Summary
इस पत्र सीधे puparium के माध्यम से छवि सेल व्यवहार करने के लिए एक तेजी से स्कैनिंग confocal खुर्दबीन का उपयोग दर्शाता है. बरकरार पोटा संबंधी मामले छोड़ने करके, इस विधि सीधे अध्ययन करने के लिए मुश्किल है कि ड्रोसोफिला विकास के एक चरण में अवलोकन और गतिशील सेल प्रक्रियाओं की माप की अनुमति देता है.
Abstract
सेल और विकासात्मक जीव विज्ञान के लिए एक मॉडल के रूप में ड्रोसोफिला की लम्बे समय से उपयोग उपकरणों की एक सरणी प्राप्त हुए है. साथ में, इन तकनीकों पद्धति कोण की एक किस्म से सेल और विकासात्मक जीव विज्ञान के विश्लेषण के लिए सक्षम है. लाइव इमेजिंग ऐसी कोशिका विभाजन या सेल गतिशीलता के रूप में गतिशील सेल प्रक्रियाओं, के अवलोकन के लिए एक उभरते विधि है. यह लाइव इमेजिंग का उपयोग बगल में पिंजरे का बँटवारा निरीक्षण करने के लिए आवश्यक हो गया uncharacterized ख्यात सेल चक्र प्रोटीन में उत्परिवर्तन पृथक करने के बाद. ड्रोसोफिला में सबसे रहते इमेजिंग अध्ययन क्योंकि उनके छोटे आकार और ऑप्टिकल स्पष्टता के हेरफेर और अवलोकन करने के लिए पहुंच रहे हैं कि भ्रूण चरणों पर ध्यान केंद्रित किया है. यह खाई चरणों में से एक या दोनों का अभाव है में हालांकि, इन चरणों में सेल चक्र असामान्य है. इसके विपरीत, ड्रोसोफिला की पोटा संबंधी विंग की कोशिकाओं को एक ठेठ सेल चक्र है और पोटा संबंधी विकास के बारे में 20 घंटे फैले तेजी से पिंजरे का बँटवारा की अवधि से गुजरना. यह मैं करने के लिए आसान हैdentify और बगल में पिंजरे का बँटवारा पकड़ने के लिए उचित मंच की pupae अलग. बढ़ते बरकरार pupae प्रयोगों सेल और पशु व्यवहार्यता पर न्यूनतम प्रभाव के साथ कई घंटे के लिए चलाने की अनुमति, इमेजिंग दौरान शिक्षणीयता और स्थायित्व के लिए सबसे अच्छा संयोजन प्रदान की. विधि के रूप में छोटे, या की तुलना में छोटे, गुणसूत्रों मक्खी के रूप में सुविधाओं का अवलोकन की अनुमति देता है. माइक्रोस्कोप सेटिंग्स और बढ़ते के विवरण का समायोजन, तैयारी का विस्तार झिल्ली सन्निकट कक्षों की गतिशीलता और ऐसे ट्यूबिलिन रूप fluorescently लेबल प्रोटीन कल्पना करने की अनुमति दी. इस विधि का परीक्षण फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए काम करता है और समय पैमाने की एक किस्म पर submicron पैमाने सुविधाओं पर कब्जा कर सकते हैं. एक पारंपरिक confocal खुर्दबीन के साथ प्यूपा के बाहरी 20 माइक्रोन तक ही सीमित है, जबकि इन विवो में पोटा संबंधी ऊतकों में प्रोटीन और सेलुलर गतिशीलता को देख के लिए इस दृष्टिकोण इन ऊतकों में सेल और विकासात्मक जीव विज्ञान के अध्ययन में आम तौर पर उपयोगी हो सकता है.
Introduction
सिरका मक्खी, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर,. ड्रोसोफिला अनुसंधान अभिव्यक्ति, पछाड़ना और उत्परिवर्तन सहित जीन में गड़बड़ी की परिष्कृत रूपों की अनुमति देता है कि आनुवंशिक प्रयोग का एक समृद्ध इतिहास है जीव विज्ञान के कई पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित मॉडल है. फ्लोरोसेंट प्रोटीन लेबल के आगमन के साथ, यह प्रदर्शनों की सूची रहने वाले जानवरों में कोशिकाओं और प्रोटीन का अध्ययन में शामिल करने के लिए विस्तार किया गया है. मक्खी भ्रूण यह विवो 1-3 में गहरी, उच्च संकल्प इमेजिंग की अनुमति के लिए छोटे और ऑप्टिकली स्पष्ट है के रूप में इस तरह के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट सिस्टम है. मक्खी विकास के अन्य चरणों बेहोशी 4, विच्छेदन और अल्पावधि संस्कृति 5,6, या इमेजिंग 7,8 के लिए छल्ली में खिड़कियों के निर्माण की आवश्यकता होती है, कम विनयशील होना सिद्ध कर दिया है. इन जोड़तोड़ आमतौर पर लंबी अवधि में पशु विकास समझौता या कम समय के लिए इमेजिंग कि सीमा मायनों में पशु प्रभावित करते हैं.
सबसे भ्रूण कोशिका चक्र छोटा हैं चूंकि सेल चक्र नियामकों जैसे लगते हैं कि जीन में उपन्यास म्यूटेशन का अध्ययन करने के लिए ईएनटी ">, यह. सेल चक्र के समय और निष्ठा का अध्ययन करने के लिए एक उचित तैयारी खोजने के लिए आवश्यक था (एस या एस G2 एम) और अध्ययन के तहत म्यूटेंट बाद के चरणों तक, यह पोटा संबंधी मंच ऊतकों में कोशिका चक्र निरीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण था दोष नहीं दिखाते. प्यूपा में उपकला कोशिकाओं एक अधिक विशिष्ट G1-S-G2 एम सेल चक्र और इस स्तर के pupae हैं मांसपेशी आंदोलनों 9 में सक्षम नहीं. जोड़तोड़ के लिए प्रारंभिक प्रारंभिक बिंदु पोटा संबंधी मामले की स्पष्ट अस्पष्टता के बावजूद Histone2AV-GFP व्यक्त बरकरार पूरे pupae. शामिल, इस बरकरार तैयारी vivo इमेजिंग में लंबी अवधि के लिए उत्कृष्ट साबित हुई. इस तकनीक को सरल है स्नातक शोधकर्ताओं नियमित ड्रोसोफिला में सेल और विकासात्मक जीव विज्ञान के पहलुओं का अध्ययन करने के लिए इसका इस्तेमाल करते हैं और अभी तक संकल्प सुक्ष्ममापी पैमाने पर सुविधाओं की भेदभाव की अनुमति के लिए पर्याप्त ठीक है कि पर्याप्त. इस विधि के साथ, घंटे, मिनट, या सेकंड से अधिक घटनाओं की टिप्पणियों बस समय श्रृंखला मापदंडों का समायोजन करके संभव हैं. नीले, हरे, पीले, नारंगी, और लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन, या इन के संयोजन का उपयोग वीडियो बना दिया गया है. महत्वपूर्ण बात है, अगर देखभाल भी लंबे समय तक इमेजिंग जानवरों के विकास या व्यवहार्यता पर कोई प्रभाव नहीं है, लेजर तीव्रता को कम करने के लिए लिया जाता है.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. कार्य फ्लाई
- कमरे के तापमान पर 10 मानक cornmeal-अग्रवाल गुड़-खमीर माध्यम पर मक्खियों बनाए रखें.
- पार के लिए, eclosion के 6 घंटा के भीतर कुंवारी अलग. वांछित जीनोटाइप के पुरुषों को पार करने के बाद, परिवर्तन हर 3-4 दिनों नई शीशियों के लिए मक्खियों.
नोट: इन प्रयोगों के लिए, Gal4 लाइन A9 विंग में transgenes की अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. फ्लाई शेयरों ब्लूमिंगटन में स्टॉक सेंटर से प्राप्त किया जा सकता है. इन प्रयोगों में इस्तेमाल स्टॉक्स A9-Gal4 (बीएल # 8761), His2Av-GFP (बीएल # 5941), शंघाई सहयोग संगठन / CYO HsCre (बीएल # 1092), यूएएस ChRFP टब (बीएल # 25,773), 11 lollibow शामिल हैं.
2. चयन और pupae के बढ़ते
- स्टेज pupae या तो सफेद prepupae (WPP) के रूप में उन्हें इकट्ठा और वे उपयुक्त उम्र तक पहुंचने तक के 25 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें रखने के द्वारा या रूपात्मक मापदंड से 12 का उपयोग करके.
- कोशिका विभाजन, हाल ही में सिर बहिर्वतन आया है कि चुनिंदा प्यूपा निरीक्षण करने के लिए.इस समय तक सिर्फ eclosion (कम> 96 घंटा) से पहले, pupae स्थिर विस्तारित समय चूक अवलोकन अनुमति दे रहे हैं.
- पहले पानी तूलिका पर उन्हें उकसाने धीरे फिर चिपकने वाला ढीला और करने के लिए अनुमति देने के लिए एक मिनट के लिए इंतजार कर, पानी से सिक्त एक तूलिका के साथ उन्हें छू द्वारा शीशियों से pupae निकालें.
- धीरे लार ग्रंथि चिपकने वाला और खाद्य कणों को निकालने के लिए पानी में एक तूलिका के साथ उन्हें उकसाने द्वारा चयनित pupae धोने.
- एक coverslip नीचे (संख्या 1 आधा coverslips) के साथ एक 25 मिमी पेट्री डिश के लिए स्वच्छ pupae स्थानांतरण.
- ब्याज की ऊतक coverslip के सबसे करीब है, इसलिए है कि एक सहायता के रूप में क्ले मॉडलिंग या दंत मोम या तो की पतली स्ट्रिप्स का उपयोग, pupae माउंट.
नोट: यहां वर्णित अध्ययन में, पोटा संबंधी पंख, पैर, पेट histoblasts या पृष्ठीय notum मनाया गया है. अभ्यास में, पोटा संबंधी मामले की सतह से 20 मीटर के भीतर किसी भी ऊतक नमूदार है. - ओरिएंट pupae ध्यान से इतना है कि Tissuब्याज की ई कांच coverslip सतह के समानांतर है.
- Pupae बढ़ रहे हैं एक बार, प्यूपा और coverslip के बीच अंतरिक्ष के लिए thiodiethylene ग्लाइकॉल (TDG) की एक पतली परत स्थानांतरित करने के लिए एक तूलिका का उपयोग करें.
नोट: TDG, सतह बिखरने कम कर देता है तेल का अपवर्तनांक से मेल खाता है, और ऑक्सीजन ऊतक 13 तर करने की अनुमति देता है. वे सेल व्यवहार के तेजी से समाप्ति के कारण ऑक्सीजन के ऊतकों वंचित करते हैं तेलों का उपयोग की सिफारिश नहीं है.
3. इमेजिंग
नोट: इमेजिंग के लिए, एक confocal खुर्दबीन confocality पोटा संबंधी मामले की तीव्र रोशनी की वजह से obscuring पृष्ठभूमि के सबसे को हटा के रूप में आवश्यक होने की संभावना है.
- पोटा संबंधी विकास और व्यवहार्यता पर रोशनी के प्रभाव को कम करने के लिए confocal पर सेटिंग्स समायोजित करें. ऐसा करने के लिए, उत्तेजना की तीव्रता और संग्रह की संवेदनशीलता के बीच एक संतुलन. इमेजिंग वाई के लिए एक विशिष्ट विन्यासLeica SP5 गुंजयमान स्कैनर (8000 हर्ट्ज), 2% के लिए सेट लेजर पावर (20% बिजली का 10% संप्रेषण), 120 माइक्रोन तक पिनहोल सेट, और 8 लाइन के लिए सेट औसतन इस्तेमाल किया वें. सेटिंग्स प्रयोगात्मक शर्तों के आधार पर अलग अलग होंगे.
नोट: ठीक पैमाने वे ध्यान की गहराई की सीमा हालांकि यह भी सफलतापूर्वक इस विधि में इस्तेमाल किया गया है 40X और 63x तेल विसर्जन लेंस (0.1 मिमी दूरी काम) सुविधाएँ हल करने के लिए.
4. विश्लेषण
फ्रेम का विश्लेषण करने के लिए, Z-ढेर या फिल्में देखने को मापने, और प्रस्तुति के लिए 14 फ़ाइलों को संशोधित करने के लिए प्रभावी उपकरण है जो फिजी, के लिए डेटा फ़ाइलें आयात करते हैं. उदाहरण के लिए पिंजरे का बँटवारा पूरा करने के लिए समय telophase को prophase से एक सेल देखते समय फ्रेम के माध्यम से कदम के लिए नमूना अंतराल और बहुआयामी छवि ब्राउज़र का उपयोग करके मापा गया था. एक्स, वाई, जेड और आयामों को मापने के उपकरण का उपयोग करके मापा जा सकता है. सॉफ्टवेयर और इसके उपयोग के बारे में विस्तृत निर्देशों के लिएदेखें: http://fiji.sc/Fiji.
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Representative Results
ऐसे विकासशील ड्रोसोफिला आंख, या विकासशील हड्डीवाला केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के निलय परत के रूप में pseudostratified epithelia में कोशिकाओं को, परमाणु आंदोलनों से गुजरना, सेल चक्र के साथ समय में, interkinetic परमाणु प्रवास करार दिया. नाभिक बेसल सतह पर या निकट हैं और नाभिक शिखर सतह 15,16 तक पहुँचने जब कोशिकाओं पिंजरे का बँटवारा दर्ज करते डीएनए प्रतिकृति होती. पोटा संबंधी विंग कोशिकाओं सिर बहिर्वतन के बाद पहले कई घंटे के दौरान एक तेजी से विभाजित monolayer उपकला के रूप में. डाटा वर्गों 1 मिनट के अंतराल पर हर 2 माइक्रोन लेने, एक प्रारंभिक पोटा संबंधी विंग से xyzt मोड में एकत्र किए गए थे. जिसके परिणामस्वरूप 3 डी फिल्म पिंजरे का बँटवारा में ही शिखर सतह (चित्रा 1 ए) में देखा गया था. अधिक बेसल स्थानों पर ले जाया धारा पिंजरे का बँटवारा के कोई संकेत नहीं (चित्रा 1 बी) से पता चला है, लेकिन हाल में विभाजित नाभिक शिखर सतह से वापस लौट रहे परमाणु आंदोलनों हुई.
चित्रा 1. नाभिक विभाजित करने के लिए उपकला के ऊपर ले जाएँ. प्रतिनिधि वर्गों His2AvGFP व्यक्त जंगली प्रकार ड्रोसोफिला पोटा संबंधी विंग की एक xyzt confocal छवि से. सर्वोच्च वर्गों में (एक) नाभिक सेल चक्र के विभिन्न चरणों में देखा जा सकता है. नाभिक telophase (तीर) में हैं मेटाफ़ेज़ (तीर) में नाभिक इस माइक्रोग्राफ में प्रचुर मात्रा में हैं. डीएनए प्रतिकृति के राज्य का संकेत है, जो परमाणु व्यास, में भिन्नता है, हालांकि खंड (ख) के निचले विमानों पर पिंजरे का बँटवारा के कोई सबूत स्पष्ट है. बार 10 माइक्रोन पैमाने. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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Discussion
विभाजित कोशिकाओं की सुविधाओं, His2AvGFP कोशिकाओं व्यक्त की confocal विश्लेषण के माध्यम से ड्रोसोफिला के रहने वाले पोटा संबंधी विंग में पिंजरे का बँटवारा के अवलोकन के लिए एक सरल तैयारी के लिए जरूरी विकास, कल्पना को मापने, और यों. इस विधि पोटा संबंधी विंग में सेल चक्र वे पिंजरे का बँटवारा दर्ज जहां उपकला के शिखर सतह तक कि नाभिक चाल में pseudostratified epithelia में चक्र सेल मजबूत समानता भालू उस दस्तावेज़ के लिए इस्तेमाल किया गया था. Telophase के बाद, नाभिक वापस उपकला परत में ड्रॉप. इसलिए, इस monolayer, जाहिरा तौर पर unstratified उपकला, शो की कोशिकाओं परमाणु प्रवास interkinetic सीमित.
सार्वजनिक रूप से उपलब्ध स्टॉक और ड्रोसोफिला 11 में 17 प्रकार के लाइव इमेजिंग brainbow के लिए बनाई गई लाइनों की इमेजिंग, इस तकनीक को अन्य जैविक घटना का अध्ययन करने के लिए generalizable है कि प्रदर्शन किया. यहाँ वर्णित तकनीक ख़बरदार के उत्पादन में इस्तेमाल किया गया थामिनट से 10 घंटे से लेकर बार से अधिक ओएस. कुछ हद तक, माइक्रोस्कोप मापदंडों प्रयोग के साथ बदलती हैं. उदाहरण के लिए, समय चूक इमेजिंग का नमूना दर निगरानी में जैविक घटना की प्रकृति के अनुरूप होना चाहिए: आम तौर पर हर मिनट उपयुक्त है छवियों का एक ढेर इकट्ठा करने, telophase को prophase से लगभग 12 मिनट ले जो कोशिका विभाजन, के अवलोकन के लिए. एक ही कोशिकाओं में filopodia के व्यवहार का निरीक्षण करने के लिए, वर्गों या ढेर महीन (3 सेकंड) अंतराल पर एकत्र किया जाना चाहिए.
वर्णित शर्तों के तहत, eclosing वयस्कों के अस्तित्व या आकारिकी पर कोई प्रभाव की परवाह किए बिना अवलोकन की अवधि के मनाया गया. फ्लोरोसेंट मार्कर कम बहुतायत से होता है, तो लेजर शक्ति आम तौर पर बढ़ा दिया गया था. इन स्थितियों में, फिल्म की अवधि को छोटा या वर्गों या z-ढेर, कम से कम जोखिम की संख्या को कम करने. अन्य प्रयोगों के लिए नियंत्रण में, 5 मिनट के लिए अधिकतम तीव्रता के लिए ऊतक उजागर नहीं effec थावयस्क की आकारिकी या अस्तित्व पर टी. दृश्य, लाल, हरे, पीले, नारंगी और नीले रंग के विभिन्न प्रोटीन की एक किस्म के लिए टैग फ्लोरोसेंट प्रोटीन, झिल्ली को स्थानीय है, और / या कोशिका द्रव्य भरने शामिल करने के लिए बढ़ाया गया था. Submicron रेंज में सुविधाएँ घंटे सेकंड से timescales पर मनाया गया. इस विधि (तैयारी में) जंगली प्रकार और म्यूटेंट में पिंजरे का बँटवारा के समय और निष्ठा का पालन और मापने के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है.
ड्रोसोफिला विकास की पोटा संबंधी चरण वयस्क रूप लार्वा शरीर के चबूतरा पर विकसित करता है, जबकि लार्वा फार्म काफी सफाया कर दिया है जिसमें उल्लेखनीय plasticity की अवधि है. एक समृद्ध इतिहास के बावजूद, कायापलट का अध्ययन methodologically बाधा उत्पन्न किया गया. उदाहरण के लिए, प्रक्रियाओं अंतर्निहित कायापलट अध्ययन करने के लिए प्रत्यक्ष अवलोकन के उपयोग remodeling के दौरान कोशिकाओं और ऊतकों को विवो पहुँच में विश्वसनीय की कमी के द्वारा सीमित किया गया है. हैरत की बात हैयहाँ प्रस्तुत सरल दृष्टिकोण ड्रोसोफिला में विकास के इस गुप्त अवधि के लिए उपयोग की अनुमति देता है. दृष्टिकोण स्नातक से नीचे आसानी से सीखते हैं और ऊतक, सेल और subcellular संगठन की टिप्पणियों की अनुमति के लिए और काफी मजबूत उपयोग कर सकते हैं कि काफी सरल है. इन प्रयोगों के लिए इस्तेमाल माइक्रोस्कोप गहरी ऊतक इमेजिंग के लिए अनुकूल नहीं है, और इसलिए हमारी टिप्पणियों काफी हद तक प्यूपा के बाहरी 20 माइक्रोन के लिए विवश कर रहे हैं. यह ऐसी बहु photon माइक्रोस्कोपी के रूप में गहरी ऊतक प्रवेश की अनुमति है कि तकनीक, इमेजिंग के एक बहुत अधिक से अधिक गहराई की अनुमति और कायापलट अंतर्निहित आंतरिक संरचनात्मक rearrangements के अध्ययन की अनुमति होगी संभावना है.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखकों बौद्धिक समर्थन, सामग्री का समर्थन, और शेयरों के लिए अकीरा चिबा स्वीकार करना चाहते हैं. टिप्पणी के लिए जूलिया Dallman करने के लिए धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly stuff fly pad | Genesee Scientific | 59-114 | for fly anesthetization |
| CO2 gas | Airgas South | CD50 | For fly anesthetization |
| Regulator | Airgas South | CO2 regulator | |
| Fly vials | Genesee Scientific | 32-113RLBF | Fly culture |
| Drosophila lines:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773) | Bloomington Stock Center | ||
| Glass bottom dishes #1 1/2 | WillCo Wells BV | For microscopy | |
| Thiodiethylene Glycol | Fluka | 88559 | mountant |
| Modeling clay | art supply store | Support to position pupae against | |
| Paintbrushes | art supply store | To manipulate flies | |
| Fine Forceps, Inox #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| computer | any | 8 Gb RAM for image/movie analysis | |
| Fiji software | Free ware http://fiji.sc/Fiji | Image analysis software | |
| Confocal microscope | Any fast scanning confocal should be sufficient | ||
| 20X dry, and 40X or 63X oil immersion lenses | any | For imaging tissue, cellular, and subcellular features | |
| Immersion oil (nonfluorescent) | |||
| Stereomicroscope | any | For fly manipulation |
References
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