Summary
Dette dokument viser anvendelsen af en hurtig konfokalt mikroskop billedet celle adfærd direkte gennem puparium. Ved at lade puppe tilfælde intakt, giver denne metode observation og måling af dynamiske celleprocesser i en fase af Drosophila udvikling, der er vanskeligt at studere direkte.
Abstract
Den mangeårige brug af Drosophila som model for celle-og udviklingsmæssige biologi har givet en bred vifte af værktøjer. Sammen har disse teknikker aktiveret analyse af celle-og udviklingsmæssige biologi fra en række forskellige metodiske vinkler. Live-billeddannelse er en ny metode til at observere dynamiske celle processer såsom celledeling eller celle motilitet. Efter at have isoleret mutationer i uncharacterized formodede cellecyklusproteiner det blev vigtigt at overholde mitose in situ ved hjælp af direkte billedvisning. De fleste levende billeddiagnostiske undersøgelser i Drosophila har fokuseret på fosterstadiet, der er tilgængelige for manipulation og observation på grund af deres lille størrelse og optisk klarhed. Men i disse faser af cellecyklus er usædvanligt ved, at det mangler en af de gap faser eller begge dele. Derimod celler af puppe fløj af Drosophila har en typisk cellecyklus og gennemgå en periode med hurtig mitose spænder 20 timer af puppe udvikling. Det er let at jegdentify og isolere pupper af den pågældende fase at fange mitose in situ. Montering intakt pupper forudsat den bedste kombination af medgørlighed og holdbarhed under billedbehandling, så eksperimenter for at køre i flere timer med minimal indvirkning på celle-og dyre-levedygtighed. Fremgangsmåden tillader observation af funktioner så lille som, eller mindre end, flyve kromosomer. Justering af mikroskop indstillinger og detaljerne i montage, tillod udvidelse af præparatet til at visualisere membran dynamik tilstødende celler og fluorescens-mærkede proteiner såsom tubulin. Denne metode virker for alle testede fluorescerende proteiner og kan fange submicron skala funktioner over en bred vifte af tidsskalaer. Mens begrænset til den ydre 20 um puppe med et konventionelt konfokalt mikroskop, kan denne tilgang til at observere protein og cellulære dynamik puppe væv in vivo generelt være nyttige i studiet af cellen og udviklingsmæssige biologi i disse væv.
Introduction
Den eddike flyve, Drosophila melanogaster, er en veletableret model til at studere mange aspekter af biologi. Drosophila forskning har en rig historie af genetiske eksperimenter, der tillader sofistikerede former for genmanipulation, herunder ytringsfrihed, knockdown og mutation. Med fremkomsten af fluorescerende mærker protein, har dette repertoire udvidet til at omfatte undersøgelser af celler og proteiner i levende dyr. Fluen embryo er et glimrende system til sådanne undersøgelser, som det er lille og optisk klar tillader dyb, høj opløsning billeddannelse in vivo 1-3. Andre stadier af flue udvikling har vist sig at være mindre medgørlig, der kræver bedøvelse 4, dissektion og kortsigtet kultur 5,6, eller oprettelsen af vinduer i neglebånd til billeddannelse 7,8. Disse manipulationer normalt kompromittere udviklingen dyr på lang sigt eller påvirke dyr på måder, der begrænser billedbehandling til korte perioder.
ent "> At studere nye mutationer i gener, der ligner cellecyklus regulatorer, var det nødvendigt at finde en passende forberedelse til at studere timingen og troskab af cellecyklus. Da de fleste embryonale cellecykler bliver afkortet (SM eller S-G2-M) og mutanterne under undersøgelse ikke viser fejl i senere stadier, var det vigtigt at overholde cellecyklussen i puppestadiet væv. Epitelceller i puppe har en mere typisk G1-S-G2-M cellecyklus og pupper af denne fase er ikke kan muskelbevægelser 9. Den oprindelige udgangspunkt for manipulationer medtaget intakt hele pupper udtrykker Histone2AV-GFP. Trods den tilsyneladende opaciteten af puppe tilfælde dette intakt præparat vist sig at være fremragende til langvarig in vivo-billeddannelse. Denne teknik er enkel nok, at bachelor-forskere rutinemæssigt bruger det til at studere aspekter af celle-og udviklingsmæssige biologi i Drosophila og alligevel opløsningen er fint nok til at tillade diskrimination af mikrometer skala funktioner. Med denne metode er mulige observationer af begivenheder over timer, minutter eller sekunder blot ved at justere tidsrække parametre. Videoer ved hjælp af blå, grøn, gul, orange og røde fluorescerende proteiner, eller kombinationer af disse, er blevet foretaget. Vigtigere er, hvis draget omsorg for at minimere laser intensitet, selv langsigtede billeddannelse har ingen effekt på udvikling eller levedygtighed af dyrene.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Flyv Arbejde
- Vedligehold fluer på standard cornmeal-agar-melasse-gær medium ved stuetemperatur 10.
- For kors, isolere jomfruer inden 6 timer af eclosion. Efter at have krydset til hanner af den ønskede genotype, fluer skift til nye hætteglas hver 3-4 dage.
Bemærk: Til disse eksperimenter blev Gal4 linje A9 anvendes til at drive ekspression af transgener i vingen. Flyve lagre kan fås fra bestanden center i Bloomington. Bestande, der anvendes i disse forsøg omfatter A9-Gal4 (Bl # 8761), His2Av-GFP (Bl # 5941), Sco / CYO HsCre (Bl # 1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl # 25773), lollibow 11.
2. Valg og montering af Pupper
- Etape pupper enten ved at indsamle dem som hvide prepupae (WPP), og holde dem ved 25 ° C, indtil de når en passende alder, eller ved hjælp af morfologiske kriterier 12.
- At observere celledelinger, skal du vælge puppe, der for nylig gennemgået en hoved udkrængning.Fra dette tidspunkt, indtil lige før eclosion (ved> 96 timer), er pupper immobile tillader forlænget time-lapse observation.
- Fjern pupper fra hætteglassene ved først at røre dem med en pensel fugtet med vand, venter på et minut til at lade vandet løsne limen og derefter forsigtigt puffede dem på pensel.
- Vask forsigtigt udvalgt pupper ved prikning dem med en pensel i vand for at fjerne de spytkirtel klæbende og madrester.
- Overfør ren pupper til en 25 mm petriskål med et dækglas bund (nummer 1 ½ dækglas).
- Brug tynde strimler af enten modellervoks eller dental voks som en støtte, mount pupper så vævet af interesse er tættest på dækglasset.
Bemærk: I de undersøgelser, der er beskrevet her, har puppe vinger, ben, mave histoblasts eller dorsal notum blevet observeret. I praksis væv inden for 20 um af overfladen af den puppe tilfælde observeres. - Orient pupper forsigtigt, så tissue af interesse er parallel med dækglas overflade.
- Når pupper monteret bruge en pensel til at overføre et tyndt lag af thiodiethylenglycol (TDG) til rummet mellem puppe og dækglasset.
Bemærk: TDG reducerer overflade spredning, matcher brydningsindekset af olie og tillader oxygen at gennemtrænge vævet 13. Brug af olie kan ikke anbefales, da de har tendens til at fratage væv af ilt, der forårsager hurtig indstilling af celle adfærd.
3. Imaging
Bemærk: Ved billeddannelse, en konfokal mikroskop vil sandsynligvis være vigtigt som Konfokaljustering fjerner det meste af det slørende baggrunden forårsaget af intens belysning af puppe sagen.
- Juster indstillingerne på konfokal at minimere virkningen af belysning på puppe udvikling og levedygtighed. For at gøre det, finde en balance mellem intensiteten af excitation og følsomheden af samlingen. En typisk konfiguration for imaging with Leica SP5 anvendes resonant scanner (8.000 Hz), lasereffekten sat til 2% (10% transmittans på 20% effekt), pinhole sæt til 120 um, og linie Gennemsnitsberegnings sættes til 8. Indstillinger vil variere afhængigt af forsøgsbetingelser.
Bemærk: For at løse fint skala funktioner 40X og 63X Olieimmersion linser (0,1 mm arbejder afstand) er også blevet brugt med succes i denne metode, selvom de begrænser dybden af fokus.
4.. Analyse
At analysere rammer, z-stakke eller film importere datafiler til Fiji, som har effektive værktøjer til visning, måling, og ændre filer til præsentation 14. For eksempel tid til at færdiggøre mitose blev målt ved hjælp af prøvetagning interval og flerdimensional billede browser til at gå gennem rammer, mens du ser en celle fra prophase til telofase. x-kan måles y-og z-dimensioner skal bruge måleværktøjet. For detaljerede instruktioner om software og dens anvendelsese: http://fiji.sc/Fiji.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Celler i pseudostratified epitel, såsom udvikling af Drosophila øjet eller den ventrikulære lag i udviklingslandene hvirveldyr centralnervesystemet undergår nukleare bevægelser, betegnet interkinetic nuklear migration, i takt med cellecyklus. DNA-replikation forekommer, når kerner er ved eller nær den basale overflade og celler ind mitose, når kernerne nå apikale overflade 15,16. De puppe fløj celler danner et hurtigt delende monolag epitel i de første mange timer efter hoved udkrængning. Data blev indsamlet i xyzt tilstand fra en tidlig puppe fløj, idet sektioner hver 2 um ved 1 min intervaller. I den resulterende 3D film mitose blev kun set på den apikale overflade (figur 1A). Sektioner taget på flere basale steder viste ingen tegn på mitose (figur 1B), men nukleare bevægelser fandt sted, da de nyligt opdelte kerner tilbage fra den apikale overflade.
Figur 1. Kerner flytte til toppen af epitel opdele. Repræsentative snit fra en xyzt konfokalt billede af vildtype Drosophila puppe kanten udtrykker His2AvGFP. På det øverste afsnit (A) kerner kan ses i forskellige faser af cellecyklus. Kerner i metafase (pile) er rigelige i denne mikrograf som er kerner i telofase (pilespidser). Ved lavere fly af sektion (B) ingen tegn på mitose fremgår selvom der er variation i nukleare diameter, som er betegnende for den tilstand af DNA-replikation. Scale Bar 10 um. Klik her for at se større billede .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
At visualisere, måle og kvantificere funktioner i delende celler, der kræves udvikling af en enkel bearbejdning for at observere mitose i levende puppe fløj af Drosophila ved hjælp af konfokal analyse af His2AvGFP udtrykkende celler. Denne metode blev anvendt til at dokumentere, at cellecyklus i puppe fløj bærer stærke ligheder med cellecykler i pseudostratified epiteler i at kerner flytte til den apikale overflade af epitel hvor de kommer ind mitose. Efter telofase, kerner falde tilbage i epitellaget. Derfor cellerne i denne monolag tilsyneladende Ustratificerede epitel show begrænset interkinetic nuklear migration.
Billeddannelse af offentligt tilgængelige lagre og linjer skabt til brainbow 17 typen levende billeddannelse i Drosophila 11, viste, at denne teknik er generaliserbare til studiet af andre biologiske fænomener. Den her beskrevne teknik blev anvendt i produktionen af videos over tid spænder fra få minutter til 10 timer. Til en vis grad, mikroskop parametre varierer med eksperimentet. For eksempel skal samplingfrekvens på time-lapse imaging overensstemmelse med arten af den biologiske fænomen under observation: for at observere celledelinger, der typisk tager omkring 12 min fra prophase til telofase, indsamling af en stak billeder hvert minut er passende. At observere adfærd filopodia i de samme celler, skal sektioner eller stakke afhentes på finere (3 sek) intervaller.
Under de beskrevne betingelser, blev ingen effekt på overlevelse eller morfologi eclosing voksne observeret uanset observationsperioden. Når fluorescerende markør er af lav tæthed blev lasereffekt typisk øges. I disse situationer, forkorte varigheden af filmen eller reducere antallet af sektioner eller z-stakke, minimeret eksponering. I styringer til andre eksperimenter, udsætter vævet til maksimal intensitet i 5 minutter havde ingen effektivt på morfologi eller overlevelse af den voksne. Visualisering blev udvidet til rød, grøn, gul, orange og blå fluorescerende proteiner mærket til en række forskellige proteiner, lokaliseret til membranen og / eller fyldning af cytoplasmaet. Funktioner i submicron område blev observeret over tidsskalaer fra sekunder til timer. Denne metode er blevet brugt i udstrakt grad til at observere og måle timing og troskab i mitosen i vildtype og mutanter (under udarbejdelse).
Puppestadiet Drosophila udvikling er en periode med bemærkelsesværdig plasticitet hvor larvestadiet form væsentlige elimineres, mens den voksne form udvikler sig på stilladset af larvestadiet kroppen. På trods af en rig historie har studiet af metamorfose blevet metodisk hæmmet. For eksempel er brugen af direkte observation til at studere processer underliggende metamorfose været begrænset af manglen på pålidelig in vivo adgang til de celler og væv under ombygning. Den overraskendeenkel strategi, der fremlægges her giver adgang til denne kryptiske periode i udviklingen i Drosophila. Fremgangsmåden er simpel nok, at bachelorer nemt kan lære og bruge det og robust nok til at tillade observationer af væv, celler og subcellulære organisation. Mikroskopet anvendt til disse eksperimenter er ikke optimeret til dybe væv billedbehandling og så vores observationer er stort set begrænset til den ydre 20 um puppe. Det er sandsynligt, at teknikker, der tillader dybere væv penetration, såsom multi-foton mikroskopi, ville tillade en langt større dybde af imaging og tillade undersøgelse af de interne strukturelle omarrangeringer underliggende metamorfose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker at anerkende Akira Chiba for intellektuel støtte, materiel støtte, og lagre. Tak til Julia Dallman for kommentarer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly stuff fly pad | Genesee Scientific | 59-114 | for fly anesthetization |
| CO2 gas | Airgas South | CD50 | For fly anesthetization |
| Regulator | Airgas South | CO2 regulator | |
| Fly vials | Genesee Scientific | 32-113RLBF | Fly culture |
| Drosophila lines:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773) | Bloomington Stock Center | ||
| Glass bottom dishes #1 1/2 | WillCo Wells BV | For microscopy | |
| Thiodiethylene Glycol | Fluka | 88559 | mountant |
| Modeling clay | art supply store | Support to position pupae against | |
| Paintbrushes | art supply store | To manipulate flies | |
| Fine Forceps, Inox #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| computer | any | 8 Gb RAM for image/movie analysis | |
| Fiji software | Free ware http://fiji.sc/Fiji | Image analysis software | |
| Confocal microscope | Any fast scanning confocal should be sufficient | ||
| 20X dry, and 40X or 63X oil immersion lenses | any | For imaging tissue, cellular, and subcellular features | |
| Immersion oil (nonfluorescent) | |||
| Stereomicroscope | any | For fly manipulation |
References
- Raff, J. W., Jeffers, K., Huang, J. Y. The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time. J. Cell Biol. 157, 1139-1149 (2002).
- Stramer, B., et al. Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration. J. Cell Biol. 168, 567-573 (2005).
- Clark, I. B., Jarman, A. P., Finnegan, D. J. Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration. BMC Dev. Biol. 7, 52 (2007).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nat. Protoc. 2, 3285-3298 (2007).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol. Biol. Cell. 16, 5127-5140 (2005).
- Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways. Science. 332, 354-358 (2011).
- Gho, M., Bellaiche, Y., Schweisguth, F. Revisiting the Drosophila microchaete lineage: a novel intrinsically asymmetric cell division generates a glial cell. Development. 126, 3573-3584 (1999).
- Ninov, N., Martin-Blanco, E. Live imaging of epidermal morphogenesis during the development of the adult abdominal epidermis of Drosophila. Nat. Protoc. 2, 3074-3080 (2007).
- Edgar, B. A., Lehner, C. F. Developmental control of cell cycle regulators: a fly's perspective. Science. 274, 1646-1652 (1996).
- Wirtz, R. A., Semey, H. G. The Drosophila kitchen: equipment, media preparation, and supplies. Drosophila Information Service. 58, 176-180 (1982).
- Boulina, M., Samarajeewa, H., Baker, J. D., Kim, M. D., Chiba, A. Live imaging of multicolor-labeled cells in Drosophila. Development. 140, 1605-1613 (2013).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M.
- Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. 2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy. Microsc. Res. Tech. 70, 1-9 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Meyer, E. J., Ikmi, A., Gibson, M. C. Interkinetic nuclear migration is a broadly conserved feature of cell division in pseudostratified epithelia. Curr. Biol. 21, 485-491 (2011).
- Sauer, F. C.
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
