Summary
Методы, описанные в этой статье показано, как преобразовать коммерческую струйный принтер в bioprinter с одновременным УФ полимеризации. Принтер способен построения 3D структуру ткани с клетками и биоматериалов. Исследование показало, здесь построили 3D neocartilage.
Abstract
Bioprinting, который основан на тепловой струйной печати, является одним из самых привлекательных перспективных технологий в области тканевой инженерии и регенеративной медицины. С цифровым управлением клетки, леса, и факторы роста могут быть точно зачислена на нужную двумерной (2D) и трехмерных (3D) места быстро. Таким образом, эта технология является идеальным подходом для изготовления тканей, имитирующие родные анатомические структуры. Для того, чтобы инженер хряща с родной зональной организации, внеклеточной состава матрицы (ECM), и механические свойства, мы разработали Bioprinting платформу с помощью коммерческого струйный принтер с одновременным фотополимеризации, способной для 3D хряща тканевой инженерии. Человека хондроциты взвешенные в поли (этиленгликоль) диакрилата (PEGDA) были напечатаны для 3D neocartilage строительства через слой за слоем сборки. Печатные клетки фиксировали в своих первоначальных осажденных позиций, при поддержке суррогатныхUnding эшафот в одновременном фотополимеризации. Механические свойства печатной ткани были похожи на родном хряща. По сравнению с обычным изготовления ткани, которая требует более длительного воздействия УФ, жизнеспособность клеток печатных с одновременным фотополимеризации была значительно выше. Отпечатано neocartilage продемонстрировал отличную гликозаминогликан (GAG) и коллаген типа II производства, что согласуется с экспрессии генов. Таким образом, эта платформа идеально подходит для точного распределения клеток и расположения для анатомического тканевой инженерии.
Introduction
Bioprinting на основе термальной струйной печати является одним из наиболее перспективных перспективных технологий в области тканевой инженерии и регенеративной медицины. С цифровым управлением и высокой пропускной печатающих головок факторы клетки, строительные леса, и роста может быть точно зачислена на нужную двумерной (2D) и трехмерных (3D) позиции быстро. Многие успешные приложения были достигнуты с помощью этой технологии в тканевой инженерии и регенеративной медицины 1-9. В данной работе, Bioprinting платформа была создана с измененным Hewlett-Packard (HP) Deskjet 500 тепловой струйный принтер и системой синхронного фотополимеризации. Синтетические гидрогели, сформулированные из поли (этиленгликоль) (ПЭГ), показали способность поддерживать жизнеспособность хондроцитов и способствовать хондрогенный производство ECM 10,11. Кроме того, photocrosslinkable ПЭГ хорошо растворим в воде с низкой вязкостью, что делает его идеальным для одновременного polymerization в режиме 3D Bioprinting. В данной работе человека хондроциты взвешенные в поли (этилен) гликоля диакрилата (PEGDA; МВт 3400) были точно напечатаны построить neocartilage слой за слоем с 1400 точек на дюйм в 3D разрешении. Наблюдалось равномерное распределение депонированных клеток в 3D-строительных лесов, который генерируется хрящевую ткань с превосходными механическими свойствами и повышенной продукции ECM. В противоположность этому, в ручном производстве клетки, накопленные в нижней части геля вместо их первоначально осажденных позиций из-за медленной полимеризации лесов, что привело к образованию неоднородной хряща после культивирования 2,3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bioprinting Платформа Создание
Модификация принтер был основан на HP Deskjet 500 термического струйного принтера HP 51626A и черного чернильного картриджа.
- Снимите верхнюю пластиковую крышку принтера и аккуратно отсоединить панель управления с крышки.
- Снимите кабельные соединения 3 между верхней части принтера и базы. Снимите верхнюю часть принтера от основания.
- На верхнем принтер части, снимите небольшую пластмассовой и резиновой принадлежности (система очистки печатающей головки) на правой стороне под картриджа.
- Удалить базу лоток для бумаги пружин.
- Снимите металлическую пластину, закрывающую пластиковую планку подачи бумаги.
- Отрежьте пластмассовую планку подачи бумаги на позиции среднего кормление колеса с помощью ручной пилой или другой режущий инструмент.
- Снимите с подачей бумаги колеса 2 открытые после предыдущего шага. Колесо пластик очень жесткий и электронныйпила будет полезно.
- Очистите пыль и мусор с помощью сжатым воздухом и этанола салфетки.
- Прикрепите верхнюю часть принтера к основанию.
- УФ стерилизации модифицированный принтер для по крайней мере 2 часов в ламинаре перед использованием.
- Отрежьте колпачок 51626A чернильного картриджа HP, используя пилу руками или другими режущий инструмент.
- Слейте чернила и снимите фильтр, который охватывает нижнюю резервуар также хряща.
- Промыть картридж тщательно с использованием проточной водопроводной водой.
- Ultrasonicate картридж в деионизированной (DI) воде в течение 10 мин для удаления остатков чернил.
- Осмотрите картридж, чтобы убедиться, все чернила были удалены. Промыть или распылить тщательно картридж с 70% этанола для стерилизации, а затем стерилизуют дистиллированной воды.
- Настройка длинноволновую ультрафиолетовую лампу над печатной платформы, чтобы обеспечить одновременную емкость фотополимеризации.
- Измерение интенсивности УФ на печатной платформы с помощью УФ-светаметр. Отрегулируйте расстояние между УФ-лампы и платформы для принтера, так интенсивность на объект печати составляет от 4-8 мВт / см 2 (приблизительно 25 см от лампы на платформу принтера).
2. Bioink Подготовка
- Расширение монослоя хондроцитов
- Пластинчатые 5000000 человека хондроциты в каждой тканевой культуральной колбы T175 для расширения клеток в Dulbeccos изменения орлов среду Игла (DMEM) с добавлением 10% сыворотки теленка и 1x пенициллина-стрептомицина-глутамина (PSG). Культура клеток при 37 ° С с увлажненным воздухом, содержащей 5% СО 2. Изменение культуральной среды каждые 3 дня до тех пор, пока колбу на 85% слияния. Использование клеток из того же прохода.
- Растворить PEGDA в PBS до конечной концентрации 10% вес / об Добавить фотоинициатор I-2959 в конечной концентрации 0,05% мас / об Фильтр стерилизовать решение.
- Приостановить культивированных человеческих хондроцитов в приготовленный раствор PEGDA на 5 х 10 6 клеток /мл.
3. Хрящевой ткани Печать
- Включите принтер и ноутбук.
- Создать печати образец твердой окружности с диаметром 4 мм с использованием Microsoft Word или Adobe Photoshop.
- Отрегулируйте положение рисунка и убедитесь, что он будет печатать точно в пластиковых форм.
- Рассчитать количество отпечатков, необходимых для достижения требуемой толщины эшафот. За 4 мм в высоту, 220 отпечатков требуются для создания нужного эшафот.
- Загрузите bioink в картридже. Накройте картридж с алюминиевой фольгой для защиты от прямого воздействия УФ во время печати.
- Отправить команду печати на принтер. Потяните датчик бумаги, когда принтер начинает печатать. Весь процесс печати занимает менее 4 минут для эшафот с 4 мм в диаметре и 4 мм в высоту.
- Передача напечатаны neocartilage в 24-луночный планшет и добавляют 1,5 мл культуральной среды в каждую лунку.
- Выдержите печатную neocartilage в Live / DEAD Жизнеспособность / цитотоксичности рабочего раствора при комнатной температуре в течение 15 мин в темноте.
- Разрежьте гидрогель клеток-Ладена в половине и принять флуоресцентные изображения лесосеке.
- Всего в прямом эфире (зеленый) и мертвые (красный) клетки вслепую наблюдателя в пяти случайно взятых изображений. Рассчитать жизнеспособность клеток путем деления количества живых клеток с помощью общего числа живых и мертвых клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Модифицированный тепловой струйный принтер способен на клетки и осаждения лесов в высокой пропускной способности и превосходной жизнеспособности клеток. Объединение с одновременным фотополимеризации и фоточувствительных биоматериалов, эта технология способна зафиксировать клетки и другие печатные веществ первоначально депонированных местах. По свойств модифицированного теплового струйного принтера, разрешение печати 2D составляла 300 точек на дюйм с одним объемом капли чернил 130 пл. Есть 50 обжига сопла в каждой печатающей головки с огневой 3,6 кГц частотой 12,13. Поэтому для представительной конструкции диаметром 4 мм и высотой 4 мм, объем и толщина каждого печатного слоя во время слой за слоем строительства были 0,23 мкл и 18 мкм соответственно. Весь процесс печати занял менее 4 мин построить хрящевой ткани (рис. 1).
Фиг.2А показывает равномерное распределение клеток PrinТед хондроцитов в 3D эшафот за счет одновременного фотополимеризации окружающей эшафот во время осаждения клеток. С другой стороны, без одновременного фотополимеризации (леса полимеризованном после посева клеток), осажденные клетки опустился на дно или зонального интерфейс вместо их первоначально депонированных местах из-за тяжести (рис. 2В). Это накопление клеток наблюдалось также в предыдущих докладах ручного изготовления хрящевой ткани 14,15. Печатные человека хондроциты в 3D ПЭГ гидрогеля восстановлены хондрогенный фенотип и продемонстрировал постепенно увеличивается протеогликанов производства во время культуры (рис. 3) 3.
Рисунок 1. Отпечатано neocartilage ткани. А) Схема Bioprinting хряща с одновременным фотополимеризации и заложитьэр за слоем сборки. B) печатается neocartilage ткань с диаметром 4 мм и 4 мм в высоту. Масштабная линейка = 2 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Хондроциты меченные зеленым и оранжевым флуоресцентных красителей продемонстрировали зональное хряща Bioprinting возможности. А) Печатные клетки сохранили свои первоначально депонированных позиции в 3D гидрогеля. Процесс печати и фотополимеризации завершена в 4 мин с клеточной жизнеспособности 90% (N = 3). B) клеток, накопленных в нижней или интерфейса под действием силы тяжести без одновременного фотополимеризации. Потребовалось 10 минут ультрафиолетового облучения в гель конструкцию с тем же размером А с сотовым жизнеспособности63% (N = 3). Масштабные бары = 100 мкм.
Рисунок 3. Сафранин-О окрашивание печатных хондроцитов в ПЭГ гидрогеля шоу увеличился протеогликанов производства во время культивирования. Scale бары = 100 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта 3D-система Bioprinting с одновременным мощностью фотополимеризации обеспечивает значительно более высокое разрешение печати, чем лучший сообщалось ранее метода в месте печати костно-хрящевых дефектов с помощью шприца выдавливается сотовый альгинат гидрогель 16. Более высокое разрешение печати особенно важно для хряща тканевой инженерии для восстановления анатомической хряща зональное организацию. Одновременное фотополимеризации во слой за слоем сборки имеет решающее значение для обеспечения точного осаждения клеток и биоматериалов лесов для 3D строительства. Микротехнологий с каждой печатной слой также привело к плавными переходами между зональных слоев, минимизации возможности деградации из-за отслоения. По точной настройки параметров Bioprinting и компоненты bioink, мы сможем изготавливать сложные 3D структур, необходимых, чтобы излечить широкий спектр повреждений хряща.
С Synergistic стимуляции фактора роста, bioprinted neocartilage был лучший хондрогенный фенотип и наиболее пролиферацию клеток 3. Таким образом, плотность клеток посева используется в данном исследовании, которое является допустимым для Bioprinting, также идеально подходит для регенерации хряща при лечении соответствующих факторов роста. Хрящ ремонт с использованием аутологичных хондроцитов сильно ограничено в клинической практике в связи с ограниченным количеством хондроцитов, собранного в биопсии. Имплантации непосредственно собранные аутологичных хондроцитов или мезенхимальные стволовые клетки (МСК), а также биоматериалов для восстановления хрящевой ткани без расширения монослоя чрезвычайно привлекательным. Поэтому, очень важно, чтобы расширить печатные числа клеток в оптимальной плотности клеток, необходимых для образования хряща без ущерба для качества хрящевого матрикса, учитывая ограниченное количество клеток. Кроме того, ограничения начальную плотность клеток значительно оптимизировать и максимально повысить разрешение Bioprinting. Таким образом, bioprinМетод тин описано здесь полностью совместим с номерами низких клеток в клинических условиях и имеет потенциал, который будет использоваться для хряща тканевой инженерии.
В заключение, наша работа демонстрирует возможность изготовления анатомических структур хряща, обеспечивая хондроциты и биоматериал эшафот материалы к точным целевых позиций. ПЭГ гидрогель с хондроцитов человека постоянно bioprinted через слой за слоем сборки. Одновременное фотополимеризации поддерживается печатные клеток при их первоначальных депонированных позиций и снижение фототоксичность. Клетки в печатной neocartilage поддерживается хондрогенный фенотип с последовательным экспрессии генов и биохимического анализа 2. Таким образом, эта технология является перспективной заранее для анатомического хряща тканевой инженерии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют финансовой заинтересованности в данном исследовании.
Acknowledgments
Авторы хотели бы выразить признательность за поддержку со стороны Нью-Йорк столичный регион Исследование Альянс Гранта.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HP Deskjet 500 thermal inkjet printer | Hewlett-Packard | C2106a | Discontinued. Purchased refurbished from internet vendor. |
| HP black ink cartridge | Hewlett-Packard | 51626a | |
| Ultraviolet lamp | UVP | B-100AP | |
| UV light meter | General Tools | UV513AB | |
| Zeiss LSM 510 laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 510 | |
| Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) | Mediatech | 10-013 | |
| Penicillin-streptomycin-glutamine (PSG) | Invitrogen | 10378-016 | |
| Accutase cell dissociation reagent | Invitrogen | A11105-01 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Invitrogen | 10010-023 | |
| Live/Dead viability/cytotoxicity Kit | Invitrogen | L-3224 | |
| Poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) | Glycosan Biosystems | GS700 | |
| Irgacure 2959 | Ciba Specialty Chemicals | I-2959 | |
| Human articular chondrocytes | Lonza | CC-2550 |
References
- Cui, X., Boland, T. Human microvasculature fabrication using thermal inkjet printing technology. Biomaterials. 30, 6221-6227 (2009).
- Cui, X., Breitenkamp, K., Finn, M. G., Lotz, M., D'Lima, D. D. Direct human cartilage repair using three-dimensional bioprinting technology. Tissue Eng Part A. 18, 1304-1312 (2012).
- Cui, X., Breitenkamp, K., Lotz, M., D'Lima, D. Synergistic action of fibroblast growth factor-2 and transforming growth factor-beta1 enhances bioprinted human neocartilage formation. Biotechnol. Bioeng. 109, 2357-2368 (2012).
- Cui, X., Breitenkamp, K., Finn, M. G., Lotz, M., Colwell, C. W. Direct human cartilage repair using thermal inkjet printing technology. Osteoarthritis and Cartilage. 19, (2011).
- Cui, X., Boland, T. Simultaneous deposition of human microvascular endothelial cells and biomaterials for human microvasculature fabrication using inkjet printing. NIP24/digital Fabrication 2008: 24th International Conference on Digital Printing Technologies, Technical Program and Proceedings. 24, 480-483 (2008).
- Cui, X., Dean, D., Ruggeri, Z. M., Boland, T. Cell damage evaluation of thermal inkjet printed Chinese hamster ovary cells. Biotechnol. Bioeng. 106, 963-969 (2010).
- Cui, X., Hasegawa, A., Lotz, M., D'Lima, D. Structured three-dimensional co-culture of mesenchymal stem cells with meniscus cells promotes meniscal phenotype without hypertrophy. Biotechnol. Bioeng. 109, 2369-2380 (2012).
- Cui, X., Gao, G., Qiu, Y. Accelerated myotube formation using bioprinting technology for biosensor applications. Biotechnol. Lett. 35, 315-321 (2013).
- Cui, X., Boland, T., D'Lima, D. D., Lotz, M. K. Thermal inkjet printing in tissue engineering and regenerative medicine. Recent Pat Drug Deliv Formul. 6, 149-155 (2012).
- Bryant, S. J., Anseth, K. S. Hydrogel properties influence ECM production by chondrocytes photoencapsulated in poly(ethylene glycol) hydrogels. Journal of Biomedical Materials Research. 59, 63-72 (2002).
- Elisseeff, J., et al. Photoencapsulation of chondrocytes in poly(ethylene oxide)-based semi-interpenetrating networks. Journal of Biomedical Materials Research. 51, 164-171 (2000).
- Buskirk, W. A., et al. Development of A High-Resolution Thermal Inkjet Printhead. Hewlett-Packard Journal. 39, 55-61 (1988).
- Harmon, J. P., Widder, J. A. Integrating the Printhead Into the HP Deskjet Printer. Hewlett-Packard Journal. 39, 62-66 (1988).
- Kim, T. K., et al. Experimental model for cartilage tissue engineering to regenerate the zonal organization of articular cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 11, 653-664 (2003).
- Sharma, B., et al. Designing zonal organization into tissue-engineered cartilage. Tissue Engineering. 13, 405-414 (2007).
- Cohen, D. L., Lipton, J. I., Bonassar, L. J., Lipson, H. Additive manufacturing for in situ repair of osteochondral defects. Biofabrication. 2, (2010).
