Summary
Dieses Papier zeigt die Verwendung eines schnellen konfokalen Mikroskop, um Bildzelle Verhalten direkt durch die Puppenhülle. Nach dem Verlassen der Puppenhülle intakt ist, erlaubt dieses Verfahren die Beobachtung und Messung von dynamischen Zellprozesse im Stadium der Drosophila-Entwicklung, die schwer direkt zu studieren.
Abstract
Der langjährige Einsatz von Drosophila als Modell für Zell-und Entwicklungsbiologie hat eine Reihe von Tools ergab. Gemeinsam haben diese Techniken Analyse von Zell-und Entwicklungsbiologie aus einer Vielzahl von methodischen Blickwinkeln ermöglicht. Echtzeit-Bildgebung ist eine neue Methode zur Beobachtung dynamischer Zellprozesse, wie Zellteilung oder Zellbeweglichkeit. Nachdem in uncharacterized mutmaßlichen Zellzyklus-Proteine wurde es wichtig, Mitose in situ zu beobachten mit Live-Aufnahmen isoliert Mutationen. Die meisten Live-Imaging-Studien in Drosophila haben sich auf die embryonalen Stadien, die wegen ihrer geringen Größe und optische Klarheit zugänglich Manipulation und Beobachtung sind konzentriert. In diesen Phasen des Zellzyklus wird jedoch ungewöhnlich, dass es eine oder beide der Spalt Phasen fehlt. Im Gegensatz dazu haben Zellen des Puppen Flügel von Drosophila eine typische Zellzyklus und eine Zeit des schnellen Mitose sich über etwa 20 Stunden der Puppenentwicklung zu unterziehen. Es ist leicht zu iekb.html und zu isolieren, Puppen der geeigneten Stadium der Mitose in situ zu fangen. Montage intakt Puppen, sofern die beste Kombination aus Handhabbarkeit und Haltbarkeit während der Bildgebung, so dass Experimente für mehrere Stunden mit minimalen Auswirkungen auf Zell-und Tier Rentabilität führen. Das Verfahren ermöglicht die Beobachtung der Merkmale so klein wie oder kleiner als, fly-Chromosomen. Anpassung der Einstellungen des Mikroskops und die Details der Montage erlaubt Verlängerung der Herstellung von Membran Dynamik benachbarter Zellen und fluoreszenzmarkierte Proteine, wie Tubulin visualisieren. Diese Methode funktioniert für alle getesteten fluoreszierende Proteine und Submikrometerbereich Funktionen über eine Vielzahl von Zeitskalen zu erfassen. Während an der äußeren 20 um der Puppe mit einem herkömmlichen konfokalen Mikroskop beschränkt ist, kann dieser Ansatz zur Beobachtung Protein und Zelldynamik im Puppen Geweben in vivo allgemein bei der Untersuchung von Zell-und Entwicklungsbiologie in diesen Geweben nützlich sein.
Introduction
Der Essig, Drosophila melanogaster, ist ein gut etabliertes Modell für die Untersuchung viele Aspekte der Biologie. Drosophila Forschung hat eine reiche Geschichte von genetischen Experimenten, die anspruchsvolle Formen der Genmanipulation einschließlich der Expression, Knockdown und Mutation ermöglicht. Mit dem Aufkommen des fluoreszierenden Proteins Etiketten, hat dieses Repertoire erweitert, um Untersuchungen von Zellen und Proteinen in lebenden Tieren umfassen. Die Fliegenembryo ist ein ausgezeichnetes System für solche Studien, wie sie ist klein und optisch klar so tief, hochauflösende Bildgebung in vivo 03.01. Andere Stadien der Fliege Entwicklung haben sich als weniger gefügig, Betäubung 4, Dissektion und Kurzzeitkultur 5,6, oder die Erstellung von Fenstern in der Kutikula für die Bildgebung 7,8 erfordern. Diese Manipulationen in der Regel Kompromisse Tier Entwicklung auf lange Sicht beeinflussen oder das Tier in einer Weise, die Bildgebung, um kurze Zeiträume zu begrenzen.
ent "> Um neue Mutationen in Genen, die Zellzyklusregulatoren ähneln studieren, war es wichtig, eine angemessene Vorbereitung auf das Timing und die Treue des Zellzyklus zu studieren finden. Da die meisten embryonalen Zellzyklen verkürzt sind (SM oder S-G2-M) und die Mutanten unter-Studie nicht zeigen, bis Mängel späteren Stadien, war es wichtig, den Zellzyklus in Puppenstadium Gewebe zu beobachten. Epithelzellen in der Puppe haben eine typische G1-S-G2-M Zellzyklus und Puppen dieser Stufe sind nicht in der Lage Muskelbewegungen 9. Der Anfangspunkt für Manipulationen enthalten intakte ganze Puppen-GFP exprimieren Histone2AV. Trotz der scheinbaren Opazität des Puppenhülle erwies sich diese intakt Zubereitung hervorragende langfristige in-vivo-Bildgebung zu sein. Diese Technik ist einfach genug, dass Bachelor-Forscher nutzen es regelmäßig, um Aspekte der Zell-und Entwicklungsbiologie in Drosophila zu untersuchen und doch ist die Auflösung fein genug, um die Diskriminierung von Mikrometerskala Funktionen ermöglichen. Mit diesem Verfahren sind Beobachtungen von Veranstaltungen über Stunden, Minuten oder Sekunden einfach durch Einstellen Zeitreihen-Parameter möglich. Videos mit blau, grün, gelb, orange und rot fluoreszierende Proteine oder Kombinationen von diesen, durchgeführt wurden. Wichtig ist, dass, wenn darauf geachtet werden, um die Laserintensität zu minimieren, auch langfristige Bildgebung hat keine Wirkung auf die Entwicklung oder die Lebensfähigkeit der Tiere.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fly Arbeits
- Pflegen Fliegen auf Standard-Maismehl-Agar-Melasse-Hefe-Medium bei Raumtemperatur 10.
- Für Kreuze, zu isolieren Jungfrauen innerhalb von 6 h Schlüpfen. Nach der Überfahrt auf die Männer des gewünschten Genotyp, fliegt Wechsel zu neuen Fläschchen alle 3-4 Tage.
Hinweis: Für diese Experimente Gal4 Linie A9 wurde verwendet, um die Expression der Transgene in den Flügel zu fahren. Fly-Aktien aus dem Aktien Zentrum in Bloomington erhalten werden. Aktien in diesen Experimenten verwendet werden, umfassen A9-Gal4 (Bl # 8761), His2Av-GFP (Bl # 5941), Sco / Cyo HsCre (Bl # 1092), FH-ChRFP-Tub (Bl # 25773), 11 lollibow.
2. Auswahl und Montage der Puppen
- Bühnen Puppen entweder als weiße prepupae (WPP) Sammeln sie und halten sie bei 25 ° C, bis sie das entsprechende Alter erreichen oder durch Verwendung von morphologischen Kriterien 12.
- Um Zellteilungen, wählen Puppe, die vor kurzem Kopf Eversion unterzogen wurden, zu beobachten.Von dieser Zeit bis kurz vor dem Schlüpfen (bei> 96 Stunden), sind Puppen unbeweglich und erhöht so die Zeitraffer-Beobachtung.
- Entfernen Puppen aus den Fläschchen, die sie zuerst berühren mit einem Pinsel mit Wasser befeuchtet, wartet auf eine Minute, damit das Wasser, um den Klebstoff vorsichtig lockern und dann stupste sie auf den Pinsel.
- Vorsichtig waschen ausgewählt Puppen durch Stoßen sie mit einem Pinsel in Wasser, um die Speicheldrüse Klebstoff und Speisereste zu entfernen.
- Übertragen sauber Puppen auf ein 25 mm Petrischale mit einem Deckglas unten (Nummer 1 ½ Deckgläser).
- Mit dünnen Streifen von entweder Knete oder Dentalwachs als Träger montieren Puppen so dass das Gewebe in der Umgebung ist in der Nähe des Deckglases.
Hinweis: Bei den hier beschriebenen Untersuchungen, Puppen Flügel, Beine, Bauch-oder Rücken histoblasts Notum beobachtet. In der Praxis ist jedes Gewebe innerhalb von 20 um die Oberfläche der Puppenhülle zu beobachten. - Orient Puppen sorgfältig, so dass die tissue von Interesse ist parallel zu der Deckglas Oberfläche.
- Sobald Puppen montiert sind, verwenden Sie einen Pinsel, um eine dünne Schicht Thiodiethylenglykol (TDG) in den Raum zwischen der Puppe und dem Deckglas übertragen.
Hinweis: TDG reduziert die Oberflächenstreuung, dem Brechungsindex von Öl und Sauerstoff ermöglicht, um das Gewebe 13 zu durchdringen. Verwendung von Ölen ist nicht zu empfehlen, da sie dazu neigen, die Gewebe mit Sauerstoff zu entziehen, was eine schnelle Einstellung der Zellverhalten.
3. Imaging
Hinweis: Für die Bildgebung, dürfte wesentlich zu sein als die Konfokalität entfernt die meisten der Verdunkelung Hintergrund durch intensive Beleuchtung der Puppenhülle verursacht ein konfokales Mikroskop.
- Anpassen der Einstellungen auf der konfokalen, um die Auswirkungen der Beleuchtung auf Puppenentwicklung und Lebensfähigkeit zu minimieren. Um dies zu tun, ein Gleichgewicht zwischen der Intensität der Anregung und der Empfindlichkeit der Kollektion. Eine typische Konfiguration für die Bildgebung witen der Leica SP5 verwendet die Resonanzscanner (8000 Hz), Laserleistung auf 2% (10% Lichtdurchlässigkeit von 20% Leistung), Lochkamera-Set bis 120 um und Zeilenmittelung auf 8 gesetzt. Einstellungen werden abhängig von experimentellen Bedingungen variieren.
Hinweis: Um zu beheben Feinwaage verfügt 40X und 63X Ölimmersionslinsen (0,1 mm Arbeitsabstand) wurden ebenfalls erfolgreich in diesem Verfahren verwendet, obwohl sie die Schärfentiefe zu begrenzen.
4. Analyse
Um Rahmen zu analysieren, z-Stapel oder Filme importieren die Datendateien auf Fidschi, die effektive Werkzeuge für die Anzeige, Messung und Ändern von Dateien für die Präsentation 14 hat. Zum Beispiel Zeit, um die Mitose zu vervollständigen wurde mit der Sampling-Intervall und multidimensionale Bild-Browser, um durch Rahmen Schritt, während Sie eine Zelle aus, um Prophase Telophase gemessen. x-, y-und z-Abmessungen mit dem Messinstrument gemessen werden. Detaillierte Anweisungen auf der Software und ihre Verwendungsiehe: http://fiji.sc/Fiji.
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Representative Results
Zellen in mehrreihigen Epithelien, wie die Entwicklung von Drosophila Auge oder der ventrikulären Schicht des Entwicklungswirbel zentralen Nervensystems, zu unterziehen Atombewegungen bezeichnet interkinetic Kern Migration in der Zeit mit dem Zellzyklus. DNA-Replikation auftritt, wenn Kerne sind an oder nahe der Basisfläche und Zellen Mitose eintreten, wenn die Kerne der apikalen Oberfläche 15,16 erreichen. Die Puppen Flügel Zellen bilden eine sich schnell teilenden Monoschicht Epithel während der ersten Stunden nach der Kopfeversion. Die Daten wurden in xyzt Modus von einem frühen Puppen Flügel gesammelt, wobei alle Abschnitte 2 um 1-Minuten-Intervallen. In der resultierenden Filme 3D Mitose wurde nur an der apikalen Oberfläche (Fig. 1A) gesehen. Abschnitte bei mehreren Basisstellen entnommen wurden, zeigten keine Anzeichen von Mitose (1B), aber Atombewegungen stattgefunden, da die neu aufgeteilt Kerne von der apikalen Oberfläche zurück.
Fig. 1 ist. Kerne bewegen, um die Spitze des Epithels zu teilen. Vertreter Abschnitte aus einer xyzt konfokales Bild von Wildtyp-exprimierenden Drosophila Puppen Flügel His2AvGFP. An den obersten Abschnitten (A) Kerne können in verschiedenen Phasen des Zellzyklus zu erkennen. Die Zellkerne in der Metaphase (Pfeile) sind reichlich in diesem Schliffbild wie in der Telophase (Pfeilspitzen) sind Kerne. Bei niedrigeren Schnittebenen (B) keinen Beweis, der Mitose ist offensichtlich, aber es gibt Unterschiede in der Kerndurchmesser, der, die den Zustand der DNA-Replikation ist. Maßstab 10 um. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
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Discussion
Um sichtbar zu machen, zu messen und zu quantifizieren Merkmale des teilenden Zellen, erforderliche Entwicklung eines einfachen Vorbereitung für die Beobachtung der Mitose in der lebenden Puppen Flügel der Drosophila mittels konfokaler Analyse His2AvGFP exprimierenden Zellen. Diese Methode wurde verwendet, um zu dokumentieren, dass der Zellzyklus in der Puppen Flügel trägt starke Ähnlichkeiten mit Zyklen in mehrreihigen Epithelien in dieser Kerne Umzug in die apikale Oberfläche des Epithels, wo sie Mitose Zelle eingeben. Nach Telophase, Kerne fallen zurück in die Epithelschicht. Somit sind die Zellen dieser Monolage, offenbar ungeschichtete Epithel, Show interkinetic Kernwanderung beschränkt.
Imaging von öffentlich verfügbaren Bestände und Leitungen für Brainbow 17 Art Live-Bildgebung in Drosophila 11 erstellt wurde, gezeigt, dass diese Technik ist verallgemeinerbar auf die Untersuchung von anderen biologischen Phänomene. Das hier beschriebene Verfahren wurde bei der Herstellung verwendet videos über Zeiten im Bereich von Minuten bis 10 Stunden. Bis zu einem gewissen Grad variieren die Mikroskop-Parameter mit dem Experiment. Zum Beispiel muss die Abtastrate der Zeitraffer-Bildgebung der Art der biologischen Phänomen unter Beobachtung entsprechen: Zellteilungen für die Beobachtung, die in der Regel dauert etwa 12 min von der Prophase bis Telophase, sammeln einen Stapel von Bildern pro Minute geeignet ist. Um das Verhalten von Filopodien in den gleichen Zellen zu beobachten, müssen Teile oder Stapel an feiner (3 sec) Abständen gesammelt werden.
Unter den beschriebenen Bedingungen wurde kein Effekt auf das Überleben oder Morphologie schlüpfende Erwachsene unabhängig von der Beobachtungszeitraum beobachtet. Wenn die Fluoreszenzmarker ist von geringer Menge, wurde der Laserleistung in der Regel erhöht. In diesen Situationen, die Verkürzung der Dauer des Films oder Verringerung der Anzahl der Teile oder Z-Stapel, minimiert Belichtung. In Steuerungen für andere Experimente, Freilegung der Gewebe, um maximale Intensität für 5 Minuten hatte keine effektivet auf die Morphologie oder das Überleben des Erwachsenen. Visualisierung erweitert rot, grün, gelb, orange und blau fluoreszierende Proteine zu einer Vielzahl von verschiedenen Proteinen markiert, an der Membran lokalisiert ist, und / oder Füllen des Zytoplasmas zu schließen. Merkmale im Submikrometerbereich wurden über Zeitskalen von Sekunden bis Stunden beobachtet. Diese Methode wurde intensiv genutzt, um in Wildtyp-und Mutanten (in Vorbereitung) beobachten und messen den Zeitpunkt und die Treue der Mitose.
Puppenstadium der Drosophila-Entwicklung ist ein Zeitraum von bemerkenswerten Plastizität in dem die Larvenform im wesentlichen eliminiert, während der adulten Form entwickelt sich auf dem Gerüst der Larvenkörper. Trotz einer reichen Geschichte, hat die Untersuchung der Metamorphose methodisch erschwert. Zum Beispiel hat sich der Einsatz der direkten Beobachtung, um die zugrunde liegenden Prozesse zu studieren Metamorphose durch das Fehlen von In-vivo-Zugang zu den Zellen und Gewebe während des Umbaus begrenzt. Die überraschendeinfach hier vorgestellte Ansatz ermöglicht den Zugang zu dieser kryptischen Periode der Entwicklung in Drosophila. Der Ansatz ist einfach genug, dass Studenten leicht lernen können, und verwenden Sie es und robust genug, um Beobachtungen von Gewebe, Zelle und subzelluläre Organisation zu ermöglichen. Die für diese Experimente verwendete Mikroskop ist nicht für tiefe Gewebe-Bildgebung optimiert und so unsere Beobachtungen sind weitgehend auf die Außen 20 um der Puppe eingeschränkt. Es ist wahrscheinlich, dass die Techniken, die tieferen Gewebepenetration, wie Multi-Photonen-Mikroskopie zu ermöglichen, wäre eine viel größere Tiefe der Bildgebung erlauben und Untersuchung der inneren strukturellen Umlagerungen Metamorphose zugrunde liegen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren möchten sich Akira Chiba für intellektuelle Unterstützung, materielle Unterstützung und Aktien anerkennen. Dank Julia Dallmann für Kommentare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly stuff fly pad | Genesee Scientific | 59-114 | for fly anesthetization |
| CO2 gas | Airgas South | CD50 | For fly anesthetization |
| Regulator | Airgas South | CO2 regulator | |
| Fly vials | Genesee Scientific | 32-113RLBF | Fly culture |
| Drosophila lines:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773) | Bloomington Stock Center | ||
| Glass bottom dishes #1 1/2 | WillCo Wells BV | For microscopy | |
| Thiodiethylene Glycol | Fluka | 88559 | mountant |
| Modeling clay | art supply store | Support to position pupae against | |
| Paintbrushes | art supply store | To manipulate flies | |
| Fine Forceps, Inox #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| computer | any | 8 Gb RAM for image/movie analysis | |
| Fiji software | Free ware http://fiji.sc/Fiji | Image analysis software | |
| Confocal microscope | Any fast scanning confocal should be sufficient | ||
| 20X dry, and 40X or 63X oil immersion lenses | any | For imaging tissue, cellular, and subcellular features | |
| Immersion oil (nonfluorescent) | |||
| Stereomicroscope | any | For fly manipulation |
References
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