaya uygun vialler gelen durulama aktarın. Buz üzerine konik tüp transferi ve tekrar kalan tüm flakon için 9,4-9,5 adımları.
    6. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'de konik santrifüj tüpleri Santrifüj sırasında, Tablo 4 göre tohumlama şişeler için uygun sayıda hazırlar.
    Şişeler içinde Toplam Tohumculuk Hacim (ml) Cep şişesi
    1 5 T12.5
    2 10 T25
    3 15 T75
    4 20 T75
    5 25 T75
    6 30 T175
    7 35 T175
    8 40 T175
    8 + - Şişeler kombinasyonu

    Tablo 4.. Çözülmüş cryovials sayısına göre Matara boyutları. HNPCs sonrası çözülme tohum Önerilen hacmi ve şişe boyutu.

    1. Yeniden askıya ve Tablo 4 dayalı MM uygun hacimde tüm tüpler birleştirir. Iyice karıştırın ve yenidencanlılığı sayımı için bir örnek hareket eder. Ayrıntıları sayma adımları 8,15-8,16 bakın. Standart tohumlama aralığı / cm 2 160,000-320,000 hücreler arasındadır.
    2. De hücreleri karıştırın ve şişeler içine hücreleri alikosu. % 5 CO 2/37 ° C/95% nem inkübatör için şişeler aktarın. Nazikçe eşit hücrelerini dağıtmak için ileri geri sallayarak şişeyi karıştırın.
    3. Hücreler 24-48 saat içinde küreler oluşturacak. Bazen hücreler plastik yüzeye yapışır ve bir bal peteği benzeri koloni dağıtım oluşturacaktır. Bu durumda, küre oluşumuna yardım, gevşek hücreleri durulama 3 gün için hücreler bırakın. Hiçbir yapışık hücre kadar her 1-3 gün durulayın. Yeni bir şişeye gerekli aktarma hücreler ise.
    4. Döviz MM ile medyanın her 3-4 gün% 25-75 hücreler, genellikle 7-14 gün sonrası çözülme doğrayın hazır olana kadar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Şekil 5,
P19'un de donduruldu hNPCs Şekil 5. Temsilcisi veri. A) Öngörülen hücre sayıları, sonra çözülmüş ve kesme yöntemi ile pasajlanır neurospheres karşılaştırıldığında enzimatik ayrılma kullanarak yapışık tek tabaka olarak genişletti. Hücreler p20 eritildi edildiğinde Gün 0 gösterir. B) küreler Temsilcisi görüntüleri ön pirzola, küreler post-pirzola, 10X. D) Renk örnek medya klima derecesini tanımlamak için kullanılan cGMP-10X. C) Temsilcisi görüntüleri Benzer protokolleri. E) 1 gün için kaplama ve Nestin (kırmızı) sentezleme için boyandı eritilmiş p29 hNPCs of İmmünositokimya. 7 gün ve leke için kaplandı Çözülmüş p29 hNPCs Hoechst nükleer sayacı leke (mavi). F) İmmünositokimyaGFAP ed (Kırmızı) ve β-III tubulin (Yeşil). resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Şekil 5A, p20 (gün 0) de çözülmüş ve laminin ile kaplanmış doku kültür şişeleri veya kesme yöntemiyle geçişli yapışmayan neurospheres yapışık olarak muhafaza hNPCs temsil eder. Yapışan hücreler, enzimatik olarak haftada bir seçin TrypLE kullanılarak ayrılmış ve kültür içinde 70 gün boyunca (7-10 geçiş) sonra senesced edilmiştir. Bunun aksine, geçit 20 ° C sıcaklıkta çözülür ve kesme tekniği ile genişletilmiş neurospheres yaşlanmadan önce daha büyük 40 geçişleri büyüdü. (Şekil 5B) doğrama önce tipik hNPCs çok çapı ≥ 300 um olmalıdır. Bir kez doğranmış, küreler çoğunlukta 200 çapı (Şekil 5C) mikron civarında, variably bölüme dörde edilir. Bu hNPCs choppin'de yoluyla genişletilmiş dikkat etmek önemlidirg yöntem hNPC markırlerinin korumak ve hem astrositleri ve nöronlar sonrası farklılaşma üretebilir. Geç geçit hNPCs, ayrışmış laminin kaplanmış, kapak slipleri üzerine kaplama, bir ya da yedi günlük bir süre için ve daha sonra% 4 paraformaldehit ile sabitlendi. HNPCs 1 gün kaplama hNPCs (Şekil 5E) hakkında progenitör hücre işaretleyici Nestin (Millipore, 1:1000) yanı sıra, farklı sinir işaretlerini glial fibriller asidik protein (GFAP, 1:500) ve β-III tubulin (1 ifade edilmektedir: 2.000) yedi günlük kaplama hNPCs (Şekil 5K), sırasıyla astrositlerde ve olgunlaşmamış nöronlar için belirteçler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Şekil 6,
Şekil 6.. Doğrama şematik. Mekanik kesme yöntemini kullanarak kültür içinde sfero kök / progenitör hücreler genişletilmesi.

Kritik Adımlar

Kıyma genişleme paradigmasının bir bakış. HNPC küre boyutu neurospheres pasaj önce gözlemlemek için önemli kriterlerden biridir Şekil 6'da gösterilmiştir. Küre boyutu büyük fark olsa da, küre en az% 30 daha büyük bir çapa 300 um olmalıdır. Küreler geçişi için çok küçük ise, sadece taze MM (25% -50%) ile CM değişimi ve yeniden değerlendirmek 1-4 gün sonra. Kürelerin çapı çok küçük aktanldılar zaman Kötü genleşme oranları ortaya çıkar.

hNPC genişleme oranları da küre yoğunluğu ve medya c bağlıdırnedeniyle salgılanan faktörler 47 onditioning. Ortam aşırı metabolize edilir ve önemli büyüme faktörleri azalmış, ancak, hücrelerin hücre 48 bir karyotipik anormal nüfus edinebilirler. Bu nedenle, yerine besin ve büyüme faktörleri salgılanan trofik faktörler ile dengeli olmalıdır. HNPCs post-pirzola ya da post-çözülme tohumlama zaman, medya cm3 başına neurospheres sayısı değişkendir. Ancak, genel kural yoğunluğu fazladır, daha hızlı ortam durum ve yüksek büyüme oranı, gerektiğinde ortam değiştirilir sağladı. Ortam tamamen metabolize edildiğinde sarı, un-metabolize zaman pembe aralıkları medya-Klima renk spektrumu (Şekil 5D) kullanın. Logaritmik büyüme için ideal bir ortam rengi kırmızımsı-turuncu bir renk, renk skalasında # 3'tür. Bu salgılanan Troph yeterli bir konsantrasyonunu muhafaza ederken, ortam, yeterli besinleri ve büyüme faktörlerini içerir gösteriric faktörler. Medya renk skalasında son 4. durum olmamalıdır. Alternatif olarak, hücreler (renk skalasında # 1) hızla ortam metabolize edildiğinde hNPCs yavaş büyüyecek ve her 7-10 gün karşıt olarak her 10-20 gün pirzola gerektirir. Bu da genişleme oranlarını artıracak klima, artırmak için kültür yoğunluğunu artırmak için önemlidir.

Doğrama prosedürü sırasında aşağıdaki kritik adımları unutmayın. Emin bıçak kıyıcı koluna paralel yüklenir. Bıçak Petri çanağı veya dolgu diskin yüzeyi üzerinde düz değilse, bir çok küreler kıyılmış olabilir. Adım 4.11 tartışılan hücre yayılmasını dikkat edin. Küreler her alanında kıyılmış edilmiştir önce duvara temas edecek Petri kabı ya da pervane kanadının merkezinden kalmalıdır. Son olarak, kesme işlemi esnasında, uzun bir süre için hNPCs kurumasını önlemek için önemlidir. Çanak küreler yerleştirdikten sonra, doğrayın ve kısa sürede taze medya ile onları selmümkün.

Bu teknik ekipmanın çeşitli parçaları gerektirir, kültür kısırlık riskleri olabilir. Bu risk göz önüne alındığında, uygun steril teknik prosedür boyunca kullanılmalıdır. Temel araştırma düzeyi, üretim için,% 70 IPA veya eşdeğeri ile tüm ekipman aşağı silerek 15 dakika en az isteğe bağlı ultraviyole inkübasyon ile birlikte yeterli değildir. Steril BSC içindeki tüm adımları uygulayın. Üretici tarafından önerilen cGMP seviyesi üretimi için, kesici etilen oksit ile sterilize edilmelidir. Diğer tüm malzemeler steril satın veya otoklav edilebilir.

Gelecekteki Uygulamalar

Yatağımın için tezgah herhangi temel araştırma tedavisinin geçiş zor olabilir. Doğrama prosedür aklında bu geçiş ile tasarlanmıştır. Prosedür zaten Wisconsin Üniversitesi Waisman Merkezi Bio-imalat Tesisleri'nde bir cGMP uyumlu hNPC banka üretmek için kullanılır olmuştur. Tşapka hNPC banka Federal İlaç İdaresi onay aşağıdaki yeni ön-araştırma ilaç çalışmaları ve bir faz 1 klinik deneme için kullanılacak bir ilaç dereceli hNPC hücre lot genişleme kaynaklı. Genişlemesi için bu yordamı kullanın diğer hücre tipleri vardır. Bir örnek EZ küreler, pluripotent kök hücreler 41 oluşturulur nöral kök hücrelerdir. Bu teknik, genişleme esnasında sabit hücre-hücre temas gerektiren doku diğer türleri ile kullanım için büyük bir potansiyele sahiptir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Biz eleştiri ve bu raporun düzenleme için Dr Soshana Svendsen teşekkür ederim. Bu çalışma NIH / NINDS 1U24NS078370-01 ve CIRM DR2A-05320 ile katkıda bulunmuştur.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beaker, 50 ml Fisherbrand FB-100-50 multiple manufacturers/suppliers
Bio-Safety Cabinet, class II Baker SG-603A 4 ft. or 6 ft. model.  6 ft. model recommended; multiple manufacturers/suppliers
Blades, Double-edge Prep Personna 74-0002 multiple manufacturers/suppliers.  CAUTION: Sharp
Cell Freezing Media Sigma-Aldrich C6295-50ML DMSO, serum-free
Centrifuge, swing-bucket with 15 ml inserts Eppendorf 5810 R multiple manufacturers/suppliers
Conical Tubes, 15 ml Fisherbrand S50712 multiple manufacturers/suppliers
Conical Tubes, 50 ml BD Falcon 352074 multiple manufacturers/suppliers
Controlled Rate Freezer Planer Kryo 750 multiple manufacturers/suppliers
Cryovials, 2 ml Corning 430488 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T12.5 BD Falcon 353107 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T25 BD Falcon 353081 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T175 BD Falcon 353045 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T75  BD Falcon 353110 multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 1 L Millipore SCGPU11RE multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 150 ml Millipore SCGVU01RE multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 500 ml Millipore SCGPU05RE multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 50 ml Millipore SCGP00525 multiple manufacturers/suppliers
Filter Paper, 8.5 cm circles Whatman/GE 1001-085
Forceps, Standard Pattern - Serrated/Curved/18 cm Fine Science Tools 11001-18
Freezing Chamber, Isopropyl Alcohol Nalgene 5100-0001 "Mr. Frosty"
Incubator, 37 °C/5% CO2 Forma 370 series multiple manufacturers/suppliers
Hemacytometer, Phase Hausser Scientific 1475 multiple manufacturers/suppliers
McIlwain Tissue Chopper Lafayette Instruments TC752-PD  Petri dish modification required.   CAUTION:  Moving, sharp blade.
Micropipettor, 1-10 μl Gilson F144562 multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 100-1,000 μl (starter kit) Gilson F167700 multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 2-20 μl (starter kit) Gilson F167700 multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 20-200 μl (starter kit) Gilson F167700 multiple manufacturers/suppliers
Nutdriver, Autoclavable, 5/16" Steritool 10302
Pasteur Pipets, cotton-plugged Fisherbrand 13-678-8B multiple manufacturers/suppliers
Petri Dish, Glass, Autoclavable Corning 3160-100
Pipet Aid Drummond 4-000-101 multiple manufacturers/suppliers
Shim disc McMaster-Carr VARIABLE multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 10 μl AvantGuard AV10R-H multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 1,000 μl AvantGuard AV1000 multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 20 μl AvantGuard AV20-H multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 200 μl AvantGuard AV200-H multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 10 ml Fisherbrand 13-676-10J multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 2 ml Fisherbrand 13-675-3C multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 25 ml Fisherbrand 13-676-10K multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 5 ml Fisherbrand 13-676-10H multiple manufacturers/suppliers
Sterilization Pouches, 19 x 33 cm Crosstex SCL multiple manufacturers/suppliers
Strainer, 40 µm BD Falcon 352340
Tissue Culture Dishes, 60 mm BD Falcon 351007
Tube Racks, Interlocking Four-Way Fisherbrand 03-448-17
Water Bath Fisherbrand S52602Q multiple manufacturers/suppliers
Neural Progenitor Cell-Specific Processing Reagents
Neural Stem Cell Expansion Medium (Stemline) Sigma-Aldrich S3194-500ML Important to use the Stemline brand
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) Millipore GF316 multiple manufacturers/suppliers
Recombinant Human Leukemia Inhibitory Factor (LIF) Millipore LIF1010 multiple manufacturers/suppliers
Trypan Blue (0.4%) Sigma-Aldrich T8154-100ML multiple manufacturers/suppliers
TrypLE Select (1x) Life Technologies 12563-011

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cattaneo, E., McKay, R. Proliferation and differentiation of neuronal stem cells regulated by nerve growth factor. Nature. 347, 762-765 (1990).
  2. Palmer, T. D., Takahashi, J., Gage, F. H. The adult rat hippocampus contains primordial neural stem cells. Molecular and cellular neurosciences. 8, 389-404 (1997).
  3. Wu, Y., Liu, Y., Chesnut, J. D., Rao, M. S. Isolation of neural stem and precursor cells from rodent tissue. Methods in molecular biology. 438-4339 (2008).
  4. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  5. Svendsen, C. N., Fawcett, J. W., Bentlage, C., Dunnett, S. B. Increased survival of rat EGF-generated CNS precursor cells using B27 supplemented medium. Experimental brain research. Experimentelle Hirnforschung. Experimentation cerebrale. 102-407 (1995).
  6. Laywell, E. D., Kukekov, V. G., Steindler, D. A. Multipotent neurospheres can be derived from forebrain subependymal zone and spinal cord of adult mice after protracted postmortem intervals. Experimental neurology. 156-430 (1999).
  7. Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. 45, (45), (2010).
  8. Temple, S. Division and differentiation of isolated CNS blast cells in microculture. Nature. 340, 471-473 (1989).
  9. Chalmers-Redman, R. M., Priestley, T., Kemp, J. A., Fine, A. In vitro propagation and inducible differentiation of multipotential progenitor cells from human fetal brain. Neuroscience. 76, 1121-1128 (1997).
  10. Ostenfeld, T., et al. Regional specification of rodent and human neurospheres. Brain research. Developmental brain research. 134, 43-55 (2002).
  11. Carpenter, M. K., et al. et al. In vitro expansion of a multipotent population of human neural progenitor cells. Experimental neurology. 158, 265-278 (1999).
  12. Nunes, M. C., et al. Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nature. 9, 439-447 (2003).
  13. Piao, J. H., et al. Cellular composition of long-term human spinal cord- and forebrain-derived neurosphere cultures. Journal of neuroscience research. 84, 471-482 (2006).
  14. Barami, K., Zhao, J., Diaz, F. G., Lyman, W. D. Comparison of neural precursor cell fate in second trimester human brain and spinal cord. Neurological research. 23, 260-266 (2001).
  15. Walder, S., Ferretti, P. Distinct neural precursors in the developing human spinal cord. The International journal of developmental biology. 48, 671-674 (2004).
  16. Buc-Caron, M. H. Neuroepithelial progenitor cells explanted from human fetal brain proliferate and differentiate in vitro. Neurobiology of. 2, 37-47 (1995).
  17. Becq, H., Jorquera, I., Ben-Ari, Y., Weiss, S., Represa, A. Differential properties of dentate gyrus and CA1 neural precursors. Journal of. 62, 243-261 (2005).
  18. Keenan, T. M., Nelson, A. D., Grinager, J. R., Thelen, J. C., Svendsen, C. N. Real time imaging of human progenitor neurogenesis. PloS one. 5, (2010).
  19. Kim, H. J., McMillan, E., Han, F., Svendsen, C. N. Regionally specified human neural progenitor cells derived from the mesencephalon and forebrain undergo increased neurogenesis following overexpression of ASCL1. Stem cells. 27, 390-398 (2009).
  20. Windrem, M. S., et al. Neonatal chimerization with human glial progenitor cells can both remyelinate and rescue the otherwise lethally hypomyelinated shiverer mouse. Cell stem cell. 2, 553-565 (2008).
  21. Kitiyanant, N., Kitiyanant, Y., Svendsen, C. N., Thangnipon, W. B. D. N. F. - IGF-1- and GDNF-secreting human neural progenitor cells rescue amyloid beta-induced toxicity in cultured rat septal neurons. Neurochemical research. 37, 143-152 (2012).
  22. Dutta, S., et al. Cell therapy: the final frontier for treatment of neurological diseases. CNS neuroscience & therapeutics. 19, 5-11 (2013).
  23. Lindvall, O., Barker, R. A., Brustle, O., Isacson, O., Svendsen, C. N. Clinical translation of stem cells in neurodegenerative disorders. Cell stem cell. 10, 151-155 (2012).
  24. Wang, S., et al. Long-term vision rescue by human neural progenitors in a rat model of photoreceptor degeneration. Investigative ophthalmology & visual science. 49, 3201-3206 (2008).
  25. Kitchens, D. L., Snyder, E. Y., Gottlieb, D. I. FGF and EGF are mitogens for immortalized neural progenitors. Journal of. 25, 797-807 (1994).
  26. Craig, C. G., et al. In vivo growth factor expansion of endogenous subependymal neural precursor cell populations in the adult mouse brain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 2649-2658 (1996).
  27. Ciccolini, F., Svendsen, C. N. Fibroblast growth factor 2 (FGF-2) promotes acquisition of epidermal growth factor (EGF) responsiveness in mouse striatal precursor cells: identification of neural precursors responding to both EGF and FGF-2. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 7869-7880 (1998).
  28. Kelly, C. M., et al. EGF and FGF-2 responsiveness of rat and mouse neural precursors derived from the embryonic CNS. Brain research bulletin. 68, 83-94 (2005).
  29. Sun, Y., et al. Long-term tripotent differentiation capacity of human neural stem (NS) cells in adherent culture. Molecular and cellular neurosciences. 38, 245-258 (2008).
  30. Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells. Neuron. 11, 951-966 (1993).
  31. Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 1091-1100 (1996).
  32. Chojnacki, A., Weiss, S. Production of neurons, astrocytes and oligodendrocytes from mammalian CNS stem cells. Nature. 3, 935-940 (2008).
  33. Ferrari, D., Binda, E., De Filippis, L., Vescovi, A. L. Isolation of neural stem cells from neural tissues using the neurosphere technique. Current protocols in stem cell biology. Chapter. 2, 10-1002 (2010).
  34. Ebert, A. D., McMillan, E. L., Svendsen, C. N. Isolating, expanding, and infecting human and rodent fetal neural progenitor cells. Current protocols in stem cell biology. Chapter 2, Unit 2D 2, doi:10.1002/9780470151808.sc02d02s6. (2008).
  35. Svendsen, C. N., et al. Long-term survival of human central nervous system progenitor cells transplanted into a rat model of Parkinson's disease. Experimental neurology. 148, 135-146 (1997).
  36. Draper, J. S., et al. Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem cells. Nature. 22, 53-54 (2004).
  37. Buzzard, J. J., Gough, N. M., Crook, J. M., Colman, A. Karyotype of human ES cells during extended culture. Nature biotechnology. 22, 381-382; author reply 382. 10-1038 (2004).
  38. Mitalipova, M. M., et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nature. 23, 10-1038 Forthcoming.
  39. Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. Journal of neuroscience. 85, 141-152 (1998).
  40. Baghbaderani, B. A., Mukhida, K., Hong, M., Mendez, I., Behie, L. A. A review of bioreactor protocols for human neural precursor cell expansion in preparation for clinical trials. Current stem cell research & therapy. 6, 229-254 (2011).
  41. Ebert, A. D., et al. EZ spheres: A stable and expandable culture system for the generation of pre-rosette multipotent stem cells from human ESCs and iPSCs. Stem cell research. 10, 417-427 (2013).
  42. Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
  43. Consortium, H. D. iP. S. C. Induced pluripotent stem cells from patients with Huntington's disease show CAG-repeat-expansion-associated phenotypes. Cell stem cell. 11, 264-278 (2012).
  44. Gamm, D. M., Nelson, A. D., Svendsen, C. N. Human retinal progenitor cells grown as neurospheres demonstrate time-dependent changes in neuronal and glial cell fate potential. Annals of the New York Academy of Sciences. 1049-10107 (2005).
  45. Hosoyama, T., Meyer, M. G., Krakora, D., Suzuki, M. Isolation and in vitro propagation of human skeletal muscle progenitor cells from fetal muscle. Cell biology international. 37, 191-196 (2013).
  46. Sareen, D., et al. Inhibition of apoptosis blocks human motor neuron cell death in a stem cell model of spinal muscular atrophy. PloS one. 7, (2012).
  47. Chang, M. Y., Park, C. H., Lee, S. H. Embryonic cortical stem cells secrete diffusible factors to enhance their survival. Neuroreport. 14, 1191-1195 (2003).
  48. Sareen, D., et al. Chromosome 7 and 19 trisomy in cultured human neural progenitor cells. PloS one. 4, (2009).

Erratum

Formal Correction: Erratum: A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue
Posted by JoVE Editors on 09/01/2014. Citeable Link.

A correction was made to A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue. The corresponding author was changed from:

Brandon C. Shelley

to:

Clive Svendsen

İnsan Nöral Agregalarının bir cGMP uygulanabilir Açılım Yöntemi kök hücrelerin pluripotent kök hücreleri veya Fetal Beyin dokusundan türetilen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue. J. Vis. Exp. (88), e51219, doi:10.3791/51219 (2014).More

Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue. J. Vis. Exp. (88), e51219, doi:10.3791/51219 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter