Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

الغضروف الإنسان الأنسجة التصنيع باستخدام ثلاثي الأبعاد تكنولوجيا الطباعة النافثة للحبر

Published: June 10, 2014 doi: 10.3791/51294
Automatic Translation
*1,2,3, *2,4, 5,6, 1
1Department of Biomedical Engineering, Rensselaer Polytechnic Institute, 2Stemorgan Inc., 3Institute of Advanced Study, Technical University of Munich, 4Institute of Virology, School of Medicine, Wuhan University, 5Department of Molecular and Experimental Medicine, The Scripps Research Institute, 6Research Institute for Biomedical Sciences, Tokyo University of Science
* These authors contributed equally

Summary

الأساليب المذكورة في هذه الورقة تبين كيفية تحويل طابعة نافثة للحبر التجارية في وقت واحد مع bioprinter البلمرة الأشعة فوق البنفسجية. الطابعة قادرة على بناء هيكل الأنسجة 3D مع الخلايا والحيوية. أظهرت الدراسة هنا شيدت neocartilage 3D.

Abstract

Bioprinting، الذي يقوم على أساس الحرارية الطباعة النافثة للحبر، هي واحدة من التكنولوجيات التمكينية الأكثر جاذبية في مجال هندسة الأنسجة والطب التجديدي. مع خلايا التحكم الرقمي، السقالات، وعوامل النمو يمكن أن تودع على وجه التحديد إلى المطلوب ثنائي الأبعاد (2D) وثلاثي الأبعاد (3D) مواقع بسرعة. وبالتالي، فإن هذه التكنولوجيا هو النهج المثالي لصنع أنسجة محاكاة الهياكل التشريحية الأصلية الخاصة بهم. من أجل مهندس الغضروف مع منظمة الأم مناطقية، وتكوين المصفوفة خارج الخلية (ECM)، والخواص الميكانيكية، قمنا بتطوير منصة bioprinting باستخدام طابعة نافثة للحبر التجارية مع بلمرة ضوئية المنشأ في وقت واحد قادر على 3D غضروف هندسة الأنسجة. طبعت غضروفية الإنسان معلقة في بولي (جلايكول الإثيلين) diacrylate (PEGDA) ل 3D البناء neocartilage عبر طبقة تلو طبقة التجمع. تم إصلاح الخلايا المطبوعة على مواقع المودعة الأصلية، بدعم من surroاوندينج السقالة في بلمرة ضوئية المنشأ في وقت واحد. كانت الخواص الميكانيكية للأنسجة مطبوعات مماثلة إلى الغضروف الأصلي. بالمقارنة مع تصنيع الأنسجة التقليدية، الأمر الذي يتطلب وقتا أطول من التعرض للأشعة فوق البنفسجية، وكان بقاء الخلايا المطبوعة مع بلمرة ضوئية المنشأ في وقت واحد أعلى بكثير. أظهرت neocartilage المطبوعة جلايكان ممتاز (GAG) وإنتاج الكولاجين نوع الثاني، وهو ما يتسق مع التعبير الجيني. وبالتالي، هذه المنصة مثالية للتوزيع الخلية دقيقة والترتيب لهندسة الأنسجة التشريحية.

Introduction

Bioprinting استنادا الحرارية الطباعة النافثة للحبر هي واحدة من التقنيات تمكن الواعدة في مجال هندسة الأنسجة والطب التجديدي. مع التحكم الرقمي وإنتاجية عالية رؤوس الطباعة العوامل الخلايا، السقالات، والنمو يمكن أن تودع على وجه التحديد إلى المطلوب ثنائي الأبعاد (2D) وثلاثي الأبعاد (3D) مواقف بسرعة. وقد تم تحقيق العديد من التطبيقات الناجحة في استخدام هذه التكنولوجيا في هندسة الأنسجة والطب التجديدي 1-9. في هذه الورقة، تم إنشاء منصة bioprinting مع تعديل هيوليت باكارد (HP) منضدية 500 طابعة نافثة للحبر الحرارية ونظام بلمرة ضوئية المنشأ في وقت واحد. وقد أظهرت الهلاميات المائية الاصطناعية وضعت من بولي (جلايكول الإثيلين) (PEG) قدرة الحفاظ على استمرارية خلية غضروفية وتشجيع الإنتاج ECM مكون للغضروف 10،11. بالإضافة إلى ذلك، photocrosslinkable PEG قابل للذوبان في الماء بدرجة كبيرة مع اللزوجة المنخفضة، مما يجعلها مثالية لالبوليمر في وقت واحدrization خلال 3D bioprinting. في هذه الورقة، غضروفية الإنسان معلقة في بولي (الاثيلين) diacrylate غليكول (PEGDA؛ ميغاواط 3،400) وطبعت على وجه التحديد لبناء neocartilage طبقة تلو طبقة مع 1،400 نقطة في البوصة القرار في 3D. ولوحظ توزيع متجانس من الخلايا المودعة في سقالة 3D، والتي ولدت الأنسجة الغضروف مع خصائص ميكانيكية ممتازة وتعزيز الإنتاج ECM. على النقيض من ذلك، في تلفيق دليل الخلايا المتراكمة في الجزء السفلي من هلام بدلا من مواقفها المودعة في البداية بسبب تباطؤ البلمرة السقالة، مما أدى إلى تكوين الغضاريف غير متجانسة بعد 2،3 الثقافة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إنشاء منصة Bioprinting

واستند التعديل الطابعة على طابعة HP Deskjet 500 الحرارية طابعة نافثة للحبر وHP 51626A خرطوشة الحبر الأسود.

  1. إزالة الغطاء البلاستيك العلوي من الطابعة وفصل بعناية لوحة التحكم من الغطاء.
  2. فصل توصيلات الكابلات 3 بين أعلى جزء الطابعة والقاعدة. إزالة جزء أعلى الطابعة من القاعدة.
  3. على الجزء العلوي الطابعة، وإزالة البلاستيك الصغيرة والاكسسوارات المطاط (نظام تنظيف رأس الطباعة) في الجهة اليمنى تحت خرطوشة الحبر.
  4. إزالة قاعدة درج الورق مع الينابيع.
  5. إزالة لوحة معدنية تغطي شريط التغذية ورقة من البلاستيك.
  6. قطع شريط التغذية ورقة من البلاستيك في موقف عجلة التغذية المتوسطة باستخدام منشار اليد أو غيرها من أدوات القطع.
  7. إزالة العجلات تغذية الورق 2 يتعرض بعد الخطوة السابقة. البلاستيك عجلة من الصعب جدا والإلكترونيةورأى أن تكون مفيدة.
  8. تنظيف الغبار والحطام باستخدام مناديل الهواء والإيثانول المعلبة.
  9. نعلق أعلى جزء الطابعة إلى القاعدة.
  10. الأشعة فوق البنفسجية تعقيم الطابعة تعديل لا يقل عن 2 ساعة في غطاء تدفق الصفحي قبل استخدام.
  11. قطع الغطاء من خرطوشة الحبر 51626A HP باستخدام منشار اليد أو غيرها من أدوات القطع.
  12. إفراغ الحبر وإزالة عامل التصفية التي تغطي الخزان جيدا السفلي من الغضروف.
  13. شطف جيدا باستخدام خرطوشة تشغيل ماء الصنبور.
  14. Ultrasonicate خرطوشة في غير المتأينة (DI) الماء لمدة 10 دقيقة لإزالة الحبر المتبقية.
  15. فحص خرطوشة للتأكد من تمت إزالة جميع الحبر. شطف أو رذاذ خرطوشة تماما مع الايثانول 70٪ لتعقيم، تليها تعقيم المياه DI.
  16. انشاء مصباح الأشعة فوق البنفسجية طويلة الموجة الإفراط في منصة الطباعة لتوفير القدرة بلمرة ضوئية المنشأ في وقت واحد.
  17. قياس كثافة الأشعة فوق البنفسجية في منصة الطباعة باستخدام الأشعة فوق البنفسجيةمتر. ضبط المسافة بين مصباح الأشعة فوق البنفسجية ومنصة الطابعة بحيث كثافة في موضوع الطباعة ما بين 4-8 ميغاواط / سم 2 (حوالي 25 سم من مصباح إلى منصة الطابعة).

2. إعداد Bioink

  1. التوسع أحادي الطبقة خلية غضروفية
    1. لوحة 5 ملايين غضروفية الإنسان في كل T175 الأنسجة قارورة الثقافة للتوسع خلية في Dulbeccos التعديل النسور متوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل العجل و 1X البنسلين الستربتوميسين-الجلوتامين (باريس سان جيرمان). خلايا الثقافة في 37 درجة مئوية مع ترطيب الهواء تحتوي على 5٪ CO 2. تغيير ثقافة المتوسط ​​كل 3 أيام حتى القارورة هي 85٪ التقاء. استخدام خلايا من نفس الممر.
  2. حل PEGDA في برنامج تلفزيوني إلى تركيز النهائي من 10٪ ث / ضد إضافة photoinitiator I-2959 لتركيز النهائي من 0.05٪ ث / ضد تصفية تعقيم الحل.
  3. تعليق غضروفية الإنسان المثقف في حل PEGDA أعدت في 5 × 10 6 خلية / مل.

3. الأنسجة الغضروف الطباعة

  1. تشغيل الطابعة والكمبيوتر المحمول.
  2. خلق نمط الطباعة دائرة متينة مع 4 مم وقطرها باستخدام Microsoft Word أو أدوبي فوتوشوب.
    1. ضبط الموقف من نمط وتأكد من أنه سيتم طباعة بالضبط في قالب من البلاستيك.
    2. حساب عدد من المطبوعات اللازمة للوصول إلى سمك المطلوب من السقالة. لمدة 4 مم في الارتفاع، ويطلب 220 يطبع لإنشاء سقالة المطلوب.
  3. تحميل bioink في خرطوشة الحبر. تغطية خرطوشة مع رقائق الألومنيوم للحماية من التعرض للأشعة فوق البنفسجية مباشرة أثناء الطباعة.
  4. إرسال أمر طباعة إلى الطابعة. سحب ورقة الاستشعار عند بدء تشغيل الطابعة لطباعة. عملية الطباعة بأكملها ينبغي أن تأخذ أقل من 4 دقائق لالسقالة مع 4 مم وقطرها 4 مم في الارتفاع.
  5. نقل المطبوعة neocartilage إلى 24 لوحة جيدا وإضافة 1.5 مل مستنبت إلى كل بئر.

ق = "jove_title"> 4. بقاء الخلية التقييم في 3D سقالة

  1. احتضان neocartilage المطبوعة في لايف / الميت الجدوى / السمسة الحل تعمل في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة في الظلام.
  2. قطع هيدروجيل خلية لادن في النصف والتقاط صور الفلورسنت من منطقة القطع.
  3. عد حي (الخضراء) والخلايا الميتة (الحمراء) من قبل مراقب أعمى في خمسة الصور التي التقطت بشكل عشوائي. حساب بقاء الخلية عن طريق قسمة عدد من الخلايا الحية من العدد الكلي للخلايا الحية والميتة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كان طابعة نافثة للحبر الحرارية قادرة على تعديل الخلايا وترسب السقالة في إنتاجية عالية وبقاء الخلية ممتازة. الجمع مع بلمرة ضوئية المنشأ في وقت واحد والحيوية للضوء، وهذه التكنولوجيا قادرة على إصلاح الخلايا والمواد المطبوعة الأخرى إلى مواقع المودعة في البداية. وفقا لخصائص الطابعة النافثة للحبر الحرارية تعديل، وكان القرار 300 نقطة في البوصة الطباعة 2D مع حجم قطرة الحبر واحد من 130 رر. هناك 50 فتحات إطلاق النار في كل رأس الطباعة مع تردد 3.6 كيلو هرتز اطلاق 12،13. وبالتالي لبناء ممثل 4 مم و 4 مم ارتفاع، وحجم وسمك كل طبقة المطبوعة خلال طبقة تلو طبقة البناء كانت 0.23 ميكرولتر و 18 ميكرون، على التوالي. استغرق عملية الطباعة بأكملها أقل من 4 دقائق لبناء الأنسجة الغضروف (الشكل 1).

ويبين الشكل 2A التوزيع الخلية حتى من قميتيد غضروفية في 3D السقالة بسبب بلمرة ضوئية المنشأ في وقت واحد من السقالة المحيطة خلال ترسب الخلايا. على النقيض من ذلك، دون بلمرة ضوئية المنشأ في وقت واحد (السقالة بلمرة بعد البذر الخلية)، غرقت الخلايا المودعة إلى أسفل أو واجهة منطقتين بدلا من مواقعها المودعة في البداية بسبب الجاذبية (الشكل 2B). وقد لوحظ هذا التراكم الخلية أيضا في تقارير سابقة من تلفيق دليل من الغضروف نسيج 14،15. وغضروفية الإنسان المطبوعة في 3D PEG هيدروجيل تعافى النمط الظاهري مكون للغضروف وأظهرت زيادة الإنتاج تدريجيا بروتيوغليكان خلال ثقافة (الشكل 3) 3.

الشكل 1
الشكل 1. مطبوعة الأنسجة neocartilage. أ) رسم تخطيطي للغضروف bioprinting مع بلمرة ضوئية المنشأ في وقت واحد، ووضعإيه تلو طبقة التجمع. B) A المطبوعة الأنسجة neocartilage مع 4 مم وقطرها 4 مم في الارتفاع. مقياس بار = 2 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. أظهرت غضروفية المسمى مع الأصباغ الفلورية الخضراء والبرتقال الغضروف منطقتين bioprinting جدوى. أ) الحفاظ على خلايا مطبوعة مواقفها المودعة في البداية في هيدروجيل 3D. عملية الطباعة وبلمرة ضوئية المنشأ أنجزت في 4 دقائق مع بقاء الخلية من 90٪ (ن = 3). ب) الخلايا المتراكمة إلى أسفل أو واجهة بسبب الجاذبية دون بلمرة ضوئية المنشأ في وقت واحد. استغرق الأمر 10 دقيقة من التعرض للأشعة فوق البنفسجية إلى هلام في بناء مع نفس الحجم من A مع بقاء الخلية من63٪ (ن = 3). أشرطة النطاق = 100 ميكرومتر.

الرقم 3
الرقم 3. تلطيخ Safranin-O من غضروفية المطبوعة في المعارض هيدروجيل PEG زيادة الإنتاج بروتيوغليكان خلال الثقافة. أشرطة النطاق = 100 ميكرومتر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هذا النظام bioprinting 3D مع القدرة بلمرة ضوئية المنشأ في وقت واحد يوفر دقة أكبر بكثير من الطباعة أفضل طريقة ذكرت سابقا الطباعة الموضع من العيوب العظمية الغضروفية باستخدام حقنة مقذوف من الجينات الخلوية هيدروجيل 16 في. قرار الطباعة أعلى أمر بالغ الأهمية ولا سيما بالنسبة للغضروف هندسة الأنسجة لاستعادة الغضروف تنظيم منطقتين التشريحية. بلمرة ضوئية المنشأ في وقت واحد خلال طبقة تلو طبقة التجمع أمر بالغ الأهمية للحفاظ على ترسب الدقيق للخلايا والسقالات مادة بيولوجية لبناء 3D. أدى التصنيع الدقيق مع كل طبقة المطبوعة أيضا في الانتقال السلس بين طبقات مناطقية، والتقليل من احتمالات تدهور بسبب التبطين. على وجه التحديد عن طريق تعديل المعلمات bioprinting ومكونات bioink، فإننا سوف تكون قادرة على افتعال هياكل 3D المعقدة المطلوبة للشفاء طائفة واسعة من الآفات الغضروف.

مع المتزامنةrgistic التحفيز عامل النمو، وكان neocartilage bioprinted أفضل النمط الظاهري مكون للغضروف والأكثر انتشار الخلايا 3. وبالتالي، فإن كثافة البذر الخلايا المستخدمة في هذه الدراسة، والتي هي مجدية لbioprinting، هي أيضا مثالية لتجديد الغضاريف عندما تعامل مع عوامل النمو المناسبة. إصلاح الغضروف باستخدام غضروفية ذاتي يقتصر إلى حد كبير في التطبيقات السريرية ويرجع ذلك إلى عدد محدود من غضروفية تحصد في الخزعة. غرس غضروفية ذاتي حصادها مباشرة أو الخلايا الجذعية الوسيطة (اللجان الدائمة) جنبا إلى جنب مع المواد الحيوية لإصلاح الغضروف دون التوسع أحادي الطبقة جذابة للغاية. لذا، فمن الأهمية بمكان لتوسيع أعداد الخلايا المطبوعة إلى كثافة الخلية المثلى المطلوبة لتشكيل الغضروف دون المساس بنوعية المصفوفة الغضروف نظرا للأعداد الخلايا محدودة. وعلاوة على ذلك، والحد من كثافة الخلية الأولي وتحسين بشكل كبير وتحقيق أقصى قدر من القرار bioprinting. وبالتالي، فإن bioprinطريقة تينغ الموصوفة هنا هي متوافقة تماما مع أرقام الخلية منخفضة في إعداد سريرية ولديه القدرة لاستخدامها في غضروف هندسة الأنسجة.

في الختام، يوضح عملنا جدوى افتعال الهياكل التشريحية الغضروف من خلال تقديم غضروفية ومواد بيولوجية السقالة في مناصب المستهدفة دقيقة. A هيدروجيل PEG مع غضروفية الإنسان وbioprinted باستمرار عبر طبقة تلو طبقة التجمع. حافظت بلمرة ضوئية المنشأ في وقت واحد الخلايا المطبوعة على مواقع المودعة الأولية وانخفاض الضيائية. الحفاظ على الخلايا في neocartilage المطبوعة النمط الظاهري مكون للغضروف مع التعبير الجيني ثابت وتحليل الكيمياء الحيوية 2. وبالتالي، فإن هذه التكنولوجيا يمثل تقدما واعدا لالتشريحية غضروف هندسة الأنسجة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم مصلحة مالية في هذه الدراسة.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أنوه بدعم من نيويورك منطقة العاصمة التحالف بحوث غرانت.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HP Deskjet 500 thermal inkjet printer Hewlett-Packard C2106a Discontinued. Purchased refurbished from internet vendor.
HP black ink cartridge Hewlett-Packard 51626a
Ultraviolet lamp UVP B-100AP
UV light meter General Tools UV513AB
Zeiss LSM 510 laser scanning microscope Carl Zeiss LSM 510
Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) Mediatech 10-013
Penicillin-streptomycin-glutamine (PSG) Invitrogen 10378-016
Accutase cell dissociation reagent Invitrogen A11105-01
Phosphate buffered saline (PBS) Invitrogen 10010-023
Live/Dead viability/cytotoxicity Kit Invitrogen L-3224
Poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) Glycosan Biosystems GS700
Irgacure 2959 Ciba Specialty Chemicals I-2959
Human articular chondrocytes Lonza CC-2550

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cui, X., Boland, T. Human microvasculature fabrication using thermal inkjet printing technology. Biomaterials. 30, 6221-6227 (2009).
  2. Cui, X., Breitenkamp, K., Finn, M. G., Lotz, M., D'Lima, D. D. Direct human cartilage repair using three-dimensional bioprinting technology. Tissue Eng Part A. 18, 1304-1312 (2012).
  3. Cui, X., Breitenkamp, K., Lotz, M., D'Lima, D. Synergistic action of fibroblast growth factor-2 and transforming growth factor-beta1 enhances bioprinted human neocartilage formation. Biotechnol. Bioeng. 109, 2357-2368 (2012).
  4. Cui, X., Breitenkamp, K., Finn, M. G., Lotz, M., Colwell, C. W. Direct human cartilage repair using thermal inkjet printing technology. Osteoarthritis and Cartilage. 19, (2011).
  5. Cui, X., Boland, T. Simultaneous deposition of human microvascular endothelial cells and biomaterials for human microvasculature fabrication using inkjet printing. NIP24/digital Fabrication 2008: 24th International Conference on Digital Printing Technologies, Technical Program and Proceedings. 24, 480-483 (2008).
  6. Cui, X., Dean, D., Ruggeri, Z. M., Boland, T. Cell damage evaluation of thermal inkjet printed Chinese hamster ovary cells. Biotechnol. Bioeng. 106, 963-969 (2010).
  7. Cui, X., Hasegawa, A., Lotz, M., D'Lima, D. Structured three-dimensional co-culture of mesenchymal stem cells with meniscus cells promotes meniscal phenotype without hypertrophy. Biotechnol. Bioeng. 109, 2369-2380 (2012).
  8. Cui, X., Gao, G., Qiu, Y. Accelerated myotube formation using bioprinting technology for biosensor applications. Biotechnol. Lett. 35, 315-321 (2013).
  9. Cui, X., Boland, T., D'Lima, D. D., Lotz, M. K. Thermal inkjet printing in tissue engineering and regenerative medicine. Recent Pat Drug Deliv Formul. 6, 149-155 (2012).
  10. Bryant, S. J., Anseth, K. S. Hydrogel properties influence ECM production by chondrocytes photoencapsulated in poly(ethylene glycol) hydrogels. Journal of Biomedical Materials Research. 59, 63-72 (2002).
  11. Elisseeff, J., et al. Photoencapsulation of chondrocytes in poly(ethylene oxide)-based semi-interpenetrating networks. Journal of Biomedical Materials Research. 51, 164-171 (2000).
  12. Buskirk, W. A., et al. Development of A High-Resolution Thermal Inkjet Printhead. Hewlett-Packard Journal. 39, 55-61 (1988).
  13. Harmon, J. P., Widder, J. A. Integrating the Printhead Into the HP Deskjet Printer. Hewlett-Packard Journal. 39, 62-66 (1988).
  14. Kim, T. K., et al. Experimental model for cartilage tissue engineering to regenerate the zonal organization of articular cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 11, 653-664 (2003).
  15. Sharma, B., et al. Designing zonal organization into tissue-engineered cartilage. Tissue Engineering. 13, 405-414 (2007).
  16. Cohen, D. L., Lipton, J. I., Bonassar, L. J., Lipson, H. Additive manufacturing for in situ repair of osteochondral defects. Biofabrication. 2, (2010).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 88، الغضروف، والطباعة النافثة للحبر، غضروفية، هيدروجيل، بلمرة ضوئية المنشأ، هندسة الأنسجة
الغضروف الإنسان الأنسجة التصنيع باستخدام ثلاثي الأبعاد تكنولوجيا الطباعة النافثة للحبر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cui, X., Gao, G., Yonezawa, T., Dai, … More

Cui, X., Gao, G., Yonezawa, T., Dai, G. Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology. J. Vis. Exp. (88), e51294, doi:10.3791/51294 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter