Summary
Bu kağıdı doğrudan puparium aracılığıyla görüntü hücre davranışı hızlı bir tarama konfokal mikroskop kullanımını gösterir. Sağlam pupa davayı bırakarak, bu yöntem doğrudan çalışma zordur Drosophila bir gelişme aşamasında gözlem ve dinamik hücre süreçlerinin ölçülmesini sağlar.
Abstract
Hücre ve gelişim biyolojisi için bir model olarak Drosophila uzun süredir devam eden kullanım araçları bir dizi vermiştir. Birlikte, bu teknikler metodolojik açılardan çeşitli hücre ve gelişim biyolojisi analizini sağlamıştır. Canlı görüntüleme, hücre bölünmesi ya da hücre hareketi gibi dinamik hücre süreçlerini, gözlem için gelişmekte olan bir yöntemdir. Canlı görüntüleme kullanarak yerinde mitoz gözlemlemek için gerekli oldu uncharacterized farazi hücre döngüsü proteinleri mutasyonlar izole olması. Drosophila en canlı görüntüleme çalışmaları nedeniyle küçük boyutu ve optik netlik manipülasyon ve gözlem için erişilebilir embriyonik aşamalarında odaklanmıştır. Bu boşluk fazlarının biri ya da her ikisi yoksun olmasıyla Ancak, bu aşamada, hücre döngüsü sıra dışıdır. Buna karşılık, Drosophila pupa kanadının hücreleri, tipik bir hücre döngüsü ve pupa gelişme, yaklaşık 20 saat süren hızlı bir mitoz bir süre geçer. Bu i kolaydentify ve yerinde mitoz yakalamak için uygun sahnenin pupa izole. Montaj sağlam pupa deneyleri, hücre ve hayvan canlılığı üzerinde minimum etki ile birkaç saat çalışmasına izin veren, görüntüleme sırasında tractability ve dayanıklılık en iyi kombinasyonu sağladı. Yöntem olarak küçük, ya da daha küçük, kromozom sinek gibi özellikleri gözlem sağlar. Mikroskop ayarları ve montaj detayları ayarlanması, preparasyonun dahili zar komşu hücrelerin dinamiklerini ve bu tübülin gibi flüoresan etiketli proteinlerin görselleştirmek bırakıldı. Bu yöntem test edilen tüm floresan proteinleri için çalışıyor ve zaman ölçekleri çeşitli üzerinden Mikronaltı ölçek özelliklerini yakalayabilir. Geleneksel bir konfokal mikroskop ile pupa dış 20 um ile sınırlı olsa da, in vivo pupa dokularda protein ve dinamikleri hücresel gözlem için bu yaklaşım, bu hücre ve dokularda gelişimsel biyoloji çalışmaya genel olarak yararlı olabilir.
Introduction
Sirke sineği, Drosophila melanogaster. Drosophila araştırma anlatım, demonte ve mutasyonunu içeren gen manipülasyonu sofistike formları sağlar genetik deney zengin bir geçmişe sahiptir biyoloji birçok yönleriyle inceleyerek için iyi kurulmuş bir modeldir. Floresan proteini etiket gelişiyle, bu repertuar yaşayan hayvanlar hücre ve proteinlerin çalışmaları kapsayacak şekilde genişletti. Sinek embriyo in vivo 1-3 derin, yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlayan küçük ve optik net gibi çalışmalar için mükemmel bir sistemdir. Sinek gelişme diğer aşamaları anestezi 4, diseksiyon ve kısa vadeli kültürünü 5,6 veya 7,8 görüntüleme için manikür pencerelerin oluşturulmasına gerektiren, daha az uysal olduğu kanıtlanmıştır. Bu manipülasyonlar, genellikle uzun vadede hayvan gelişimi uzlaşma ya da kısa süreler için görüntüleme sınırı şekillerde hayvan etkiler.
En embriyonik hücre siklusu kesiliyor yana hücre siklus düzenleyicileri benzer genlerinde mutasyon roman incelemek için ent "> bu. hücre döngüsünün zamanlaması ve sadakat incelemek için uygun bir hazırlık bulmak için gerekli olan (SM veya S-G2-M) ve çalışma kapsamında mutantlar ileriki evrelere kadar, bu pupa aşaması dokularda hücre döngüsünü gözlemlemek için önemli kusurları görünmüyor. pupa epitel hücreleri daha tipik bir G1-S-G2-M hücre döngüsü ve bu aşamada pupa olan var kas hareketleri 9 yeteneğine sahip değildir. manipülasyonlar için başlangıç noktası pupa davanın belirgin donukluk rağmen Histone2AV-GFP ifade bozulmamış bütün pupa. dahil, bu bozulmamış hazırlık vivo görüntüleme uzun vadede mükemmel olduğunu kanıtladı. Bu teknik basittir lisans araştırmacılar rutin Drosophila hücre ve gelişim biyolojisi yönlerini incelemek için kullanabilirsiniz ve henüz çözünürlük mikrometre ölçekli özellikleri ayrımcılığı sağlayacak kadar gayet yeterli. Bu yöntemle, saat, dakika veya saniye içinde olayların gözlemleri sadece zaman serisi parametrelerini ayarlayarak mümkündür. Mavi, yeşil, sarı, turuncu ve kırmızı floresan proteinleri, veya bunların kombinasyonları kullanılarak Videolar yapılmıştır. Önemli olarak, eğer bakım hatta uzun süreli görüntüleme hayvanların geliştirme veya canlılığı üzerinde bir etkisi yoktur, lazer yoğunluğu en aza indirmek için alınır.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Çalışma Fly
- Oda sıcaklığında 10 standart mısır unu-agar-pekmez-maya ortamda sinekler koruyun.
- Haçlar için, eclosion 6 saat içinde bakireler izole. Istenen genotip erkeklere geçtikten sonra, değişim her 3-4 günde yeni şişelere uçar.
Not: Bu deneyler için, Gal4 hat A9 kanat transgenlerin anlatımını sürmek için kullanılmıştır. Fly stokları Bloomington stok merkezinden elde edilebilir. Bu deneylerde kullanılan Hisse A9-Gal4 (Bl # 8761), His2Av-GFP (Bl # 5941), SCO / cyo HsCre (Bl # 1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl # 25773), 11, lollibow içerir.
2. Seçimi ve Pupa ve montajı
- Sahne pupa ya beyaz prepupa (RES) olarak toplanması ve bunların uygun yaşa gelinceye kadar 25 ° C'de tutarak veya morfolojik kriterlere 12. kullanarak.
- Hücre bölünmeleri, son zamanlarda baş tersine çevrilmesi uğramıştır seçeneğini pupa gözlemlemek için.Bu zaman kadar sadece eclosion (en> 96 saat) önce, pupa hareketsiz uzun time-lapse gözlem izin vardır.
- Önce su fırça üzerine onları dürterek yavaşça yapışkan gevşetmek ve izin için bir dakika bekleyen, su ile nemlendirilmiş bir fırça ile onlara dokunarak flakonlarından pupa çıkarın.
- Yavaşça tükürük bezi yapıştırıcı ve gıda parçacıkları uzaklaştırmak için su içinde bir boya fırçası ile dürtüyordu seçilir pupa yıkayın.
- Bir lamel altındaki (sayı 1 ½ lamelleri) ile bir 25 mm Petri kabı temiz pupa aktarın.
- Ilgilenilen doku lamel en yakın olan, böylece bir destek olarak modelleme kil ya da diş balmumu ya da ince şeritler kullanılarak, pupa monte edin.
Not: Burada anlatılan çalışmalarda, pupa kanatlar, bacaklar, karın histoblasts veya dorsal notum gözlenmiştir. Uygulamada, pupa durumda yüzeyinin 20 mikron olan bir doku gözlemlenebilir. - Orient pupa dikkatlice böylece tissuilgi e cam lamel yüzeyine paralel.
- Pupa monte edildikten sonra, pupa ve lamel arasındaki boşluğa tiodietilen glikol (TDG) ince bir tabaka aktarmak için bir fırça kullanın.
Not: TDG, yüzeye dağılımını azaltır yağın kırılma indeksi ile eşleşir ve oksijen doku 13 nüfuz sağlar. Bu hücre davranışlar hızlı durmasına neden olan, oksijenin dokulara mahrum eğilimi gibi yağlar kullanılması tavsiye edilmez.
3. Görüntüleme
Not: görüntüleme için, konfokal mikroskop confocality pupa durumda yoğun aydınlatma neden obscuring arka çoğunu çıkarır gibi önemli olması muhtemeldir.
- Pupa gelişimi ve canlılığı üzerindeki aydınlatma etkisini en aza indirmek için konfokal ayarlarını. Bunu yapmak için, uyarma yoğunluğu ve toplama duyarlılığı arasında bir denge. Görüntüleme wi için tipik bir yapılandırmaLeica SP5 rezonans tarayıcı (8,000 Hz),% 2 olarak ayarlanmış lazer gücü (% 20 güç,% 10 geçirgenlik), 120 um iğne deliği grubu, ve hat 8 için kullanılan kurulu ortalama th. Ayarlar deney koşullarına bağlı olarak değişecektir.
Not: ince ölçek onlar odak derinliğini sınırlamak olsa da başarılı, bu yöntem kullanılmıştır 40X ve 63X Petrol daldırma lens (0,1 mm çalışma mesafesi) bulunmaktadır gidermek için.
4. Analiz
Çerçeveleri analiz etmek için, z-yığınları ya da film, izleme, ölçme ve sunum 14 için dosyaları değiştirmek için etkili araçlar vardır FIJI, veri dosyalarını içe. Örneğin mitoz tamamlamak için zamanı telofaz için profazın bir hücreyi izlerken kare ilerlemek için örnekleme aralığı ve çok boyutlu görüntü tarayıcı kullanılarak ölçüldü. x-, y-ve z-boyutları ölçme aracı kullanılarak ölçülebilir. Yazılım ve kullanımı hakkında ayrıntılı talimatlar içinbkz: http://fiji.sc/Fiji.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gibi gelişmekte olan Drosophila göz, omurgalı ya da gelişmekte olan merkezi sinir sistemi içinde, ventriküler tabaka olarak yalancı epitel hücreler, nükleer hareketleri geçmesi, hücre döngüsü ile zaman içinde, interkinetic nükleer göç adlandırılır. Çekirdekler bazal yüzeyinde veya yakınında ve çekirdekler apikal yüzeye 15,16 ulaştığınızda hücrelerin mitoz girdiğinde DNA replikasyonu oluşur. Pupa kanat hücreler kafa eversiyonu sonra ilk birkaç saat boyunca bir hızla bölünen tek tabakalı epitel oluşturur. Veri bölümleri 1 dakika aralıklarla her 2 um alarak, erken bir pupa kanattaki xyzt modunda toplanmıştır. Elde edilen 3D filmler mitoz sadece tepe yüzey (Şekil 1A) görüldü. Daha bazal yerle alındığı Bölümler mitoz emaresi (Şekil 1 B) gösterdi, ama yeni bölünmüş çekirdekleri tepe yüzeyinden dönen nükleer hareketleri oluştu.
Şekil 1. Çekirdekler bölmek için epitel üstüne gitmek. Temsilcisi bölümleri His2AvGFP ifade eden vahşi tip Drosophila pupa kanadının bir xyzt konfokal görüntü. En üstteki bölme (A) çekirdekler, hücre döngüsünün farklı aşamalarında görülebilir. Çekirdekler telofaz (ok uçları) olduğu gibi metafaz (oklar) çekirdekler bu mikrografta bol miktarda bulunmaktadır. DNA replikasyon durumunun göstergesidir nükleer çapında değişkenlik olsa bölüm (B) alt düzlemlerde mitoz hiçbir kanıt fark edilmektedir. Bar 10 mikron Ölçeğe. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bölünen hücrelerin özellikleri, His2AvGFP ifade eden hücrelerin konfokal analizi ile Drosophila canlı pupa kanadında mitoz gözlemlemek için basit bir hazırlama gerekli geliştirme, görselleştirmek ölçmek ve ölçmek için. Bu yöntem, pupa kanadında hücre döngüsü onlar mitoz girmek epitelin apikal yüzeyine o çekirdekler hareket yalancı epiteliada döngüleri hücre güçlü benzerlikler taşıdığını belgelemek için kullanılmıştır. Telofaz ardından, çekirdekler geri epitel tabakasının içine bırakın. Dolayısıyla, bu tek tabaka, görünüşe tabakalandırılmamış epiteli, gösterinin hücreleri nükleer göç interkinetic sınırlıdır.
Kamuya açık hisse senedi ve Drosophila 11. 17 tipi Canlı görüntülemeyi Brainbow için oluşturulan hatları görüntüleme, bu tekniği diğer biyolojik olayların çalışmaya genellenebilir olduğunu göstermiştir. Burada anlatılan teknik, vide üretiminde kullanılandakika ila 10 saat arasında değişen kere os. Bir dereceye kadar, mikroskop parametreler deney ile değişir. Örneğin, time-lapse görüntüleme örnekleme oranı gözlem altında biyolojik olayın niteliğine uygun olmalıdır: genellikle her dakika uygun görüntülerin bir yığın toplama, telofaz için profazın yaklaşık 12 dakika sürer hücre bölünmeleri, gözlem için. Aynı hücrelerde filopodia davranışlarını gözlemlemek için, bölümler ya da yığınlar daha ince (3 sn) aralıklarla toplanan gerekir.
Tarif edilen koşullar altında, eclosing yetişkin hayatta kalma ya da morfolojisi üzerinde hiçbir etki ne olursa olsun, gözlem dönemi gözlenmiştir. Floresan işaretçi düşük yoğunlukta olduğunda, lazer gücü tipik olarak arttırılmıştır. Bu durumlarda, filmin süresini kısaltarak veya bölümleri ya da z-yığınları, minimize maruz kalma sayısını azaltarak. Diğer deneyler için kontrol olarak, 5 dakika boyunca maksimum yoğunluğu için doku maruz hiçbir etkili olduyetişkin morfolojisi veya hayatta t. Görselleştirme, kırmızı, yeşil, sarı, turuncu ve mavi farklı proteinler çeşitli etiketli floresan proteinleri, membran lokalize ve / veya sitoplazmaya doldurma kapsayacak şekilde genişletildi. Alt-mikron aralığındaki özellikler saat saniye zaman ölçeğinde gözlenmiştir. Bu yöntem, (hazırlanması) vahşi tip ve mutantlar mitoz zamanlama ve aslına izlemek ve ölçmek için yaygın şekilde kullanılmaktadır.
Drosophila geliştirme aşaması pupa yetişkin bir şekilde larva gövdenin platform üzerinde geliştirene kadar larva bir şekilde esas olarak elimine edildiği dikkate değer plastisite bir dönemdir. Zengin geçmişine rağmen, metamorfoz çalışma metodolojik engel olmuştur. Örneğin, temel işlemler metamorfoz çalışma için doğrudan gözlem kullanımı sırasında yeniden hücrelere ve dokulara in vivo erişim güvenilir olmaması ile sınırlandırılmıştır. ŞaşırtıcıBurada sunulan basit bir yaklaşım Drosophila gelişme bu şifreli döneme erişim sağlar. Yaklaşım lisans kolayca öğrenmek ve doku, hücre ve hücre altı örgütün gözlemlerini izin verecek şekilde ve yeterince sağlam kullanabileceğiniz kadar basittir. Bu deneyler için kullanılan mikroskop derin doku görüntüleme için optimize edilir ve bu nedenle büyük ölçüde gözlemler pupa dış 20 um kısıtlanır. Bu tür çoklu foton mikroskopi gibi derin doku penetrasyonu, izin teknikleri, görüntüleme çok daha fazla derinlik sağlamak ve metamorfoz altında yatan iç yapısal düzenlemelerin, çalışma izin vermek olasıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar entelektüel desteği, maddi destek ve hisse senetleri için Akira Chiba kabul etmek istiyoruz. Yorumlar için Julia Dallman teşekkürler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly stuff fly pad | Genesee Scientific | 59-114 | for fly anesthetization |
| CO2 gas | Airgas South | CD50 | For fly anesthetization |
| Regulator | Airgas South | CO2 regulator | |
| Fly vials | Genesee Scientific | 32-113RLBF | Fly culture |
| Drosophila lines:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773) | Bloomington Stock Center | ||
| Glass bottom dishes #1 1/2 | WillCo Wells BV | For microscopy | |
| Thiodiethylene Glycol | Fluka | 88559 | mountant |
| Modeling clay | art supply store | Support to position pupae against | |
| Paintbrushes | art supply store | To manipulate flies | |
| Fine Forceps, Inox #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| computer | any | 8 Gb RAM for image/movie analysis | |
| Fiji software | Free ware http://fiji.sc/Fiji | Image analysis software | |
| Confocal microscope | Any fast scanning confocal should be sufficient | ||
| 20X dry, and 40X or 63X oil immersion lenses | any | For imaging tissue, cellular, and subcellular features | |
| Immersion oil (nonfluorescent) | |||
| Stereomicroscope | any | For fly manipulation |
References
- Raff, J. W., Jeffers, K., Huang, J. Y. The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time. J. Cell Biol. 157, 1139-1149 (2002).
- Stramer, B., et al. Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration. J. Cell Biol. 168, 567-573 (2005).
- Clark, I. B., Jarman, A. P., Finnegan, D. J. Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration. BMC Dev. Biol. 7, 52 (2007).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nat. Protoc. 2, 3285-3298 (2007).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol. Biol. Cell. 16, 5127-5140 (2005).
- Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways. Science. 332, 354-358 (2011).
- Gho, M., Bellaiche, Y., Schweisguth, F. Revisiting the Drosophila microchaete lineage: a novel intrinsically asymmetric cell division generates a glial cell. Development. 126, 3573-3584 (1999).
- Ninov, N., Martin-Blanco, E. Live imaging of epidermal morphogenesis during the development of the adult abdominal epidermis of Drosophila. Nat. Protoc. 2, 3074-3080 (2007).
- Edgar, B. A., Lehner, C. F. Developmental control of cell cycle regulators: a fly's perspective. Science. 274, 1646-1652 (1996).
- Wirtz, R. A., Semey, H. G. The Drosophila kitchen: equipment, media preparation, and supplies. Drosophila Information Service. 58, 176-180 (1982).
- Boulina, M., Samarajeewa, H., Baker, J. D., Kim, M. D., Chiba, A. Live imaging of multicolor-labeled cells in Drosophila. Development. 140, 1605-1613 (2013).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M.
- Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. 2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy. Microsc. Res. Tech. 70, 1-9 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Meyer, E. J., Ikmi, A., Gibson, M. C. Interkinetic nuclear migration is a broadly conserved feature of cell division in pseudostratified epithelia. Curr. Biol. 21, 485-491 (2011).
- Sauer, F. C.
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
