Summary
Detta dokument visar användningen av en snabb scanning konfokalmikroskop bilden cellens beteende direkt genom puparium. Om du lämnar det PUPP fall intakt, gör denna metod observation och mätning av dynamiska cellprocesser i ett skede av Drosophila utveckling som är svår att studera direkt.
Abstract
Den långvariga användning av Drosophila som en modell för cell-och utvecklingsbiologi har gett en rad verktyg. Tillsammans har dessa tekniker möjlig analys av cell-och utvecklingsbiologi från en mängd olika metodologiska vinklar. Live avbildning är en växande metod för att observation dynamiska cellprocesser, såsom celldelning eller cellrörlighet. Efter att ha isolerade mutationer i okarakteriserade förmodade cellcykelns proteiner blev det viktigt att observera mitos på plats med hjälp av live-avbildning. De flesta live-imaging studier i Drosophila har fokuserat på de embryonala stadierna som är tillgängliga för manipulation och observation på grund av sin ringa storlek och optisk klarhet. Men i dessa stadier i cellcykeln är ovanlig i det att den saknar en eller båda av de spalt faser. Däremot celler av pupal flygel Drosophila har en typisk cellcykeln och genomgå en period av snabb mitos som spänner över omkring 20 h av pupal utveckling. Det är lätt att identify och isolera puppor av respektive fas för att fånga mitos in situ. Montering intakt puppor ger den bästa kombinationen av spårbarhet och hållbarhet under avbildning, så försök att köra i flera timmar med minimal påverkan på cell-och djurlivsduglighet. Metoden medger observation av funktioner så liten som, eller mindre än, fluga kromosomer. Justering av mikroskopinställningar och detaljerna för montering, tillät förlängning av preparatet för att visualisera membran dynamiken i angränsande celler och fluorescerande proteiner såsom tubulin. Denna metod fungerar för alla testade fluorescerande proteiner och kan fånga submikrona skala funktioner över en mängd olika tidsskalor. Medan begränsad till det yttre 20 um av puppan med en konventionell konfokalmikroskop, kan denna metod för att observera protein och cellulära dynamik i PUPP vävnader in vivo vara generellt användbar i studiet av cell-och utvecklingsbiologi i dessa vävnader.
Introduction
Den vinäger fluga, Drosophila melanogaster, är en väl etablerad modell för att studera många aspekter av biologi. Drosophila forskning har en rik historia av genetiska experiment som tillåter avancerade former av genmanipulation inklusive uttryck, knockdown och mutation. Med tillkomsten av fluorescerande proteinetiketter har denna repertoar utökats med studier av celler och proteiner i levande djur. Flugan embryot är ett utmärkt system för sådana studier eftersom den är liten och optiskt klar låta djupt, högupplösande avbildning in vivo 1-3. Andra stadier fluga utveckling har visat sig vara mindre foglig, som kräver narkos 4, dissektion och kortsiktiga kultur 5,6, eller skapandet av fönster i nagelbanden för avbildning 7,8. Dessa manipulationer kompromissa oftast djur utveckling på lång sikt eller påverkar djur på ett sätt som begränsar avbildning för korta perioder.
ent "> Att studera nya mutationer i gener som liknar cellcykelregulatorer, var det viktigt att hitta en lämplig förberedelse för att studera när och trohet av cellcykeln. Eftersom de flesta embryonala cellcykler trunkeras (SM eller S-G2-M) och de mutanter som studeras inte visar fel förrän senare skeden, var det viktigt att observera cellcykeln i puppstadium vävnader. Epitelceller i puppan har en mer typisk G1-S-G2-M cellcykeln och puppor i detta skede är inte klarar av muskelrörelser 9. Den initiala utgångspunkt för manipulationer ingår intakt hela puppor uttrycker Histone2AV-GFP. Trots den uppenbara opacitet PUPP fallet denna intakt preparat visat sig vara utmärkt för långtids in vivo imaging. Tekniken är enkel nog att grund forskare rutinmässigt använda den för att studera aspekter av cell-och utvecklingsbiologi i Drosophila och ändå upplösningen är bra nog för att tillåta diskriminering på mikrometernivå funktioner. Med den här metoden, observationer av händelser under timmar, minuter eller sekunder är möjliga att helt enkelt genom att justera tidsserieparametrar. Videor med blått, grönt, gult, orange och rött fluorescerande proteiner, eller kombinationer av dessa har gjorts. Viktigt är om omsorg för att minimera laserintensiteten, även långsiktiga avbildning har ingen effekt på utvecklingen eller livskraft djuren.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fly Arbete
- Behåll flugor på standard majsmjöl-agar-melass-jäst medium vid rumstemperatur 10.
- För korsningar, isolera oskulder inom 6 timmar av eclosion. Efter att ha korsat för hanar av önskad genotyp, flyger byt till nya flaskor var 3-4 dagar.
Notera: För dessa experiment Gal4 linje A9 användas för att driva expression av transgener i vingen. Fly lagren kan erhållas från aktie centrum i Bloomington. Lagren som används i dessa experiment inkluderar A9-Gal4 (Bl # 8761), His2Av-GFP (Bl # 5941), Sco / CYO HsCre (Bl # 1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl # 25773), lollibow 11.
2. Urval och Montering av Puppor
- Stage puppor antingen genom att samla dem så vitt prepupae (WPP) och hålla dem vid 25 ° C tills de når lämplig ålder eller genom att använda morfologiska kriterier 12.
- För att observera celldelningar väljer puppa som nyligen har genomgått huvud eversion.Från denna tid fram till strax före eclosion (vid> 96 timmar), är puppor orörlig tillåter förlängd tidsförlopp observation.
- Ta puppor från flaskorna genom att först röra vid dem med en pensel fuktad med vatten, väntar på en minut för att låta vattnet för att lossa limmet och sedan försiktigt petade dem på pensel.
- Tvätta försiktigt utvalda puppor genom petade dem med en pensel i vatten för att ta bort spottkörteln lim och matrester.
- Överför ren puppor till en 25 mm petriskål med en täck botten (nummer 1 ½ täckglas).
- Med hjälp av tunna remsor av antingen modellera eller tand vax som ett stöd, montera puppor så att vävnaden av intresse är närmast täckglas.
OBS: I de studier som beskrivs här, har PUPP vingar, ben, buk histoblasts eller rygg notum observerats. I praktiken är varje vävnad i 20 um av ytan av PUPP fall observerbara. - Orient puppor försiktigt så att tissue av intresse är parallell med täckglas ytan.
- När puppor är monterade, använd en pensel för att överföra ett tunt lager av tiodietylenglykol (TDG) till utrymmet mellan puppa och täckglas.
Anm: TDG minskar ytan spridning, matchar brytningsindexet för olja, och tillåter syre att genomtränga vävnaden 13. Rekommenderas inte användning av oljor, eftersom de tenderar att beröva vävnaderna av syre, vilket orsakar snabba upphörande av cell beteenden.
3. Imaging
Obs: För avbildning, kommer sannolikt att vara avgörande eftersom konfokalitet tar bort det mesta av fördunklande bakgrunden som orsakas av intensiv belysning av PUPP fall en konfokalmikroskop.
- Justera inställningarna på konfokala för att minimera effekterna av belysning på pupal utveckling och livskraft. För att göra detta, hitta en balans mellan intensitet excitation och känslighet samlingen. En typisk konfiguration för avbildning with Leica SP5 använde resonans scannern (8.000 Hz), lasereffekt satt till 2% (10% transmittans på 20% effekt), pinhole set till 120 nm, och linje medelvärdes satt till 8. Inställningar kommer att variera beroende på försöksbetingelserna.
OBS: För att lösa finskaliga funktioner 40X och 63X oljedopp linser (0,1 mm arbetsavstånd) har också använts med framgång i denna metod, även om de begränsar djupet i fokus.
4. Analys
För att analysera ramar, z-stackar eller filmer importera datafiler till Fiji, som har effektiva verktyg för visning, mätning och modifiera filer för presentation 14. Till exempel tid att slutföra mitos mättes med samplingsintervallet och flerdimensionella bildläsaren för att stega genom bildrutor medan du tittar på en cell från profas att telofas. x-, y-, och z-dimensionerna mätas med mätverktyget. För detaljerade instruktioner om programmet och dess användningse: http://fiji.sc/Fiji.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Celler i pseudostratified epitel, såsom utveckling av Drosophila-ögat, eller den ventrikulära lagret av framkallnings vertebrat centrala nervsystemet, undergår kärn rörelser, benämnd interkinetic nukleär migrering, i tiden med cellcykeln. DNA-replikation inträffar när kärnorna är vid eller nära den basala ytan och celler in mitos när kärnorna når den apikala ytan 15,16. PUPP ving cellerna bildar en snabbt delande monoskikt epitel under de första timmarna efter huvud eversion. Data samlades in i xyzt läge från en tidig pupal flygel, med sektioner var 2 pm på 1 minuters intervall. I den resulterande 3D-filmer mitos sågs endast vid den apikala ytan (Figur 1A). Sektioner tagna vid flera basala platser visade inga tecken på mitos (Figur 1B) men kärn rörelser inträffade som de nyligen uppdelade kärnorna tillbaka från den apikala ytan.
Figur 1. Kärnor flytta till toppen av epitelet att dela. Representativa sektioner från en xyzt konfokala bild av vildtyp Drosophila PUPP vinge uttrycker His2AvGFP. På de översta delarna (A) kärnor kan ses i olika faser av cellcykeln. Kärnor i metafas (pilar) är riklig i denna mikrograf som är kärnor i telofasa (pilspetsar). Vid lägre plan av avsnitt (B) inga tecken på mitos framgår även om det finns variationer i nukleär diameter, som är indikativ för tillståndet för DNA-replikation. Scale Bar 10 mikrometer. Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att visualisera, mäta och kvantifiera egenskaper hos delande celler, krävs utveckling av en enkel förberedelse för att observera mitos i levande PUPP flygel Drosophila genom konfokal analys av His2AvGFP uttryckande celler. Denna metod användes för att dokumentera att cellcykeln i PUPP flygeln har stora likheter till cellcykler i pseudostratified epitel i att kärnor flytta till den apikala yta epitel där de går in mitos. Efter telofas, kärnor falla tillbaka in i epitelskiktet. Därför de rutor i monoskikt, som synes ostratifierad epitel, uppvisar begränsad interkinetic nukleär migrering.
Imaging av allmänt tillgängliga lager och linjer skapas för Brainbow 17 typ Bildproduktion i Drosophila 11, visade att denna teknik är generaliserbara till studiet av andra biologiska fenomen. Den teknik som beskrivs här har använts i framställningen av videos över tider som sträcker sig från några minuter till 10 timmar. Till viss del, de mikroskop parametrar varierar med experimentet. Till exempel måste samplingsfrekvensen för time-lapse avbildning överensstämmer med den typ av biologiskt fenomen under observation: för att observera celldelningar, som normalt tar ca 12 min från profas att telofas, samla en bunt bilder varje minut är lämpligt. För att observera beteende filopodia i samma celler, måste sektioner eller staplar hämtas på finare (3 sek) mellanrum.
Under de förhållanden som beskrivits, har ingen effekt på överlevnad eller morfologi eclosing vuxna observeras oberoende av observationsperioden. När den fluorescerande markören är av låg överflöd, var lasereffekt vanligtvis ökat. I dessa situationer, korta av filmen eller minskning av antalet sektioner eller z-stackar, minimeras exponeringen. Vid kontroller för andra experiment, utsätta vävnaden för maximal intensitet i 5 minuter hade någon effektivt på morfologi eller överlevnad av den vuxna. Visualisering utvidgades till att omfatta rött, grönt, gult, orange och blå fluorescerande proteiner taggade till en mängd olika proteiner, lokaliserad till membranet, och / eller fylla cytoplasman. Funktioner i submikronområdet observerades under tidsskalor från sekunder till timmar. Denna metod har använts i stor utsträckning för att observera och mäta tidpunkten och trohet mitos i vildtyp och mutanter (under utarbetande).
Den puppstadium av Drosophila utveckling är en period av anmärkningsvärd plasticitet i vilken larv formen är väsentligen eliminerad medan den vuxna formen utvecklas på ställningen av larvkroppen. Trots en rik historia, har studiet av metamorfos varit metodologiskt hämmas. Exempelvis har användningen av direkt observation för att studera processer som ligger bakom metamorfos begränsats av bristen på tillförlitlig in vivo tillgång till celler och vävnader under ombyggnad. Den överraskandeenkel metod som presenteras här ger tillgång till denna kryptiska period av utveckling i Drosophila. Tillvägagångssättet är enkelt nog att studenter lätt kan lära sig och använda den och tillräckligt robust för att möjliggöra observationer av vävnader, celler och subcellulär organisation. Mikroskopet som användes för dessa experiment är inte optimerat för djup vävnad avbildning, och så våra observationer är i stort sett begränsad till den yttre 20 um av puppan. Det är troligt att tekniker som tillåter djupare vävnadspenetration, såsom multi-foton mikroskopi, skulle ge en mycket större djup av bildbehandling och möjliggöra studier av de interna konstruktions omdisponeringar underliggande metamorfos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna Akira Chiba för intellektuellt stöd, materiellt stöd, och lager. Tack till Julia Dallman för kommentarer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly stuff fly pad | Genesee Scientific | 59-114 | for fly anesthetization |
| CO2 gas | Airgas South | CD50 | For fly anesthetization |
| Regulator | Airgas South | CO2 regulator | |
| Fly vials | Genesee Scientific | 32-113RLBF | Fly culture |
| Drosophila lines:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773) | Bloomington Stock Center | ||
| Glass bottom dishes #1 1/2 | WillCo Wells BV | For microscopy | |
| Thiodiethylene Glycol | Fluka | 88559 | mountant |
| Modeling clay | art supply store | Support to position pupae against | |
| Paintbrushes | art supply store | To manipulate flies | |
| Fine Forceps, Inox #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| computer | any | 8 Gb RAM for image/movie analysis | |
| Fiji software | Free ware http://fiji.sc/Fiji | Image analysis software | |
| Confocal microscope | Any fast scanning confocal should be sufficient | ||
| 20X dry, and 40X or 63X oil immersion lenses | any | For imaging tissue, cellular, and subcellular features | |
| Immersion oil (nonfluorescent) | |||
| Stereomicroscope | any | For fly manipulation |
References
- Raff, J. W., Jeffers, K., Huang, J. Y. The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time. J. Cell Biol. 157, 1139-1149 (2002).
- Stramer, B., et al. Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration. J. Cell Biol. 168, 567-573 (2005).
- Clark, I. B., Jarman, A. P., Finnegan, D. J. Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration. BMC Dev. Biol. 7, 52 (2007).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nat. Protoc. 2, 3285-3298 (2007).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol. Biol. Cell. 16, 5127-5140 (2005).
- Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways. Science. 332, 354-358 (2011).
- Gho, M., Bellaiche, Y., Schweisguth, F. Revisiting the Drosophila microchaete lineage: a novel intrinsically asymmetric cell division generates a glial cell. Development. 126, 3573-3584 (1999).
- Ninov, N., Martin-Blanco, E. Live imaging of epidermal morphogenesis during the development of the adult abdominal epidermis of Drosophila. Nat. Protoc. 2, 3074-3080 (2007).
- Edgar, B. A., Lehner, C. F. Developmental control of cell cycle regulators: a fly's perspective. Science. 274, 1646-1652 (1996).
- Wirtz, R. A., Semey, H. G. The Drosophila kitchen: equipment, media preparation, and supplies. Drosophila Information Service. 58, 176-180 (1982).
- Boulina, M., Samarajeewa, H., Baker, J. D., Kim, M. D., Chiba, A. Live imaging of multicolor-labeled cells in Drosophila. Development. 140, 1605-1613 (2013).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M.
- Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. 2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy. Microsc. Res. Tech. 70, 1-9 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Meyer, E. J., Ikmi, A., Gibson, M. C. Interkinetic nuclear migration is a broadly conserved feature of cell division in pseudostratified epithelia. Curr. Biol. 21, 485-491 (2011).
- Sauer, F. C.
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
