Imagerie épines dendritiques des neurones de l'hippocampe de rat primaire utilisant structuré Illumination Microscopy
Summary
Cet article décrit un protocole de travail à l'image épines dendritiques de neurones de l'hippocampe in vitro utilisant structuré Illumination Microscopy (SIM). Microscopie de super-résolution utilisant la carte SIM offre une résolution d'image de façon significative au-delà de la limite de diffraction de la lumière dans les trois dimensions de l'espace, ce qui permet l'imagerie des épines dendritiques individuelles avec l'amélioration de détail.
Abstract
Épines dendritiques sont des saillies issues de la dendrite d'un neurone et représentent les cibles primaires de post-synaptiques excitateurs entrées dans le cerveau. Les progrès technologiques ont permis d'identifier ces structures comme des éléments clés de la connectivité neuronale et la plasticité synaptique. L'analyse quantitative de la morphologie de la colonne vertébrale en utilisant la microscopie optique reste un problème essentiel en raison de limitations techniques liées à la limite de réfraction intrinsèque de la lumière. Épines dendritiques peuvent être facilement identifiés par microscopie à fluorescence confocale laser à balayage. Toutefois, la mesure des changements subtils dans la forme et la taille des épines est difficile en raison des dimensions de la colonne vertébrale autres que la longueur sont généralement plus petits que la résolution optique classique fixé par théorique limite de résolution de la microscopie optique de 200 nm.
Plusieurs techniques de super résolution récemment développés ont été utilisés pour les structures cellulaires image plus petits que les 200 nm, y compris les épines dendritiques. Ttechniques es sont basés sur les activités en champ lointain classiques et permettent donc l'utilisation de méthodes existantes de préparation d'échantillons et à l'image au-delà de la surface d'un échantillon. Décrit ici est un protocole de travail pour appliquer la résolution de super structuré éclairage microscopie (SIM) pour l'imagerie des épines dendritiques dans des cultures de neurones hippocampiques primaires. Les applications possibles de la carte SIM se chevauchent avec ceux de la microscopie confocale. Cependant, ces deux techniques présentent l'applicabilité différente. SIM offre une résolution latérale plus efficace, tout en microscopie confocale, en raison de l'utilisation d'un sténopé physique, réalise l'amélioration de la résolution au détriment de l'enlèvement de sortir de la lumière de mise au point. Dans ce protocole, les neurones primaires sont cultivées sur des lamelles de verre en utilisant un protocole standard, transfectées avec des plasmides d'ADN codant pour des protéines fluorescentes et imagée en utilisant la carte SIM. Le tout protocole décrit ici prend environ 2 semaines, parce que les épines dendritiques sont imagés après 16-17 jours in vitro, quanddéveloppement dendritique est optimal. Après l'achèvement du protocole, épines dendritiques peuvent être reconstruites en 3D de la série de la carte SIM piles d'images à l'aide de logiciels spécialisés.
Introduction
Une épine dendritique est une petite saillie de la membrane des neurones. Cette structure caractéristique est spécialisée recevoir généralement des données à partir d'une seule synapse et représente la zone de contact physique entre deux neurones. La plupart des épines dendritiques fonctionnellement matures constitués d'une pointe globulaire, appelé tête, et un cou mince qui relie la tête de l'arbre dendritique. Cependant, les épines sont pas statiques et se déplacent activement et modifier leur morphologie en permanence, même dans le cerveau adulte 2. Dans un délai de 2 semaines de temps, des cultures de neurones de l'hippocampe de rat primaire provenant de la fin du temps postnatale embryonnaire ou au début de développer tonnelles dendritiques complexes avec de nombreuses protubérances membranaires qui évoluent de filipodes tôt pour les structures de la colonne vertébrale comme 3. Sur la base de ce comportement dynamique et d'autres caractéristiques, les épines dendritiques sont pensés pour fournir un substrat anatomique pour le stockage en mémoire et 4,5 de la transmission synaptique.
Compte tenu ee rôle critique que la taille des épines dendritiques et la forme ont dans la fonction synaptique, il est important de mesurer leurs dimensions avec précision. Épines varient d'environ 200 à 2000 nanomètres de longueur et peuvent être facilement identifiés par microscopie à fluorescence confocale laser à balayage. Cependant, les dimensions de la colonne vertébrale autres que la longueur sont généralement en dessous de la résolution des systèmes optiques classiques de, théoriquement fixée par diffraction autour de 200 nanomètres 6. Ces pouvoirs de résolution sont insuffisantes pour l'imagerie des détails plus fins, telles que la largeur de cou de la colonne vertébrale et la tête. Beaucoup de travail a été consacrée à résoudre ce problème et de nombreux relativement nouvelles techniques de microscopie de super-résolution ont fourni d'importants progrès. En particulier, il est possible d'obtenir une résolution au-delà de la limite classique sans écarter toute lumière d'émission en utilisant la microscopie à lumière structurée latéralement (SIM) dans un grand champ, d'un microscope confocal non-10.7. En utilisant cette technique en combinaison avec des non-linear techniques de microscopie, il est théoriquement possible d'améliorer la résolution latérale du microscope optique par un facteur 11 illimité. Cependant, dans la plupart des cas expérimentaux, SIM permet de dépasser la limite de résolution d'un facteur de deux 1. D'autres techniques de microscopie optique de super-résolution comme l'épuisement d'émission stimulée (STED) microscopie 12 et photo-activation localisation microscopie (PALM) 12 ont été appliquées à l'imagerie des épines dendritiques. Méthodes basées sur la localisation, telles que PALM nécessitent très grand nombre d'images brutes pour atteindre la super-résolution et sont donc limités à la vitesse. D'autre part, STED peut atteindre une vitesse élevée d'imagerie, bien au nombre de photons relativement faibles et les petits champs de vision, ce qui peut ne pas être le cas pour la carte SIM 13.
Dans cet article, l'objectif est de fournir un protocole de travail à l'image épines dendritiques des neurones hippocampiques primaires de rat en culture in vitro </em> en utilisant la carte SIM. Le protocole se compose de deux phases distinctes: une première un composé d'établissement, le développement, la transfection et immunohistochimie des cultures de neurones de l'hippocampe de rat primaires et une phase tardive dédié à l'imagerie de l'échantillon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cet article, un protocole de travail à l'image épines dendritiques des neurones de l'hippocampe primaires de rat en culture in vitro en utilisant la carte SIM est décrit. Le procédé de culture des neurones hippocampiques primaires est une adaptation de la méthode originale décrite par Kaech Banker et 18. Les différences principales sont l'utilisation d'un milieu Neurobasal/B27 de culture, ce qui élimine la nécessité de cultures nourricières astrocytaires, et l'add…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par un H64.09.016 VIDI numéro de subvention de l'Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO) à CPF. CPF est reconnaissante au Dr A. Silvina Fratantoni pour ses commentaires critiques et corrections sur le manuscrit final. GMRDL / Emmm sont pris en charge par la Fondation de la technologie VAP néerlandais (de 12151 de projet et 11350), qui fait partie de la NWO, et qui est en partie financé par le ministère des Affaires économiques. Nous remercions Catherine Kitts-et-Peter Drent de Nikon Instruments Europe BV pour l'aide et le soutien. HX a été soutenue par l'Académie royale néerlandaise des arts et des sciences (subvention 11CDP10) et WT a été pris en charge par la subvention de l'Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (subvention 820.02.006).
Materials
| Fine forceps | |||
| Big forceps | |||
| Fine scissor | |||
| Big scissor | |||
| Blunt spatula | |||
| Dissecting microscope with illumination | |||
| Light microscope | |||
| 37 °C water bath | |||
| Laminar flow cell culture hood | |||
| High-temperature dry-oven | |||
| Bunsen burner | |||
| Cell culture incubator (5% CO2, 37 °C) | |||
| Microcentrifuge | |||
| Orbital shaker | |||
| Nikon structured illumination microscope setup consisting of: | |||
| Nikon Eclipse Ti research inverted microscope with Perfect Focus System | |||
| Nikon CFI Apo TIRF 100x oil objective lens (N.A. 1.49) | |||
| 4 Coherent Sapphire Lasers (458, 488, 514 and 561 nm exitation wavelength) | |||
| SIM Illuminator | |||
| Nikon Stage Controller | |||
| MCL Nano-Drive piezo controller | |||
| Nikon Intensilight C-HGFIE mercury lamp | |||
| SIM Microscope Enclosure temperature control | |||
| Andor EM-CCD Camera iXon DU897 | |||
| PC with Microsoft Windows 7 Home Edition | |||
| Nikon’s NiS Elements 6.14 SIM software package | |||
| Nikon type A immersion oil |
References
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