Isolering av mRNA Associated med gjær Mitokondrier å studere mekanismer for Localized Oversettelse
Summary
Mange av mRNA som koder for mitokondrielle proteiner er forbundet med mitokondrier ytre membran. Vi beskriver en subcellulære fraksjone fremgangsmåte rettet mot isolering av gjær mitokondrier med tilhørende mRNAer og ribosomer. Denne protokollen kan brukes på celler dyrket under ulike forhold for å avdekke mekanismene for mRNA lokalisering og lokaliserte oversettelse nær mitokondriene.
Abstract
De fleste av mitokondrielle proteiner er kodet i kjernen, og må importeres inn i organeller. Import kan forekomme når proteinet blir syntetisert i nærheten av mitochondria. Støtte for denne muligheten er avledet fra nylige studier hvor mange mRNAer som koder mitokondrie protein ble vist til å være lokalisert til mitokondriene nærhet. Sammen med tidligere demonstrasjoner av ribosomer Organisasjon med den ytre membran, disse resultatene tyder på en lokalisert oversettelsesprosessen. Slike lokalisert oversettelse kan forbedre import effektivitet, gir unike regulerings områder og redusere tilfeller av ektopisk uttrykk. Diverse metoder har blitt brukt for å karakterisere hvilke faktorer og elementer som formidler lokaliserte oversettelse. Standard blant disse er subcellulære fraksjonering av differensial sentrifugering. Denne protokollen har fordelen av isolering av mRNA, ribosomer og proteiner i en enkelt prosedyre. Disse kan da være preget av ulike molekylære og bikjemiske metoder. Videre kan transcriptomics og proteomikk metoder anvendes på det resulterende materiale, og dermed tillate genom innsikt. Utnyttelsen av gjær som modellorganisme for slike studier har fordelene av hastighet, kostnader og enkelhet. Videre er de avanserte genetiske verktøy og tilgjengelige delesjonsstammer lette verifisering av kandidat faktorer.
Introduction
Eukaryote celler er organisert i forskjellige avdelinger som har spesifikke funksjoner. For å oppnå dens funksjon, inneholder hvert kammer et unikt sett av proteiner som er nødvendig for dens aktivitet. En mulig mekanisme som disse proteinene nærmer seg deres kammer er ved lokal oversettelse 1,2. I denne prosessen, blir proteinet syntetisert på bestemmelsesstedet ved ribosomer og mRNA som er lokalisert der. Blant de sannsynlige fordelene med lokaliserte oversettelse er økt effektivitet av protein målretting, redusert behov for protein anstand, og muliggjør stedsspesifikke reguleringsmekanismer. Også, kan lokaliserte mRNA og ribosomer være en bortgjemt reservoar av oversettelses maskiner i tilfeller av mobilnettet stress, når generell oversettelse hemmes.
Mitokondrier ble i de senere år en sentral modell for å studere lokaliserte oversettelse. De fleste mitokondrier proteiner er kodet i kjernen, oversatt i cytosol,og importert inn i organeller. Forskjellige linjer av bevis indikerer at mange av disse proteinene er produsert gjennom en lokal oversettelsesprosessen. I utgangspunktet elektronmikroskopi og biokjemiske fraksjone studier oppdaget ribosomer assosiert med mitokondrier 3-5. Disse studiene der da bekreftet in vivo ved arbeid på spesifikke mRNA, som ble funnet å være importeres bare i en cotranslational måte 6,7. Genom studier av mRNA assosiasjon med mitokondrier viste at en betydelig andel av mRNA er lokalisert til mitokondriene nærhet 8-10. Noen av disse mRNA ble videre karakterisert ved in vivo fluorescens-metoder, slik som fisk-eller mTAG 9,11. En rett-frem tolkning av denne foreningen er at disse mRNA tjene som maler for lokaliserte oversettelse.
De mekanismer som disse mRNA nærmer mitokondriene er ukjent. Noncoding domener (mest significantly 3 'UTRs) ble vist å være involvert i mRNA tilknytning til mitokondriene 12. Disse domenene er sannsynlig å tjene som et bindingssete for RNA-bindende proteiner som medierer deres transport. Studier i gjær avslørt at et medlem av PUM familie av proteiner (Puf3) støtter mRNA forening med mitokondrier 8,13. En plausibel rolle for Puf3, som er basert på funksjoner av andre familiemedlemmer, er å inhibere oversettelses mens mRNA er en rute 14.. Dermed kan mRNA transporteres i en nontranslated status, etter RNA bindende proteiner som samhandler med noncoding regioner. Alternativt en stor mengde arbeid antyder at transport skjer mens proteinet blir syntetisert. Spesielt ble oversettings hemmere vist å påvirke mRNA foreningen 8,13. Videre oversatte funksjoner som den aug, mitokondrie målretting sekvens (MTS) eller ORF regioner ble vist for å bistå i lokalisering 8,11,15. Hsp70-familien protein chaperone og protein reseptor på mitokondriene ytre membran ble også vist seg å støtte mRNA forening, videre antyde at kodet-protein funksjoner er viktig for mRNA lokalisering 16. Dette er konsistent med en modell der ribosom-dukker protein fungerer som anerkjennelse element for målretting mRNA-ribosom-protein kompleks til mitokondriene 17.
Lokalisert oversettelses nær mitokondrier ble studert ved forskjellige metoder, inkludert elektronmikroskopi (for å visualisere ribosomer) 3, FISH 9, grønn RNA (for å påvise spesifikke mRNA) 11, og biokjemiske fraksjonering (for å detektere både RNA og ribosomer) 10,18. Mens de tidligere metoder detektere lokalisering in vivo, og kan tillate visualisering av transport dynamikk, at sistnevnte deteksjon av mange forskjellige mRNA i et enkelt eksperiment. Videre, for biokjemisk fraksjone koding eller noncoding domener trenger ikke å være alangitt, derfor deres spesifikke roller kan evalueres. Biochemical fraksjone har blitt brukt i mange år, for isolering av mange forskjellige cellene. Sine oppdragsgivere og begrensninger er godt etablert, og man kan enkelt endre eksisterende protokoller for ulike formål. Den nødvendige instrumentering er standard i mange laboratorier, derfor er det vanligvis den første metoden for valg for å studere intracellulær lokalisering. Vi beskriver en protokoll som var optimalisert for isolering av mRNA, mens ribosomer er forbundet med mitokondrier. Denne protokollen er derfor optimal for å studere faktorer involvert i lokaliserte oversettelse nær mitokondrier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Teknologiske fremskritt i bilde hadde gitt høy oppløsning verktøy for å studere mRNA lokalisering. I dag kan man måle bevegelse av en eneste mRNA molekyl i msek tidsskala 23-26. Likevel, tradisjonelle biokjemiske metoder, som den som er beskrevet ovenfor, er også rikt og er å foretrekke i noen tilfeller. Biochemical isolasjon tillater rensing av et stort repertoar av mRNA og proteiner, og er derfor å foretrekke for genom-wide-studier. I en enkel isolasjon, kan man oppnå tilstrekkelig mRNA-nivåer for…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker legene. Erez Eliyahu, Daniel Melamed, Ophry Pines og Doron Rapaport for hjelp og kommentarer under etableringen av denne protokollen. Dette arbeidet er finansiert av ISF (stipend nummer 1193-1109).
Materials
| Yeast Extract | |||
| BactoPeptone | |||
| Galactose | Do not autoclave Galactose | ||
| Growth medium | For mitochondrial enrichment, you should use any non- fermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose | ||
| 0.1 M TrisHCl pH9.4 | |||
| 30 mM TrisHCl pH7.6 | |||
| Dithiothreitol (DTT) | |||
| 10 mM DTT Buffer | 0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time | ||
| 1.2 M Sorbitol | |||
| 4 mM KH2PO4 | |||
| 16 mM K2HPO4 | |||
| 0.2μm filter | |||
| Zymolyase Buffer | 1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this buffer (0.2μm) and keep at room temperature for future use | ||
| Zymolyase 20T | 20,000 U/gr | ||
| Recovery medium | Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol | ||
| 0.1 mg/mL Cycloheximide (CHX) | |||
| 0.6 M Mannitol | |||
| 5 mM MgAc | |||
| 100 mM KCl | |||
| 0.5 mg/mL Heparin | |||
| 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | |||
| Mannitol Buffer | 0.6 M Mannitol, 30 mM TrisHCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/mL Heparin, 0.1 mg/mL CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold | ||
| 8M Guanidinium-HCl | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| 3 M Sodium Acetate pH5.2 | |||
| 10 M LiCl stock solution | |||
| 250 mM Tris HCl pH 6.8 | |||
| SDS | |||
| Glycerol | |||
| β-mercaptoethanol | |||
| Bromophenolblue | |||
| 4xLSB | 250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol and 0.02% Bromophenol blue | ||
| Dounce homogenizer of 15-ml capacity equipped with tight- fitting pestle |
References
- Holt, C. E., Bullock, S. L. Subcellular mRNA localization in animal cells and why it matters. Science. 326, 1212-1216 (2009).
- Donnelly, C. J., Fainzilber, M., Twiss, J. L. Subcellular communication through RNA transport and localized protein synthesis. Traffic. 11, 1498-1505 (2010).
- Kellems, R. E., Allison, V. F., Butow, R. A. Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. II. Evidence for the association of cytoplasmic ribosomes with the outer mitochondrial membrane in situ. J. Biol. Chem. 249, 3297-3303 (1974).
- Kellems, R. E., Butow, R. A. Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. 3. Changes in the amount of bound ribosomes in response to changes in metabolic state. J. Biol. Chem. 249, 3304-3310 (1974).
- Suissa, M., Schatz, G. Import of proteins into mitochondria. Translatable mRNAs for imported mitochondrial proteins are present in free as well as mitochondria-bound cytoplasmic polysomes. J. Biol. Chem. 257, 13048-13055 (1982).
- Fujiki, M., Verner, K. Coupling of cytosolic protein synthesis and mitochondrial protein import in yeast. Evidence for cotranslational import in vivo. J. Biol. Chem. 268, 1914-1920 (1993).
- Yogev, O., Karniely, S., Pines, O. Translation-coupled translocation of yeast fumarase into mitochondria in vivo. J. Biol. Chem. 282, 29222-29229 (2007).
- Eliyahu, E., et al. Tom20 mediates localization of mRNAs to mitochondria in a translation-dependent manner. Mol. Cell. Biol. 30, 284-294 (2010).
- Garcia, M., et al. Mitochondria-associated yeast mRNAs and the biogenesis of molecular complexes. Mol. Cell. Biol. 18, 362-368 (2007).
- Marc, P., et al. Genome-wide analysis of mRNAs targeted to yeast mitochondria. EMBO Rep. 3, 159-164 (2002).
- Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. RNA. 17, 1551-1565 (2011).
- Margeot, A., et al. In Saccharomyces cerevisiae, ATP2 mRNA sorting to the vicinity of mitochondria is essential for respiratory function. J EMBO. 21, 6893-6904 (2002).
- Saint-Georges, Y., et al. Yeast mitochondrial biogenesis: a role for the PUF RNA-binding protein Puf3p in mRNA localization. PloS one. 3, (2008).
- Quenault, T., Lithgow, T., Traven, A. PUF proteins: repression, activation and mRNA localization. Trends Cell Biol. 21, 104-112 (2011).
- Garcia, M., Delaveau, T., Goussard, S., Jacq, C. Mitochondrial presequence and open reading frame mediate asymmetric localization of messenger RNA. EMBO Rep. 11, 285-291 (2010).
- Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria. FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).
- Ahmed, A. U., Fisher, P. R. Import of nuclear-encoded mitochondrial proteins: a cotranslational perspective. Int. Rev. Cell Biol. 273, 49-68 (2009).
- Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria. Methods Mol. Biol. 714, 287-299 (2011).
- Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3′-UTRs and their ORFs. Nucleic Acids RES. 36, 6728-6738 (2008).
- Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of mRNA polysomal profiles with spotted DNA microarrays. Methods Enzymol. 431, 177-201 (2007).
- Margeot, A., et al. Why are many mRNAs translated to the vicinity of mitochondria: a role in protein complex assembly. Gene. 354, 64-71 (2005).
- Mathieu, L., Marsy, S., Saint-Georges, Y., Jacq, C., Dujardin, G. A transcriptome screen in yeast identifies a novel assembly factor for the mitochondrial complex III. Mitochondrion. 11, 391-396 (2011).
- Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast. Nat. Methods. 10, 119-121 (2013).
- Park, H. Y., Buxbaum, A. R., Singer, R. H. Single mRNA tracking in live cells. Methods Enzymol. 472, 387-406 (2010).
- Thompson, M. A., Casolari, J. M., Badieirostami, M., Brown, P. O., Moerner, W. E. Three-dimensional tracking of single mRNA particles in Saccharomyces cerevisiae using a double-helix point spread function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17864-17871 (2010).
- Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nat. Methods. 6, 331-338 (2009).
- Garcia, M., Darzacq, X., Devaux, F., Singer, R. H., Jacq, C. Yeast mitochondrial transcriptomics. Methods Mol. Biol. 372, 505-528 (2007).
- Reinders, J., Sickmann, A. Proteomics of yeast mitochondria. Methods Mol. Biol. 372, 543-557 (2007).
- Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations. Anal. Biochem. 287, 339-342 (2000).
- Glick, B. S., Pon, L. A. Isolation of highly purified mitochondria from Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 260, 213-223 (1995).
- Boldogh, I. R., Pon, L. A. Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Cell Biol. 80, 45-64 (2007).
- Rieder, S. E., Emr, S. D., Bonifacino, J. S., et al. . Isolation of subcellular fractions from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Current protocols in cell biology / editorial board. 8, (2001).
- Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Cell Biol. 65, 37-51 (2001).
