Imaging las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo de rata primaria utilizando Estructurado Iluminación Microscopía
Summary
En este artículo se describe un protocolo de trabajo para obtener imágenes de las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo in vitro utilizando Estructurado Iluminación Microscopía (SIM). Super-resolución de la microscopía utilizando SIM ofrece una resolución de imagen de manera significativa más allá del límite de difracción de la luz en las tres dimensiones espaciales, lo que permite la obtención de imágenes de las espinas dendríticas individuales con detalles mejorados.
Abstract
Las espinas dendríticas son protuberancias que salen de la dendrita de una neurona y representan los objetivos primarios postsinápticos excitatorios de entradas en el cerebro. Los avances tecnológicos han identificado estas estructuras como elementos clave de la conectividad neuronal y la plasticidad sináptica. El análisis cuantitativo de la morfología de la columna vertebral utilizando microscopía de luz sigue siendo un problema esencial debido a las limitaciones técnicas asociadas con límite de refracción intrínseca de la luz. Las espinas dendríticas pueden identificarse fácilmente por confocal de escaneo láser microscopía de fluorescencia. Sin embargo, la medición de los cambios sutiles en la forma y tamaño de las espinas es difícil debido a las dimensiones de la columna vertebral que no sean de longitud son generalmente más pequeñas que la resolución óptica convencional fijada por resolución límite teórico de la microscopía de luz de 200 nm.
Varias técnicas de resolución de súper desarrollados recientemente se han utilizado para imagen estructuras celulares más pequeños que los 200 nm, incluyendo las espinas dendríticas. Tstos técnicas se basan en operaciones de campo lejano clásicos y por lo tanto permiten el uso de los métodos existentes de preparación de muestras y para la imagen más allá de la superficie de una muestra. Descrito aquí es un protocolo de trabajo para aplicar la resolución estructurada de iluminación microscopía super (SIM) para la obtención de imágenes de las espinas dendríticas en cultivos de neuronas del hipocampo primaria. Posibles aplicaciones de SIM se solapan con las de microscopía confocal. Sin embargo, las dos técnicas presentan diferente aplicabilidad. SIM ofrece una resolución lateral efectiva más alta, mientras que la microscopía confocal, debido al uso de un agujero de alfiler física, logra una mejora de resolución a costa de la eliminación de fuera de la luz de enfoque. En este protocolo, las neuronas primarias se cultivan en cubreobjetos de vidrio utilizando un protocolo estándar, transfectadas con plásmidos de ADN que codifican proteínas fluorescentes y fotografiado usando SIM. Todo el protocolo descrito en el presente documento toma aproximadamente 2 semanas, porque las espinas dendríticas son imágenes después de 16-17 días in vitro, cuandodesarrollo dendrítico es óptima. Después de completar el protocolo, las espinas dendríticas pueden ser reconstruidos en 3D de la serie de SIM pilas de imágenes utilizando el software especializado.
Introduction
Una espina dendrítica es una pequeña protuberancia de la membrana de la neurona. Esta estructura característica está especializada para recibir normalmente el aporte de una sola sinapsis y representa el área de contacto físico entre dos neuronas. La mayoría de las espinas dendríticas funcionalmente maduros consisten en una punta globular, jefe llamado, y un cuello delgado que conecta la cabeza con el árbol dendrítico. Sin embargo, las espinas no son estáticos y se mueven y cambian su morfología continuamente, incluso en el cerebro adulto 2 activa. Dentro de un período de 2 semanas de tiempo, cultivos de neuronas del hipocampo de rata primaria derivados de tarde tiempo postnatal embrionario o temprano desarrollan árboles dendríticos complejos con numerosas protuberancias de la membrana que evolucionan a partir filipodia pronto para estructuras de la columna vertebral como 3. Sobre la base de este comportamiento dinámico y otras características, se cree que las espinas dendríticas para proporcionar un sustrato anatómico para el almacenamiento de memoria y 4,5 transmisión sináptica.
Dada ªe papel crítico que el tamaño de la espina dendrítica y la forma han en la función sináptica, es importante medir con precisión sus dimensiones. Espinas varían de alrededor de 200 a 2000 nanómetros de longitud y pueden ser identificados fácilmente por confocal de escaneo láser microscopía de fluorescencia. Sin embargo, las dimensiones de la columna vertebral que no sean de longitud están por debajo de la resolución de los sistemas ópticos convencionales ", teóricamente fijado por la difracción en torno a 200 nanómetros 6. Estos poderes resolver son insuficientes para obtener imágenes de detalles más finos, tales como la anchura de los cuellos de la columna vertebral y la cabeza. Mucho trabajo se ha dedicado a resolver este problema y muchas técnicas relativamente nuevas de super-resolución de microscopía han proporcionado avances sustanciales. En particular, es posible conseguir una resolución más allá del límite clásico sin descartar ninguna emisión de luz mediante el uso de microscopía de iluminación estructurada lateralmente (SIM) en un campo amplio, microscopio confocal no 7-10. El uso de esta técnica en combinación con la no lineatécnicas de microscopía r, es teóricamente posible mejorar la resolución lateral del microscopio óptico por un factor de 11 sin límite. Sin embargo, en la mayoría de circunstancias experimentales, SIM permite superar el límite de resolución en un factor de dos 1. Otras técnicas de microscopía óptica super-resolución, tales como el agotamiento de emisión estimulada (STED) microscopía 12 y foto-activación de localización de microscopía (PALM) 12 se han aplicado a las imágenes de las espinas dendríticas. Los métodos basados en localización como la palma requieren un gran número de imágenes en bruto para conseguir super-resolución y por lo tanto están limitados en velocidad. Por otro lado, STED puede conseguir una elevada velocidad de imagen, aunque en el recuento de fotones relativamente bajos y los pequeños campos de visión, que puede no ser el caso para SIM 13.
En este artículo, el objetivo es proporcionar un protocolo de trabajo para obtener imágenes de las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo primaria de rata en cultivo in vitro </em> usando SIM. El protocolo consiste en dos fases: una distinguibles uno inicial que consiste de establecimiento, el desarrollo, la transfección y la inmunohistoquímica de cultivos de neuronas primarias del hipocampo de rata y una fase tardía dedicado a la muestra de imágenes.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este artículo se describe un protocolo de trabajo para obtener imágenes de las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo de rata en cultivo primario in vitro utilizando SIM. El método de cultivo de neuronas del hipocampo primaria es una adaptación del método original descrito por Banker Kaech y 18. Las diferencias principales son el uso de medio Neurobasal/B27 cultura, lo que elimina el requisito de las culturas de alimentación astroglial, y la adición de la FUDR inhibidor mitótic…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por una subvención número H64.09.016 VIDI de la Organización Holandesa para la Investigación Científica (NWO) a la ACB. CPF agradece a la Dra. Silvina A. Fratantoni por sus comentarios críticos y correcciones en el manuscrito final. GMRDL / EMMM son apoyados por la Fundación de Tecnología STW holandés (12151 proyecto y 11350), que forma parte del Nuevo Orden Mundial, y que es financiado en parte por el Ministerio de Asuntos Económicos. Agradecemos a la Catalina Kitts y Peter Drent de Nikon Instruments Europe BV de asistencia y apoyo. HX fue apoyada por la Real Academia Holandesa de Artes y Ciencias (subvención 11CDP10) y WT recibió el apoyo de subvención a la Organización Holandesa para la Investigación Científica (subvención 820.02.006).
Materials
| Fine forceps | |||
| Big forceps | |||
| Fine scissor | |||
| Big scissor | |||
| Blunt spatula | |||
| Dissecting microscope with illumination | |||
| Light microscope | |||
| 37 °C water bath | |||
| Laminar flow cell culture hood | |||
| High-temperature dry-oven | |||
| Bunsen burner | |||
| Cell culture incubator (5% CO2, 37 °C) | |||
| Microcentrifuge | |||
| Orbital shaker | |||
| Nikon structured illumination microscope setup consisting of: | |||
| Nikon Eclipse Ti research inverted microscope with Perfect Focus System | |||
| Nikon CFI Apo TIRF 100x oil objective lens (N.A. 1.49) | |||
| 4 Coherent Sapphire Lasers (458, 488, 514 and 561 nm exitation wavelength) | |||
| SIM Illuminator | |||
| Nikon Stage Controller | |||
| MCL Nano-Drive piezo controller | |||
| Nikon Intensilight C-HGFIE mercury lamp | |||
| SIM Microscope Enclosure temperature control | |||
| Andor EM-CCD Camera iXon DU897 | |||
| PC with Microsoft Windows 7 Home Edition | |||
| Nikon’s NiS Elements 6.14 SIM software package | |||
| Nikon type A immersion oil |
References
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