Imaging dendrittutløperne av Rat Primary hippocampus nevroner bruker Strukturert Illumination Mikros
Summary
Denne artikkelen beskriver en arbeidsprotokoll til bilde dendrittutløperne fra hippocampus nevroner in vitro ved hjelp av Structured Illumination Mikros (SIM). Super-oppløsning mikroskopi ved hjelp av SIM gir bildeoppløsningen betydelig utover lyset diffraksjon grensen i alle tre romlige dimensjoner, slik at avbildning av individuelle dendrittutløperne med forbedret detalj.
Abstract
Dendrittutløperne er fremspring som kommer ut dendrite av et nevron, og representerer den primære postsynaptiske mål for eksitatoriske innganger i hjernen. Teknologiske fremskritt har identifisert disse strukturene som sentrale elementer i nevron tilkobling og synaptisk plastisitet. Den kvantitative analysen av ryggraden morfologi ved hjelp av lysmikroskopi forblir et viktig problem på grunn av tekniske begrensninger knyttet til lysets iboende brytning grense. Dendrittutløperne kan lett identifiseres ved konfokal laser-scanning fluorescens mikroskopi. Men, måler små endringer i form og størrelse av pigger er vanskelig fordi ryggraden dimensjoner enn lengden er vanligvis mindre enn konvensjonell optisk oppløsning løst ved lysmikroskopi teoretiske oppløsning grense på 200 nm.
Flere nyutviklede super oppløsning teknikker har blitt brukt til bilde cellulære strukturer mindre enn 200 nm, inkludert dendrittutløperne. These teknikker er basert på klassiske fjernfeltoperasjoner, og derfor tillater bruk av eksisterende prøveprepareringsmetoder og til bilde utover overflaten av en prøve. Beskrevet her er en arbeids protokoll skal gjelde super oppløsning strukturert belysning mikroskopi (SIM) til avbildning av dendrittutløperne i primær hippocampus nevroner kulturer. Mulige anvendelser av SIM overlapper med de konfokalmikroskopi. Men de to teknikkene presentere forskjellige anvendbarhet. SIM gir høyere effektiv lateral oppløsning, mens konfokal mikroskopi, på grunn av bruken av en fysisk pinhole, oppnår oppløsning forbedring på bekostning av fjerning av ute av fokus lys. I denne protokollen, primære nevroner er dyrket på glass dekkglass ved hjelp av en standard protokoll, tilført med DNA-plasmider som koder fluorescerende proteiner og avbildes ved hjelp av SIM. Hele protokollen beskrevet heri tar omtrent 2 uker, fordi dendrittutløperne er avbildes etter 16-17 dager in vitro, nårdendrittiske utvikling er optimal. Etter gjennomføringen av protokollen, kan dendrittutløperne bli rekonstruert i 3D fra serie SIM bildestakker hjelp av spesialisert programvare.
Introduction
En dendrittiske ryggraden er en liten utvekst av nervecellen membran. Dette karakteristiske struktur er spesialisert til typisk motta innspill fra en enkelt synapse og representerer den fysiske kontaktflaten mellom to nerveceller. De funksjonelt modne dendrittutløperne består av en kuleformet spiss, betegnet med hodet, og en tynn hals som forbinder hodet til dendrittiske akselen. Men piggene er ikke statisk og aktivt flytte og endre sin morfologi kontinuerlig selv i den voksne hjernen to. Innen en to ukers periode, rotte primære hippocampus nevroner kulturer som stammer fra slutten av embryonale eller tidlig postnatal tid utvikle komplekse dendrittiske lysthus med mange membran utstikkere som utvikler seg fra tidlig filipodia til spine-lignende strukturer tre. Basert på dette dynamiske atferd og andre kjennetegn, er dendrittutløperne tenkt å gi en anatomisk substrat for minne lagring og synaptisk overføring 4,5.
Gitt the kritisk rolle som dendrittiske ryggrad størrelse og form er i synaptiske funksjon, er det viktig å måle deres dimensjoner nøyaktig. Pigger varierer fra rundt 200 til 2000 nanometer i lengde og kan lett identifiseres ved konfokal laser-scanning fluorescens mikroskopi. Men ryggraden dimensjoner enn lengde er vanligvis under den konvensjonelle optiske systemer 'oppløsning, teoretisk fast ved diffraksjon rundt 200 nanometer seks. Disse løse krefter er utilstrekkelig for imaging finere detaljer, for eksempel bredden på ryggraden nakken og hodet. Mye arbeid har vært dedikert til å løse dette problemet, og mange relativt nye super-oppløsning mikroskopi teknikker har gitt betydelig framgang. Spesielt er det mulig å oppnå oppløsningen ut over den klassiske grense uten å forkaste enhver emisjon lys ved hjelp av sideveis strukturert belysning mikroskopi (SIM) i en bred-felt, ikke-konfokalmikroskop 7-10. Ved hjelp av denne teknikken i kombinasjon med ikke-linear mikroskopi-teknikker, er det teoretisk mulig å forbedre den laterale oppløsning av det optiske mikroskop av et ubegrenset faktor 11.. Men i de fleste eksperimentelle omstendigheter, tillater SIM å overgå oppløsning grense ved en faktor på to til en. Andre super-oppløsning optisk mikroskopi teknikker som stimulert emisjon mangel (STED) mikros 12 og foto-aktivering lokalisering mikroskopi (PALM) 12 har blitt brukt til avbildning av dendrittutløperne. Lokaliseringsbaserte metoder som PALM krever svært stort antall RAW-bilder for å oppnå super-oppløsning og er derfor begrenset i hastighet. På den annen side, kan STED oppnå høy bildehastighet, selv ved relativt lave fotontellinger og små synsfelt, noe som kanskje ikke er tilfelle for SIM 13.
I denne artikkelen Målet er å gi en arbeidsprotokoll til bilde dendrittutløperne fra rotte primære hippocampus nerveceller dyrket in vitro </em> ved hjelp av SIM. Protokollen består av to skjelnes faser: en innledende ett bestående av etablering, utvikling, transfeksjon og immunhistokjemi av rotte primære hippocampus nevroner kulturer og en sen fase dedikert til å prøve bildebehandling.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne artikkelen en arbeidsprotokoll til bilde dendrittutløperne fra rotte primære hippocampus nerveceller dyrket in vitro ved hjelp av SIM-kortet er beskrevet. Den primære hippocampus neuron kulturmetode er en tilpasning av den opprinnelige metoden beskrevet av KAECH og Banker 18.. Den viktigste forskjellen er bruken av Neurobasal/B27 kulturmediet, noe som eliminerer behovet for astroglial matekulturer, og tilsetningen av mitotisk inhibitor FUDR på dag 3 som fremmer neuronal overlevelse med de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av en VIDI stipend nummer H64.09.016 fra Nederland Organization for Scientific Research (NWO) til CPF. CPF er takknemlig til Dr. Silvina A. Fratantoni for hennes kritiske kommentarer og rettelser på det endelige manuskriptet. GMRDL / emmm støttes av den nederlandske Technology Foundation STW (prosjekt 12151 og 11350), som er en del av NWO, og som er delvis finansiert av Ministry of Economic Affairs. Vi takker Catherine Kitts og Peter Drent av Nikon Instruments Europe BV for å få hjelp og støtte. HX ble støttet av Royal Dutch Academy of Arts and Sciences (stipend 11CDP10) og WT ble støttet av stipend den nederlandske organisasjonen for vitenskapelig forskning (stipend 820.02.006).
Materials
| Fine forceps | |||
| Big forceps | |||
| Fine scissor | |||
| Big scissor | |||
| Blunt spatula | |||
| Dissecting microscope with illumination | |||
| Light microscope | |||
| 37 °C water bath | |||
| Laminar flow cell culture hood | |||
| High-temperature dry-oven | |||
| Bunsen burner | |||
| Cell culture incubator (5% CO2, 37 °C) | |||
| Microcentrifuge | |||
| Orbital shaker | |||
| Nikon structured illumination microscope setup consisting of: | |||
| Nikon Eclipse Ti research inverted microscope with Perfect Focus System | |||
| Nikon CFI Apo TIRF 100x oil objective lens (N.A. 1.49) | |||
| 4 Coherent Sapphire Lasers (458, 488, 514 and 561 nm exitation wavelength) | |||
| SIM Illuminator | |||
| Nikon Stage Controller | |||
| MCL Nano-Drive piezo controller | |||
| Nikon Intensilight C-HGFIE mercury lamp | |||
| SIM Microscope Enclosure temperature control | |||
| Andor EM-CCD Camera iXon DU897 | |||
| PC with Microsoft Windows 7 Home Edition | |||
| Nikon’s NiS Elements 6.14 SIM software package | |||
| Nikon type A immersion oil |
References
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J Microsc. 198, 82-87 (2000).
- Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. Dendritic spine formation and stabilization. Curr Opin Neurobiol. 19, 146-153 (2009).
- Dailey, M. E., Smith, S. J. The dynamics of dendritic structure in developing hippocampal slices. J Neurosci. 16, 2983-2994 (1996).
- Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annu Rev Neurosci. 30, 79-97 (2007).
- Jaworski, J., et al. Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity. Neuron. 61, 85-100 (2009).
- Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für mikroskopische Anatomie. 9, 413-418 .
- Gustafsson, M. G., Agard, D. A., Sedat, J. W. I5M: 3D widefield light microscopy with better than 100 nm axial resolution. J Microsc. 195, 10-16 (1999).
- Heintzmann, R., Cremer, C. G. Laterally modulated excitation microscopy: improvement of resolution by using a diffraction grating. Proc. SPIE 3568 Optical Biopsies and Microscopic Techniques III. , 185-196 (1999).
- Karadaglić, D., Wilson, T. Image formation in structured illumination wide-field fluorescence microscopy. Micron. 39, 808-818 (2008).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320, 1332-1336 (2008).
- Gustafsson, M. G. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13081-13086 (2005).
- Nagerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W., Bonhoeffer, T. Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 18982-18987 (2008).
- Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination. Nat Methods. 6, 339-342 (2009).
- James, C. D., et al. Aligned microcontact printing of micrometer-scale poly-L-lysine structures for controlled growth of cultured neurons on planar microelectrode arrays. IEEE Trans Biomed Eng. 47, 17-21 (2000).
- Dumitriu, D., Rodriguez, A., Morrison, J. H. High-throughput, detailed, cell-specific neuroanatomy of dendritic spines using microinjection and confocal microscopy. Nat Protoc. 6, 1391-1411 (2011).
- Fitzsimons, C. P., et al. Knockdown of the glucocorticoid receptor alters functional integration of newborn neurons in the adult hippocampus and impairs fear-motivated behavior. Mol Psychiatry. , (2012).
- van Hooijdonk, L. W., et al. Lentivirus-mediated transgene delivery to the hippocampus reveals sub-field specific differences in expression. BMC Neurosci. , (2009).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
- Izeddin, I., et al. Super-resolution dynamic imaging of dendritic spines using a low-affinity photoconvertible actin probe. PLoS ONE. 6, (2011).
