Summary
En este trabajo se demuestra el uso de un microscopio confocal de barrido rápido de comportamiento de las células de imagen directamente a través de la pupa. Al dejar el caso de pupa intacta, este método permite la observación y medición de los procesos dinámicos de célula en una etapa de desarrollo de Drosophila que es difícil de estudiar directamente.
Abstract
El uso de larga data de la Drosophila como modelo para la biología celular y del desarrollo ha dado una serie de herramientas. En conjunto, estas técnicas han permitido el análisis de la biología celular y del desarrollo de una variedad de ángulos metodológicos. Formación de imágenes en vivo es un método emergente para la observación de los procesos dinámicos de célula, tales como la división celular o la motilidad celular. Habiendo aislado mutaciones en las proteínas del ciclo celular putativo no caracterizados Se convirtió en fundamental tener en cuenta la mitosis in situ utilizando imágenes en vivo. La mayoría de los estudios de imagen en vivo en Drosophila se han centrado en las etapas embrionarias que son accesibles a la manipulación y observación debido a su pequeño tamaño y claridad óptica. Sin embargo, en estas etapas del ciclo celular es inusual ya que carece de una o ambas de las fases gap. Por el contrario, las células del ala pupal de Drosophila tienen un ciclo celular típico y se someten a un período de la mitosis rápida que comprende aproximadamente 20 h de desarrollo de pupa. Es fácil de identify y aislar las pupas de la etapa apropiada para coger la mitosis in situ. Montaje pupas intacta proporciona la mejor combinación de manejabilidad y durabilidad durante la exploración, lo que permite experimentos para una duración de varias horas con un impacto mínimo sobre la viabilidad celular y animal. El método permite la observación de características tan pequeño como, o menor que, mosca cromosomas. Ajuste de ajustes del microscopio y los detalles de montaje, permite la extensión de la preparación para visualizar dinámica de la membrana de las células adyacentes y las proteínas marcadas con fluorescencia, tales como la tubulina. Este método funciona para todas las proteínas fluorescentes a prueba y puede capturar características submicrónicas escala sobre una variedad de escalas de tiempo. Si bien limitado a la exterior 20 m de la pupa con un microscopio confocal convencional, este enfoque a la observación de la proteína y la dinámica celular en los tejidos pupal in vivo puede ser generalmente útiles en el estudio de la biología celular y del desarrollo en estos tejidos.
Introduction
La mosca del vinagre, Drosophila melanogaster, es un modelo bien establecido para el estudio de muchos aspectos de la biología. Investigación Drosophila tiene una rica historia de la experimentación genética que permite formas sofisticadas de manipulación genética, incluyendo la expresión, desmontables y mutación. Con el advenimiento de las etiquetas de proteínas fluorescentes, este repertorio se ha ampliado para incluir estudios de células y proteínas en animales vivos. El embrión de la mosca es un sistema excelente para este tipo de estudios ya que es pequeño y ópticamente claro lo que permite modelar profundo, de alta resolución in vivo 1-3. Otras etapas de desarrollo de la mosca han demostrado ser menos manejable, lo que requiere la anestesia 4, la disección y la cultura a corto plazo 5,6, o la creación de ventanas de la cutícula para obtener imágenes de 7,8. Estas manipulaciones normalmente comprometen el desarrollo animal en el largo plazo o afectan el animal de manera que limitan la formación de imágenes a períodos cortos.
ENT "> Para estudiar las mutaciones en los genes nuevos que se asemejan a los reguladores del ciclo celular, que era esencial para encontrar una preparación apropiada para estudiar la sincronización y la fidelidad del ciclo celular. Dado que la mayoría de los ciclos celulares embrionarias se truncan (SM o S-G2-M) y los mutantes estudiados no muestran defectos hasta en etapas posteriores, era importante tener en cuenta el ciclo celular en los tejidos de la etapa de pupa. células epiteliales en la pupa tienen un ciclo celular de G1-S-G2-M más típica y pupas de esta etapa son no capaz de movimientos musculares 9. El punto de partida inicial para manipulaciones incluyen intacto pupas completas que expresan Histone2AV-GFP. pesar de la aparente opacidad de la cápsula de la pupa, esta preparación intacta demostró ser excelente para largo plazo en imágenes in vivo. Esta técnica es simple lo suficiente para que los investigadores universitarios habitualmente lo utilizan para estudiar los aspectos de la biología celular y del desarrollo en Drosophila y sin embargo la resolución es lo suficientemente fina como para permitir la discriminación de características de escala micrométrica. Con este método, son posibles observaciones de los eventos más horas, minutos o segundos simplemente ajustando los parámetros de series de tiempo. Videos utilizando, proteínas verdes, amarillos, naranjas, rojos y azules fluorescentes, o combinaciones de éstos, se han hecho. Es importante destacar que, si se toma cuidado para reducir al mínimo la intensidad del láser, incluso de formación de imágenes a largo plazo no tiene ningún efecto sobre el desarrollo o la viabilidad de los animales.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vuela Trabajo
- Mantener moscas en medio de la harina de maíz-agar-melaza-levadura estándar a temperatura ambiente 10.
- Para cruces, vírgenes aislar dentro de las 6 horas de la eclosión. Después de cruzar a los hombres del genotipo deseado, el cambio vuela a nuevos viales cada 3-4 días.
Nota: Para estos experimentos, la línea de Gal4 A9 se utilizó para conducir la expresión de los transgenes en el ala. Fly existencias se pueden obtener en el centro stock en Bloomington. Acciones utilizadas en estos experimentos incluyen A9-Gal4 (Bl # 8761), His2Av-GFP (Bl # 5941), Sco / CyO HsCre (Bl # 1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl # 25773), lollibow 11.
2. Selección y montaje de pupas
- Etapa pupas ya sea por su recogida como prepupas blanco (WPP) y mantenerlos a 25 ° C hasta que alcanzan la edad adecuada o utilizando criterios morfológicos 12.
- Observar las divisiones celulares, seleccione pupa que han sido objeto recientemente de eversión cabeza.Desde este momento hasta antes de la eclosión (a> 96 h), pupas están permitiendo inmóvil observación prolongado lapso de tiempo.
- Retire las pupas de los viales por ellos tocando primero con un pincel humedecido con agua, a la espera de un minuto para permitir que el agua para aflojar el adhesivo y luego suavemente aguijoneándolos en el pincel.
- Lave suavemente pupas seleccionada por pinchar con un pincel en agua para eliminar el adhesivo de la glándula y las partículas de alimentos salivales.
- Traslado pupas limpia para un plato de Petri de 25 mm con un fondo cubreobjetos (número 1 ½ cubreobjetos).
- El uso de tiras delgadas de cualquiera de modelado de la arcilla o cera dental como un soporte, montar pupas de modo que el tejido de interés es más cercano a la cubreobjetos.
Nota: En los estudios aquí descritos, se han observado alas pupal, piernas, abdominales o histoblasts notum dorsal. En la práctica, cualquier tejido dentro de 20 micras de la superficie de la envoltura pupal es observable. - Pupas Orient con cuidado para que el tissuE de interés es paralelo a la superficie cubreobjetos de vidrio.
- Una vez que se montan pupas, utilizar un pincel para transferir una capa delgada de tiodietilenglicol (TDG) al espacio entre la pupa y el cubreobjetos.
Nota: TDG reduce la dispersión de superficie, coincide con el índice de refracción del aceite, y permite que el oxígeno penetre el tejido 13. No se recomienda el uso de aceites, ya que tienden a privar a los tejidos de oxígeno, causando un rápido cese de los comportamientos celulares.
3. Imaging
Nota: Para formación de imágenes, un microscopio confocal es probable que sea esencial como la confocalidad elimina la mayor parte del fondo oscurecimiento causado por la intensa iluminación del caso de pupa.
- Ajuste la configuración de la confocal para minimizar el impacto de la iluminación en el desarrollo de pupa y viabilidad. Para ello, lograr un equilibrio entre la intensidad de la excitación y la sensibilidad de la colección. Una configuración típica para wi imágenesª del Leica SP5 utiliza el escáner de resonancia (8000 Hz), la potencia del láser se establece en el 2% (10% de transmisión de la energía del 20%), conjunto pinhole a 120 m, y la línea Configuración de promedio a 8. Configuración variarán dependiendo de las condiciones experimentales.
Nota: Para resolver escala fina dispone de 40X y 63X lentes de inmersión en aceite (distancia de trabajo 0,1 mm) también se han utilizado con éxito en este método, a pesar de que limitan la profundidad del foco.
4. Análisis
Para el análisis de los marcos, z-pilas o películas importar los archivos de datos a Fiji, que dispone de herramientas eficaces para la visualización, medición y modificación de archivos de presentación 14. Por ejemplo el tiempo para completar la mitosis se midió utilizando el intervalo de muestreo y navegador de imágenes multidimensionales para desplazarse por los marcos mientras ve una célula a partir de la profase de telofase. x-, y-, y z-dimensiones pueden medirse utilizando la herramienta de medición. Para obtener instrucciones detalladas sobre el software y su usover: http://fiji.sc/Fiji.
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Representative Results
Las células en el epitelio pseudoestratificado, tales como el ojo de Drosophila en desarrollo, o la capa ventricular del sistema nervioso central de los vertebrados en desarrollo, se someten a los movimientos nucleares, denominado migración nuclear interkinetic, en el tiempo con el ciclo celular. La replicación del ADN se produce cuando los núcleos están en o cerca de la superficie basal y las células entran en la mitosis cuando los núcleos llegan a la superficie apical 15,16. Las células del ala pupal forman un epitelio monocapa se dividen rápidamente durante las primeras horas después de la eversión cabeza. Los datos fueron recolectados en el modo xyzt de un ala pupal temprano, tomando secciones cada 2 micras, con intervalos de 1 min. En la mitosis películas 3D resultante sólo fue visto en la superficie apical (fig. 1A). Secciones tomadas en lugares más basales no mostraron signos de mitosis (Figura 1B), pero los movimientos nucleares ocurrieron como los núcleos recién divididas regresaron de la superficie apical.
Figura 1. Los núcleos se mueve a la parte superior del epitelio de dividir. Secciones representativas de una imagen confocal xyzt de tipo salvaje ala pupal de Drosophila expresando His2AvGFP. En la parte superior-la mayoría de las secciones (A) los núcleos se pueden ver en las diferentes fases del ciclo celular. Los núcleos en metafase (flechas) son abundantes en esta micrografía como son núcleos en telofase (puntas de flecha). En planos inferiores de la sección (B) no hay evidencia de la mitosis es aparente aunque hay variación en el diámetro nuclear, que es indicativa del estado de la replicación del ADN. Escala Bar 10 micras. Haz clic aquí para ver la imagen más grande .
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Discussion
Para visualizar, medir y cuantificar las características de las células en división, el desarrollo requiere de una preparación sencilla para la observación de la mitosis en el ala pupal viviente de Drosophila mediante análisis confocal de His2AvGFP células que expresan. Este método se utiliza para documentar que el ciclo celular en el ala de pupa tiene similitudes fuertes a la celda ciclos en el epitelio pseudoestratificado que los núcleos en movimiento a la superficie apical del epitelio, donde entran en la mitosis. Después de la telofase, los núcleos caen de nuevo en la capa epitelial. Por lo tanto, las células de esta monocapa, epitelio aparentemente no estratificada, espectáculo limitados interkinetic migración nuclear.
Imágenes de las reservas y las líneas creadas para Brainbow imágenes en vivo 17 tipo en Drosophila 11 disponibles al público, demostró que esta técnica es generalizable al estudio de otros fenómenos biológicos. La técnica descrita aquí se utiliza en la producción de videos durante tiempos que van desde minutos hasta 10 horas. Hasta cierto punto, los parámetros del microscopio varían con el experimento. Por ejemplo, la frecuencia de muestreo de time-lapse debe ser conforme a la naturaleza del fenómeno biológico en observación: para la observación de las divisiones celulares, que normalmente toman alrededor de 12 minutos de la profase de telofase, recogiendo una pila de imágenes cada minuto es apropiado. Para observar el comportamiento de filopodios en las mismas células, secciones o pilas deben recogerse en intervalos más fino (3 seg).
En las condiciones descritas, se observó ningún efecto sobre la supervivencia o la morfología de los adultos eclosing independientemente del período de observación. Cuando el marcador fluorescente es de baja abundancia, la potencia del láser se incrementó normalmente. En estas situaciones, el acortamiento de la duración de la película o reducir el número de secciones o z-pilas, la exposición minimizado. En los controles para otros experimentos, la exposición del tejido a la máxima intensidad durante 5 minutos no tuvo eficaciat en la morfología o la supervivencia de los adultos. La visualización se amplió para incluir rojo, verde, amarillo, naranja y azul proteínas fluorescentes etiquetadas a una variedad de diferentes proteínas, localizado en la membrana, y / o llenar el citoplasma. Características de la gama submicrónica se observaron en escalas de tiempo de segundos a horas. Este método se ha utilizado ampliamente para observar y medir el tiempo y la fidelidad de la mitosis en el tipo salvaje y los mutantes (en preparación).
La fase de pupa de desarrollo de Drosophila es un período de notable plasticidad en el que la forma larvaria se elimina sustancialmente, mientras que la forma adulta se desarrolla en el andamio del cuerpo de la larva. A pesar de una rica historia, el estudio de la metamorfosis ha sido metodológicamente obstaculizado. Por ejemplo, el uso de la observación directa para estudiar los procesos metamorfosis subyacente ha sido limitado por la falta de acceso fiable en vivo a las células y tejidos durante la remodelación. El sorprendentementeenfoque sencillo presentado aquí permite el acceso a este período críptico de desarrollo en Drosophila. El enfoque es bastante simple que estudiantes pueden aprender y usar y lo suficientemente robusta como para permitir que las observaciones de los tejidos, las células y la organización subcelular fácilmente. El microscopio usado para estos experimentos no está optimizado para imágenes de tejidos profundos, y así nuestras observaciones están limitados en gran medida a la exterior 20 m de la pupa. Es probable que las técnicas que permiten la penetración en el tejido más profundo, como la microscopía de múltiples fotones, permitirían una profundidad mucho mayor de formación de imágenes y permitir el estudio de los reordenamientos estructurales internos subyacentes metamorfosis.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer Akira Chiba para la ayuda intelectual, material de apoyo, y las existencias. Gracias a Julia Dallman para comentarios.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly stuff fly pad | Genesee Scientific | 59-114 | for fly anesthetization |
| CO2 gas | Airgas South | CD50 | For fly anesthetization |
| Regulator | Airgas South | CO2 regulator | |
| Fly vials | Genesee Scientific | 32-113RLBF | Fly culture |
| Drosophila lines:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773) | Bloomington Stock Center | ||
| Glass bottom dishes #1 1/2 | WillCo Wells BV | For microscopy | |
| Thiodiethylene Glycol | Fluka | 88559 | mountant |
| Modeling clay | art supply store | Support to position pupae against | |
| Paintbrushes | art supply store | To manipulate flies | |
| Fine Forceps, Inox #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| computer | any | 8 Gb RAM for image/movie analysis | |
| Fiji software | Free ware http://fiji.sc/Fiji | Image analysis software | |
| Confocal microscope | Any fast scanning confocal should be sufficient | ||
| 20X dry, and 40X or 63X oil immersion lenses | any | For imaging tissue, cellular, and subcellular features | |
| Immersion oil (nonfluorescent) | |||
| Stereomicroscope | any | For fly manipulation |
References
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