En este trabajo se demuestra el uso de un microscopio confocal de barrido rápido de comportamiento de las células de imagen directamente a través de la pupa. Al dejar el caso de pupa intacta, este método permite la observación y medición de los procesos dinámicos de célula en una etapa de desarrollo de Drosophila que es difícil de estudiar directamente.
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Artículo de método
Imaging A través de la envoltura pupal de
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Resumen
Resumen
El uso de larga data de la Drosophila como modelo para la biología celular y del desarrollo ha dado una serie de herramientas. En conjunto, estas técnicas han permitido el análisis de la biología celular y del desarrollo de una variedad de ángulos metodológicos. Formación de imágenes en vivo es un método emergente para la observación de los procesos dinámicos de célula, tales como la división celular o la motilidad celular. Habiendo aislado mutaciones en las proteínas del ciclo celular putativo no caracterizados Se convirtió en fundamental tener en cuenta la mitosis in situ utilizando imágenes en vivo. La mayoría de los estudios de imagen en vivo en Drosophila se han centrado en las etapas embrionarias que son accesibles a la manipulación y observación debido a su pequeño tamaño y claridad óptica. Sin embargo, en estas etapas del ciclo celular es inusual ya que carece de una o ambas de las fases gap. Por el contrario, las células del ala pupal de Drosophila tienen un ciclo celular típico y se someten a un período de la mitosis rápida que comprende aproximadamente 20 h de desarrollo de pupa. Es fácil de identify y aislar las pupas de la etapa apropiada para coger la mitosis in situ. Montaje pupas intacta proporciona la mejor combinación de manejabilidad y durabilidad durante la exploración, lo que permite experimentos para una duración de varias horas con un impacto mínimo sobre la viabilidad celular y animal. El método permite la observación de características tan pequeño como, o menor que, mosca cromosomas. Ajuste de ajustes del microscopio y los detalles de montaje, permite la extensión de la preparación para visualizar dinámica de la membrana de las células adyacentes y las proteínas marcadas con fluorescencia, tales como la tubulina. Este método funciona para todas las proteínas fluorescentes a prueba y puede capturar características submicrónicas escala sobre una variedad de escalas de tiempo. Si bien limitado a la exterior 20 m de la pupa con un microscopio confocal convencional, este enfoque a la observación de la proteína y la dinámica celular en los tejidos pupal in vivo puede ser generalmente útiles en el estudio de la biología celular y del desarrollo en estos tejidos.
Introducción
La mosca del vinagre, Drosophila melanogaster, es un modelo bien establecido para el estudio de muchos aspectos de la biología. Investigación Drosophila tiene una rica historia de la experimentación genética que permite formas sofisticadas de manipulación genética, incluyendo la expresión, desmontables y mutación. Con el advenimiento de las etiquetas de proteínas fluorescentes, este repertorio se ha ampliado para incluir estudios de células y proteínas en animales vivos. El embrión de la mosca es un sistema excelente para este tipo de estudios ya que es pequeño y ópticamente claro lo que permite modelar profundo, de alta resolución in vivo....
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Protocolo
1. Vuela Trabajo
- Mantener moscas en medio de la harina de maíz-agar-melaza-levadura estándar a temperatura ambiente 10.
- Para cruces, vírgenes aislar dentro de las 6 horas de la eclosión. Después de cruzar a los hombres del genotipo deseado, el cambio vuela a nuevos viales cada 3-4 días.
Nota: Para estos experimentos, la línea de Gal4 A9 se utilizó para conducir la expresión de los transgenes en el ala. Fly existencias se pueden obtener en el centro stock en Bloomington. Acciones utilizadas en estos experimentos incluyen A9-Gal4 (Bl # 8761), His2Av-GFP (Bl # 5941), Sco / CyO HsCre (Bl # 1092), UAS-ChRF....
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Resultados
Las células en el epitelio pseudoestratificado, tales como el ojo de Drosophila en desarrollo, o la capa ventricular del sistema nervioso central de los vertebrados en desarrollo, se someten a los movimientos nucleares, denominado migración nuclear interkinetic, en el tiempo con el ciclo celular. La replicación del ADN se produce cuando los núcleos están en o cerca de la superficie basal y las células entran en la mitosis cuando los núcleos llegan a la superficie apical 15,16. Las células del ala pup.......
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Discusión
Para visualizar, medir y cuantificar las características de las células en división, el desarrollo requiere de una preparación sencilla para la observación de la mitosis en el ala pupal viviente de Drosophila mediante análisis confocal de His2AvGFP células que expresan. Este método se utiliza para documentar que el ciclo celular en el ala de pupa tiene similitudes fuertes a la celda ciclos en el epitelio pseudoestratificado que los núcleos en movimiento a la superficie apical del epitelio, donde entran en la mi.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer Akira Chiba para la ayuda intelectual, material de apoyo, y las existencias. Gracias a Julia Dallman para comentarios.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Fly stuff fly pad | Genesee Scientific | 59-114 | para anestesia con moscas |
| CO2 gas | Airgas South | CD50 | para anestesia con moscas |
| Regulador | Airgas South | CO2 | |
| regulador Viales para moscas | Genesee Scientific | 32-113RLBF | Cultivo |
| de moscasDrosophila líneas:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773) | Bloomington Stock Center | ||
| Platos con fondo de vidrio # 1 1/2 | WillCo Wells BV | Para microscopía | |
| Tiodietilenglicol | Fluka | 88559 | montante |
| de suministros de arte | arcilla para modelar | Apoyo para posicionar pupas contra | |
| Tienda de suministros | Para manipular moscas | ||
| Pinzas finas, Inox #5 | Herramientas de ciencia fina | 11252-20 | Dumont #5 |
| ordenador | cualquiera | 8 Gb de RAM para el análisis de imágenes/películas | |
| Software | gratuito http://fiji.sc/Fiji | Software de análisis de imágenes | |
| Microscopio | Cualquier confocal de barrido rápido debe ser suficiente | ||
| 20 veces en seco y 40 o 63 veces lentes de inmersión en aceite | cualquiera | Para obtener imágenes de las características | |
| tisulares, celulares y subcelularesAceite de inmersión (no fluorescente) | |||
| Microscopio estereoscópico | cualquiera | Para la manipulación de moscas |
Referencias
- Raff, J. W., Jeffers, K., Huang, J. Y. The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time. J. Cell Biol. 157, 1139-1149 (2002).
- Stramer, B., et al.
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Reimpresiones y permisos
