Summary
Os métodos descritos neste trabalho mostram como converter uma impressora jato de tinta comercial em um bioprinter com polimerização UV simultânea. A impressora é capaz de construir a estrutura do tecido 3D com células e biomateriais. O estudo demonstrou aqui construiu uma neocartilage 3D.
Abstract
Bioprinting, que está baseada na impressão a jato de tinta térmica, é um dos mais atraentes tecnologias facilitadoras no campo da engenharia de tecidos e medicina regenerativa. Com as células de controlo digitais, os suportes, e os factores de crescimento podem ser depositada precisamente a desejada bidimensional (2D) e os locais (3D) tridimensional rapidamente. Portanto, essa tecnologia é uma abordagem ideal para fabricar tecidos que imitam suas estruturas anatômicas nativas. Para o engenheiro da cartilagem com organização nativa zonal, composição da matriz extracelular (MEC), e as propriedades mecânicas, desenvolvemos uma plataforma bioprinting usando uma impressora jato de tinta comercial com fotopolimerização simultânea capaz de engenharia de tecidos de cartilagem 3D. Condrócitos humanos suspensas em poli (etileno glicol) Diacrilato (PEGDA) foram impressos para a construção neocartilage 3D via montagem camada por camada. As células foram fixadas impressos nas suas posições originais depositados, suportado pelo surroFINANCIAMENTO andaime em fotopolimerização simultânea. As propriedades mecânicas do tecido impresso foi semelhante à cartilagem nativa. Em comparação com a fabricação do tecido convencional, a qual requer a exposição de UV mais, a viabilidade das células impressos com fotopolimerização simultânea foi significativamente maior. Neocartilage impresso demonstraram excelente glicosaminoglicanos (GAG) e a produção de colagénio de tipo II, o que era consistente com a expressão do gene. Portanto, esta plataforma é ideal para distribuição célula precisa e arranjo para a engenharia de tecidos anatômico.
Introduction
Bioprinting baseada na impressão a jato de tinta térmica é uma das mais promissoras tecnologias de base no campo da engenharia de tecidos e medicina regenerativa. Com controle digital e alto rendimento cabeças fatores células, andaimes e crescimento podem ser precisamente depositado ao desejado bidimensional (2D) e posições (3D) tridimensionais rapidamente. Muitas aplicações de sucesso foram alcançados utilizando esta tecnologia em engenharia de tecidos e medicina regenerativa 1-9. Neste trabalho, uma plataforma bioprinting foi criada com a Hewlett-Packard (HP) Deskjet 500 impressora jato de tinta térmica modificado e um sistema de fotopolimerização simultânea. Hidrogéis sintéticas formuladas a partir de poli (etileno glicol) (PEG) revelaram a capacidade de manter a viabilidade dos condrócitos e promover a produção de ECM condrogénica 10,11. Além disso, a foto-reticulável PEG é altamente solúvel em água, de baixa viscosidade, o que o torna ideal para polímeros usados em simultâneozação durante bioprinting 3D. Neste trabalho, os condrócitos humanos suspensas em poli (etileno) diacrilato glicol (PEGDA; MW 3.400) foram precisamente impresso para construir neocartilage camada por camada, com 1.400 dpi de resolução em 3D. Observou-se distribuição homogênea de células depositadas em um andaime 3D, o que gerou tecido cartilaginoso, com excelentes propriedades mecânicas e produção ECM reforçada. Por contraste, na fabricação manual, as células acumuladas na parte inferior do gel, em vez das suas posições inicialmente depositadas, devido à lenta polimerização andaime, o que levou a formação de cartilagem não homogénea após cultura 2,3.
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Protocol
1. Bioprinting Plataforma Estabelecimento
A modificação de impressora foi baseada em uma impressora jato de tinta térmica HP Deskjet 500 e HP 51626A cartucho de tinta preta.
- Remova a tampa plástica superior da impressora e cuidadosamente retire o painel de controle a partir da tampa.
- Retire os 3 conexões de cabo entre a parte superior da impressora e base. Remova a parte superior da impressora a partir da base.
- Na parte superior da impressora, remova o pequeno plástico e acessórios de borracha (sistema de limpeza da cabeça de impressão) no lado direito sob o cartucho de tinta.
- Retire a base da bandeja de papel, com molas.
- Remova a placa metálica que cobre a barra de alimentação de papel de plástico.
- Corte a barra de alimentação de papel de plástico na posição da roda de alimentação meio usando uma serra de mão ou outra ferramenta de corte.
- Retire os 2 rodas de alimentação de papel expostos depois da etapa anterior. O plástico roda é muito difícil e um eletrônicoserra será útil.
- Limpe a poeira e detritos usando lenços de ar e etanol enlatados.
- Prenda a parte superior da impressora para a base.
- UV esterilizar a impressora modificada para, pelo menos, 2 horas numa câmara de fluxo laminar antes de usar.
- Corte a tampa de um cartucho de tinta HP 51626A usando um serrote ou outra ferramenta de corte.
- Esvaziar a tinta e remover o filtro que cobre o poço reservatório inferior da cartilagem.
- Lavar o cartucho cuidadosamente, com água corrente.
- Ultrasonicate o cartucho no desionizada (DI) de água durante 10 minutos para remover a tinta residual.
- Examinar o cartucho para certificar-se que toda a tinta foi removida. Lavar ou pulverizar o cartucho cuidadosamente com etanol a 70% para a esterilização, seguido por água DI esterilizado.
- Configurar uma lâmpada ultravioleta de longo comprimento de onda sobre a plataforma de impressão para fornecer capacidade de fotopolimerização simultânea.
- Medir a intensidade UV a uma plataforma da impressão utilizando uma luz UVmetros. Ajustar a distância entre a lâmpada de UV e a plataforma de impressora, de modo a intensidade para o objecto de impressão é entre 4-8 mW / cm2 (cerca de 25 cm de distância da lâmpada para a plataforma de impressora).
2. Bioink Preparação
- Expansão monocamada de condrócitos
- Placa 5.000.000 condrócitos humanos em cada balão de cultura de tecidos T175 por expansão das células em Dulbeccos Modified Eagles Médium (DMEM) suplementado com 10% de soro de vitela e 1x penicilina-estreptomicina-glutamina (PSG). As células de cultura a 37 ° C com ar humidificado contendo 5% de CO 2. Altere o meio de cultura a cada 3 dias até que o frasco é de 85% de confluência. Use células da mesma passagem.
- Dissolver PEGDA em PBS para uma concentração final de 10% w / v Adicionar fotoiniciador I-2959 a uma concentração final de 0,05% w / v Filtrar esterilizar a solução.
- Suspender condrócitos humanos cultivados na solução PEGDA preparado a 5 x 10 6 células /ml.
3. Cartilagem de tecido de impressão
- Ligue a impressora e laptop.
- Criar um padrão de impressão de um círculo sólido com 4 mm de diâmetro, utilizando o Microsoft Word ou Adobe Photoshop.
- Ajuste a posição do padrão e verifique se ele será impresso exatamente no molde plástico.
- Calcule o número de cópias necessárias para atingir a espessura desejada de andaime. Para 4 mm de altura, 220 impressões são necessários para criar o andaime desejado.
- Carregue o bioink para o cartucho de tinta. Cubra o cartucho com papel alumínio para proteger da exposição UV direto durante a impressão.
- Enviar comando de impressão para a impressora. Puxe o sensor de papel quando a impressora começa a imprimir. O processo de impressão de todo deve ter menos do que 4 minutos para um andaime com 4 mm de diâmetro e 4 mm de altura.
- Transferência impresso neocartilage para uma placa de 24 cavidades e adicionar 1,5 ml de meio de cultura a cada poço.
- Incubar a neocartilage impresso no VIVO / solução de trabalho MORTOS viabilidade / citotoxicidade em temperatura ambiente por 15 min no escuro.
- Corte o hidrogel célula-laden ao meio e tirar imagens fluorescentes de área de corte.
- Contagem vivo (verde) e as células mortas (vermelho) por um observador cego em cinco imagens tiradas aleatoriamente. Calcular a viabilidade celular através da divisão do número de células vivas pelo número total de células vivas e mortas.
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Representative Results
A impressora jato de tinta térmica modificado foi capaz para celular e deposição de andaime no alto rendimento e excelente viabilidade celular. Combinando com fotopolimerização simultânea e biomateriais fotossensíveis, esta tecnologia é capaz de corrigir as células e outras substâncias impressos para os locais inicialmente depositados. De acordo com as propriedades da impressora a jacto de tinta térmica modificada, a resolução de impressão 2D foi 300 dpi com um único volume de gota de tinta de 130 pl. Existem 50 bicos de disparo em cada cabeçote de impressão com freqüência de disparo 3,6 kHz 12,13. Portanto, para uma construção de representante, de 4 mm de diâmetro e 4 mm de altura, o volume e espessura de cada camada impressa durante a construção da camada-por-camada foram 0,23 ul e 18 mM, respectivamente. Todo o processo de impressão foi de menos de 4 minutos para construir o tecido de cartilagem (Figura 1).
Figura 2A mostra uma distribuição das células até mesmo de princípiosted condrócitos em arcabouço 3D devido a fotopolimerização simultânea do andaime circundante durante a deposição de células. Por outro lado, sem fotopolimerização simultânea (polimerizado andaime após a semeadura de células), as células depositadas afundou para o fundo ou interface zonal em vez de suas posições inicialmente depositados devido à gravidade (Figura 2B). Esta acumulação de células foi também observada em relatórios anteriores de fabricação manual do tecido de cartilagem 14,15. Os condrócitos humanos impressos em 3D PEG hidrogel recuperado fenótipo condrogénica e demonstraram um aumento da produção de proteoglicano gradualmente durante a cultura (Figura 3) 3.
Figura 1. Impresso tecido neocartilage. A) Esquema de cartilagem bioprinting com fotopolimerização simultânea e leigostecido neocartilage montagem er-por-camada. B) Um impresso com 4 mm de diâmetro e 4 mm de altura. Scale Bar = 2 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Condrócitos marcados com corantes fluorescentes verde e laranja demonstraram o zonal cartilagem bioprinting viabilidade. A) células impressos mantiveram suas posições inicialmente depositadas no hidrogel 3D. O processo de impressão e fotopolimerização concluída em 4 min, com a viabilidade celular de 90% (n = 3). B) As células acumuladas para a parte inferior ou a interface devido à gravidade, sem fotopolimerização simultânea. Levou 10 minutos de exposição aos UV para gelificar a construção com o mesmo tamanho de A com uma viabilidade celular de63% (n = 3). Barras de escala = 100 pm.
Safranina-O coloração de condrócitos impressos em PEG hidrogel mostra a Figura 3. Aumento da produção de proteoglicano durante a cultura. Barras de escala = 100 pm.
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Discussion
Este sistema bioprinting 3D com capacidade fotopolimerização simultânea fornece uma resolução de impressão significativamente maior do que o melhor método anteriormente relatado de impressão em in situ de defeitos osteocondrais, utilizando uma seringa extrudido um hidrogel de alginato celular 16. Resolução de impressão mais elevada é particularmente crítica para a engenharia de tecidos de cartilagem para restaurar a cartilagem organização zonal anatómica. Fotopolimerização simultânea durante a montagem camada por camada, é crucial para manter a deposição precisa de células e andaimes de biomateriais para a construção 3D. A microfabricação com cada camada impressa, também resultou em transições suaves entre as camadas zonal, minimizando o potencial de degradação devido à delaminação. Ao ajustar com precisão os parâmetros bioprinting e componentes do bioink, seremos capazes de fabricar as estruturas 3D complexas necessárias para curar uma grande variedade de lesões da cartilagem.
Com synergistic estimulação do fator de crescimento, o neocartilage bioprinted teve a melhor fenótipo condrogênica e mais a proliferação de células 3. Portanto, a densidade de sementeira das células utilizadas neste estudo, o que é viável para bioprinting, também é ideal para a regeneração de cartilagem, quando tratadas com factores de crescimento adequados. Reparação da cartilagem utilizando condrócitos autólogos é muito restrito em aplicações clínicas, devido ao número limitado de condrócitos colhidas em biópsia. Implantar os condrócitos autólogos colhidos diretamente ou células-tronco mesenquimais (MSCs), juntamente com biomateriais para o reparo da cartilagem, sem expansão monocamada é extremamente atraente. Portanto, é essencial para expandir os números de células impressos para a densidade celular óptima necessária para a formação de cartilagem, sem comprometer a qualidade da matriz da cartilagem dado os números de células limitadas. Além disso, o que limita a densidade celular inicial será muito otimizar e maximizar a resolução bioprinting. Assim, o bioprinting método descrito aqui é totalmente compatível com os números baixos de células em ambiente clínico e tem o potencial de ser utilizado para engenharia de tecidos de cartilagem.
Em conclusão, nosso trabalho demonstra a viabilidade de fabricação de estruturas anatômicas da cartilagem através da apresentação de condrócitos e materiais biomaterial andaime para posições-alvo precisos. Um hidrogel PEG com condrócitos humanos foi continuamente bioprinted via montagem camada por camada. Fotopolimerização simultânea manteve as células impressas em suas posições iniciais depositadas e reduziu fototoxicidade. As células do neocartilage impresso mantido fenótipo condrogênica com a expressão genética consistente e análise bioquímica 2. Por isso, esta tecnologia é um avanço promissor para a engenharia de tecidos de cartilagem anatómica.
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Disclosures
Os autores não têm nenhum interesse financeiro neste estudo.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer o apoio do New York Região Capital Alliance Research Grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HP Deskjet 500 thermal inkjet printer | Hewlett-Packard | C2106a | Discontinued. Purchased refurbished from internet vendor. |
| HP black ink cartridge | Hewlett-Packard | 51626a | |
| Ultraviolet lamp | UVP | B-100AP | |
| UV light meter | General Tools | UV513AB | |
| Zeiss LSM 510 laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 510 | |
| Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) | Mediatech | 10-013 | |
| Penicillin-streptomycin-glutamine (PSG) | Invitrogen | 10378-016 | |
| Accutase cell dissociation reagent | Invitrogen | A11105-01 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Invitrogen | 10010-023 | |
| Live/Dead viability/cytotoxicity Kit | Invitrogen | L-3224 | |
| Poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) | Glycosan Biosystems | GS700 | |
| Irgacure 2959 | Ciba Specialty Chemicals | I-2959 | |
| Human articular chondrocytes | Lonza | CC-2550 |
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