Summary
이 문서에 설명 된 방법은 동시 UV 중합과 bioprinter에 상용 잉크젯 프린터로 변환하는 방법을 보여줍니다. 프린터는 세포 및 생체 재료와 3 차원 조직 구조를 구축 할 수있다. 여기에 설명이 연구는 3D neocartilage을 건설했다.
Abstract
열 잉크젯 프린팅을 기반으로 Bioprinting는 조직 공학 및 재생 의학 분야에서 가장 매력적인 지원 기술 중 하나입니다. 디지털 제어 세포 골격 및 성장 인자는 정확히 3 차원 (3D) 위치 빠르게 원하는 이차원 (2D)로 증착 될 수로. 따라서,이 기술은 그 나라의 해부학 적 구조를 흉내 낸 조직을 조작 할 수있는 이상적인 방법입니다. 네이티브 존 조직, 세포 외 매트릭스 조성물 (ECM), 그리고 기계적 성질과 연골을 설계하기 위해, 우리는 3D 연골 조직 공학을위한 가능한 동시 광중합와 상용 잉크젯 프린터를 사용 bioprinting 플랫폼을 개발했다. 폴리 (에틸렌 글리콜) 디 아크릴 레이트 (PEGDA)에 현탁 인간의 연골 세포는 계층 별 어셈블리를 통해 3D neocartilage 건설에 인쇄되었다. 인쇄 균체 surro 지원 그들의 본래 증착 위치에 고정했다동시에 광중합에 발판을 unding. 인쇄 조직의 기계적 성질은 네이티브 연골 유사 하였다. 이상 자외선 노출을 필요로 기존의 조직 제조에 비해, 동시에 광중합 인쇄 된 세포의 생존 능력이 유의하게 높았다. 인쇄 neocartilage 우수한 글리코 사 미노 글리 칸 (GAG)과 유전자 발현과 일치했다 콜라겐 타입 II의 생산을 보여 주었다. 따라서이 플랫폼은 해부학 적 조직 공학에 대한 정확한 세포의 분포와 배치에 이상적입니다.
Introduction
열 잉크젯 프린팅에 근거 Bioprinting은 조직 공학과 재생 의학 분야에서 가장 유망한 지원 기술의 하나이다. 디지털 제어 및 높은 처리량 프린트 헤드와 세포 골격 및 성장 인자는 정확히 3 차원 (3D) 위치를 빠르게 원하는 이차원 (2D)로 증착 될 수있다. 많은 성공적인 응용 프로그램은 조직 공학 및 재생 의학 1-9에서이 기술을 사용하여 달성되었습니다. 본 논문에서는 bioprinting 플랫폼은 수정 된 휴렛 팩커드 (HP) 데스크젯 500 열 잉크젯 프린터와 동시에 광중합 시스템과 함께 설립되었다. 폴리 (에틸렌 글리콜) (PEG)에서 제형 화 합성 하이드로 겔은 연골 세포 생존을 유지하고 연골 ECM 생산 10,11 홍보의 용량을 보여 주었다. 또한, photocrosslinkable PEG 동시 고분자 재료에 이상적 낮은 점도, 물에 매우 용해3D의 bioprinting 동안 rization. 본 논문에서는 폴리 (에틸렌) 글리콜 디 아크릴 레이트 (PEGDA, MW 3,400)에 현탁 인간의 연골 세포는 정확하게 3D 해상도 1,400 dpi로와 neocartilage 계층별로 레이어를 구성하는 인쇄되었다. 3 차원 지지체에 증착 된 세포 균질 분포는 우수한 기계적 특성 및 향상된 ECM 생산하여 연골 조직을 생성하는 관찰되었다. 대조적으로, 수동 조립에 의한 배양 2,3 불균일 연골 형성되었다 느린 비계 중합, 대신 그들의 초기 증착 위치의 겔의 바닥에 축적 된 세포.
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Protocol
1. Bioprinting 플랫폼 구축
프린터 수정은 HP 데스크젯 500 열 잉크젯 프린터와 HP 51626a 검정 잉크 카트리지를 기반으로했다.
- 프린터 상단의 플라스틱 덮개를 분리하고 조심스럽게 덮개에서 제어판을 분리합니다.
- 프린터 상단 부분과베이스 사이의 3 케이블 연결을 분리합니다. 기지에서 프린터 상단 부분을 제거합니다.
- 프린터 상단 부분에서, 잉크 카트리지 아래 우측에있는 작은 플라스틱 및 고무 부속품 (프린트 헤드 세척 장치)를 제거한다.
- 스프링 용지함 받침대를 제거합니다.
- 플라스틱 급지 줄을 덮고있는 금속 플레이트를 제거합니다.
- 손보고 또는 다른 절단 도구를 사용하여 중간 공급 휠 위치의 플라스틱 급지 줄을 잘라.
- 이전 단계 이후에 노출 된 2 급지 바퀴를 제거합니다. 바퀴 플라스틱은 매우 단단하고 전자입니다톱 도움이 될 것입니다.
- 통조림 공기와 에탄올 잎사귀를 사용하여 먼지와 이물질을 청소합니다.
- 베이스에 프린터 상단 부분을 연결합니다.
- 사용하기 전에 층류 후드에서 적어도 2 시간 동안 변경됨 프린터 살균 UV.
- 손보고 또는 다른 절단 도구를 사용하여 HP의 51626a 잉크 카트리지의 뚜껑을 잘라.
- 잉크를 비우고 연골의 아래쪽 아니라 저수지를 포함 필터를 제거합니다.
- 철저하게 수돗물을 실행하여 카트리지를 씻어.
- 초음파 처리는 10 분 동안 탈 이온화 (DI) 물에 카트리지 잔여 잉크를 제거합니다.
- 반드시 모든 잉크가 제거 된 확인하기 위해 카트리지를 검사합니다. 멸균 DI 물 다음에 소독 용 70 % 에탄올로 철저하게 카트리지를, 린스 또는 스프레이.
- 동시 광중합 능력을 제공하는 인쇄 플랫폼 위에 장파장 자외선 램프를 설치했다.
- UV 광을 이용하여 인쇄 플랫폼에 UV 강도를 측정미터. 인쇄 제목의 강도가 4-8 mW의 / ㎠ (프린터 플랫폼 램프에서 약 25 CM) 그래서 UV 램프와 프린터 플랫폼 사이의 거리를 조정합니다.
2. Bioink 준비
- 단층의 연골 세포의 확장
- Dulbeccos의 세포 확장을위한 각 T175 조직 배양 플라스크에 넣고 판 5 백만 인간의 연골 세포는 10 %의 혈청 및 1X 페니실린 - 스트렙토 마이신-글루타민 (PSG)으로 보충 이글스 중간 (DMEM)을 수정. 5 % CO 2를 포함하는 가습 공기와 37 ° C에서 배양 세포. 플라스크는 85 %의 합류 때까지 3 일마다 배지를 변경합니다. 같은 구절에서 세포를 사용합니다.
- 10 % W / V의 최종 농도로 PBS에 PEGDA을 녹여 0.05 % W / V의 최종 농도에 광개시제 I-2959에 추가 솔루션을 살균 필터.
- 5 × 10 6 세포의 준비 PEGDA 용액에서 배양 된 연골 세포를 일시 중지 /ML.
3. 연골 조직의 인쇄
- 프린터와 노트북을 켭니다.
- Microsoft Word 또는 어도비 포토샵을 사용하여 직경 4 mm의 고체 원의 인쇄 패턴을 만듭니다.
- 패턴의 위치를 조정하고 플라스틱 금형에 정확하게 인쇄 할 수 있는지 확인하십시오.
- 지지체의 원하는 두께에 도달하기 위해 필요한 인쇄 매수를 계산한다. 높이 4mm의 경우, (220) 인쇄가 원하는 발판을 만들어야합니다.
- 잉크 카트리지에 bioink를 넣습니다. 인쇄 중에 직접 UV의 노출로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 카트리지를 커버.
- 프린터로 인쇄 명령을 보냅니다. 프린터가 인쇄를 시작할 때 용지 센서를 당깁니다. 전체 인쇄 과정은 직경 4 ㎜, 높이 4 mm의 발판 미만 4 분 소요됩니다.
- 전송은 24 웰 플레이트에 neocartilage을 인쇄하고 각 웰에 1.5 ml의 문화 매체를 추가 할 수 있습니다.
- 어둠 속에서 15 분 동안 실온에서 LIVE / DEAD 생존 / 세포 독성 작업 솔루션에서 인쇄 neocartilage을 품어.
- 반 세포 함유 하이드로 겔을 절단하고 절단 영역의 형광 이미지를 가지고.
- 다섯 무작위로 촬영 한 이미지에 눈이 먼 관찰자 (녹색)과 죽음 (적색) 세포 라이브 계산합니다. 살아있는 및 죽은 세포의 총 수에 의해 생균 수를 분할함으로써 세포 생존도를 계산한다.
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Representative Results
수정 된 열 잉크젯 프린터는 높은 처리량 및 우수한 세포 생존 능력의 세포와 비계 증착 할 수 있었다. 동시에 광중합 및 감광 바이오 물질과 결합,이 기술은 처음에 퇴적 위치로 세포와 다른 인쇄 물질을 고정 할 수 있습니다. 개질 열 잉크젯 프린터의 속성에 따라, 2D 인쇄 해상도는 130 (PL)의 하나의 잉크 방울 체적 300 dpi로 하였다. 3.6 kHz에서 발사 주파수 (12, 13)과 각각의 프린트 헤드 (50) 점화 노즐이 있습니다. 따라서 4 개 mm 직경 4mm의 높이, 볼륨 및 계층 별 건설 기간 동안 각 인쇄 층의 두께의 대표적인 구조에 대해 각각 0.23 μL 18 μm의되었습니다. 전체 프린팅 공정은 연골 조직 (도 1)를 구성하는 4 개 이하 분 걸렸다.
도 2a는 인화의 짝수 셀 분포를 나타내고테드 인해 셀 증착 동안 주변의 발판을 동시에 광중합에 3D 지지체에 연골 세포. 대조적으로, 동시에 광중합 (세포 파종 후 비계 중합)하지 않고, 증착 된 세포 대신 중력 (그림 2B)로 인해 초기에 퇴적 위치의 바닥 또는 띠 인터페이스에 침몰했다. 이 셀의 축적은 연골 조직 (14, 15)의 매뉴얼 제작의 이전보고에서 관찰되었다. 3D PEG 하이드로 겔에 인쇄 된 인간의 연골 세포는 연골 세포의 표현형을 회복하고 문화 동안 점진적으로 증가 프로테오글리칸 생산 (그림 3) 3를 보여 주었다.
그림 1. neocartilage 조직을 인쇄. A) 동시에 광중합와 연골 bioprinting의 회로도와 레이아웃직경 4 ㎜, 높이 4 mm의 어 - 바이 - 층 조립. B) 인쇄 neocartilage 조직. = 2mm 스케일 바. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 녹색과 주황색 형광 염료로 표지 연골 세포는 띠 모양의 연골 bioprinting의 가능성을 보여 주었다. A) 인쇄 된 세포는 3 차원 히드로 겔에서의 초기 증착 위치를 유지했다. 인쇄 및 광중합 과정은 4 90 %의 세포 생존 능력을 가진 분 (N = 3). B)에 의한 동시 광중합없이 중력으로 아래쪽 또는 인터페이스에 축적 된 세포에 완료. 그것은 세포 생존 능력의와 같은 크기로 구조를 겔화 UV 노출의 10 분을했다63 % (N = 3). 스케일 바 = 100 μm의.
PEG 하이드로 겔 쇼에 인쇄 된 연골 세포의 그림 3. Safranin-O 염색은 문화 동안 테오 생산을 증가 시켰습니다. = 100 μm의 스케일 바 있습니다.
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Discussion
동시 광중합 용량이 3D bioprinting 시스템은 셀룰러 알지네이트 하이드로 겔 (16)을 압출 주사기를 사용하여 골 연골 결함 시츄 프린팅 소재의 최상의 이전에보고 된 방법보다 상당히 큰 인쇄 해상도를 제공한다. 높은 인쇄 해상도는 해부학 연골 띠 조직을 복원하는 연골 조직 공학에 특히 중요합니다. 계층 별 조립시 동시 광중합는 3D 건설을위한 세포 및 생체 재료 비계의 정확한 침착을 유지하는 것이 매우 중요합니다. 각 인쇄 층과 미세 또한 인해 박리 저하의 가능성을 최소화 띠 층 사이의 부드러운 전환의 결과. 정확하게 bioprinting 파라미터 및 bioink의 성분을 조절함으로써, 우리는 연골 병변의 다양한 치료에 필요한 복잡한 3D 구조를 제조 할 수있을 것이다.
영신로rgistic 성장 인자의 자극, bioprinted neocartilage 최고의 연골 세포의 표현형 및 대부분의 세포 증식 3 있었다. 적절한 성장 인자로 처리하면 따라서 bioprinting 대해 가능하다 본 연구에 사용 된 세포 파종 밀도는 또한 연골 재생에 적합하다. 자가 연골 세포를 사용하여 연골의 수리는 크게 인해 조직 검사에서 수확 연골 세포의 제한된 수의 임상 응용에 제한됩니다. 단층 확장하지 않고 연골 수리를 위해 생체 적합 물질과 함께 직접 수확자가 연골 세포 또는 중간 엽 줄기 세포 (중간 엽 줄기 세포)를 이식하는 것은 상당히 매력적이다. 따라서, 제한된 세포 수 관련 연골 매트릭스의 품질을 손상시키지 않고 연골 형성에 필요한 최적의 세포 밀도로 인쇄 된 세포 수를 확장하는 것이 중요하다. 또한, 초기 세포 밀도를 제한하는 것은 크게 최적화 bioprinting 해상도를 최대화 할 것이다. 따라서, bioprin여기에 설명 팅 방법은 임상 환경에서 낮은 세포 수와 완벽하게 호환되며 연골 조직 공학에 사용되는 가능성이있다.
결론적으로, 우리의 작업은 정확한 표적 위치에 연골 세포 및 생체 재료의 발판 자료를 제공하여 해부학 연골 구조를 제조의 가능성을 보여줍니다. 인간의 연골 세포와 PEG 하이드로 젤은 지속적으로 계층 별 어셈블리를 통해 bioprinted했다. 동시 광중합은 초기 증착 된 위치에 인쇄 된 세포를 유지 광독성을 감소시켰다. 인쇄 neocartilage에있는 세포는 일관성있는 유전자 발현, 생화학 적 분석 (2)와 연골 세포의 표현형을 유지했다. 따라서,이 기술은 해부학 연골 조직 공학을위한 유망한 발전이다.
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Disclosures
저자는이 연구에 재정적 인 관심이 없다.
Acknowledgments
저자는 뉴욕 수도권 연구 얼라이언스 그랜트의 지원을 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HP Deskjet 500 thermal inkjet printer | Hewlett-Packard | C2106a | Discontinued. Purchased refurbished from internet vendor. |
| HP black ink cartridge | Hewlett-Packard | 51626a | |
| Ultraviolet lamp | UVP | B-100AP | |
| UV light meter | General Tools | UV513AB | |
| Zeiss LSM 510 laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 510 | |
| Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) | Mediatech | 10-013 | |
| Penicillin-streptomycin-glutamine (PSG) | Invitrogen | 10378-016 | |
| Accutase cell dissociation reagent | Invitrogen | A11105-01 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Invitrogen | 10010-023 | |
| Live/Dead viability/cytotoxicity Kit | Invitrogen | L-3224 | |
| Poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) | Glycosan Biosystems | GS700 | |
| Irgacure 2959 | Ciba Specialty Chemicals | I-2959 | |
| Human articular chondrocytes | Lonza | CC-2550 |
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