Summary
本文介绍的方法显示了如何将一个商用喷墨打印机与紫外线同时聚合生物印刷。该打印机能够构建三维组织结构，细胞和生物材料。这里展示的研究构建了一个3D neocartilage。
Abstract
生物印刷，这是基于热喷墨印刷，是最有吸引力的应用技术在组织工程和再生医学的领域之一。与数字控制单元，支架和生长因子可以精确地沉积到所需的二维（2D）和三维（3D）位置迅速。因此，这种技术是制造组织模仿他们的母语解剖结构的理想方法。为了与原生地带性的组织，细胞外基质成分（ECM）和机械性能工程师软骨，我们开发了使用商用喷墨打印机能够进行3D软骨组织工程同时进行光聚合生物印刷一个平台。人软骨细胞悬浮于聚（乙二醇）二丙烯酸酯（PEGDA），被印刷于通过层 - 层组装三维neocartilage施工。印刷细胞固定在原来的位置存放，由surro支持unding脚手架在同步光聚合。印刷组织的机械性能类似于天然软骨。相对于传统的组织的制造，这需要较长的紫外线曝光，在印刷单元和同步光聚合的存活率显著更高。印刷neocartilage展现了出色的糖胺聚糖（GAG）和Ⅱ型胶原的生产，这与基因的表达相一致。因此，这个平台是理想的精确细胞分布和安排解剖组织工程。
Introduction
生物印刷基于热喷墨印刷是最有前途的应用技术在组织工程和再生医学的领域之一。数字控制和高吞吐量的打印头单元，支架和生长因子可以精确地沉积到所需的二维（2D）和三维（3D）位置的迅速发展。采用该技术在组织工程和再生医学1-9许多成功的应用已经实现。在本文中，生物印刷一个平台，建立与修改后的惠普（HP）DESKJET 500热喷墨打印机和同步光聚合体系。由聚（乙二醇）（PEG）配制合成的水凝胶已经表明维持软骨细胞的生存力和促进软骨ECM生成10,11的容量。此外，光交联聚乙二醇在水中具有低粘度，这使得它非常适合同时聚合物：水溶性高在生物印刷3D化。在本文中，人类软骨细胞悬浮在聚（乙烯）乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA; 3,400兆瓦）的精确打印，构建neocartilage层 - 层与1,400 dpi的三维解析。观察到沉积的细胞在三维支架材料中均匀分布，即生成软骨组织具有优异的机械性能和增强的ECM生成。与此相反，在手动制造的凝胶，而不是其最初沉积仓的底部由于较慢的聚合骨架，而导致不均匀的软骨形成培养后2,3蓄积的细胞。
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Protocol
1，生物印刷平台建立
打印机的修改是基于对HP DESKJET 500热喷墨打印机和HP 51626A黑色墨盒。
- 取下打印机顶部塑料盖，小心地从盖取下控制面板。
- 拆下打印机的顶部和底部之间的3线连接。从底座上拆下打印机的顶部。
- 在打印机顶部，取下墨盒下在右边的小塑料及橡胶配件（打印头清洗系统）。
- 取出进纸托盘与弹簧的基础。
- 取下金属板覆盖塑料纸吧。
- 切断在用手锯或其它切割工具的中间进料轮位置的塑料纸吧。
- 除去前面的步骤之后露出的2进纸轮。轮子的塑料是很难和一个电子锯会有所帮助。
- 使用清洁的空气罐头和乙醇擦拭的灰尘和碎屑。
- 将打印机顶部部分到基座上。
- 使用之前UV消毒至少2小时在层流罩的改性打印机。
- 切断用手锯或其他切削工具的HP 51626A墨盒的盖子。
- 清空墨水和撕下软骨底部以及水库的过滤器。
- 彻底用流动的自来水冲洗墨盒。
- Ultrasonicate盒在去离子（DI）水10分钟以除去残留的墨水。
- 检查墨盒，以确保所有的墨水已被删除。冲洗或喷雾彻底盒用70％乙醇消毒，接着无菌去离子水。
- 设置一个长波长紫外线灯在印刷平台上提供同步光聚合能力。
- 使用UV光测量紫外线强度在打印平台米。调整UV灯和打印机平台之间的距离如此的强度在打印对象是4-8之间毫瓦/厘米2（大约25厘米的灯，以在打印机平台）。
2，生物油墨的制备
- 单层软骨细胞扩张
- 板500万的人软骨细胞到每个T175组织培养瓶用于细胞扩增中的Dulbeccos改进的Eagles培养基（DMEM），补充有10％小牛血清和1x青霉素 - 链霉素 - 谷氨酰胺（PSG）。培养细胞在37℃下用含5％CO 2的加湿空气。改变培养基每3天，直到烧瓶85％汇合。从同一通道使用的细胞。
- 溶解PEGDA在PBS中的10％w / v的终浓度添加光引发剂I-2959的0.05％w / v的终浓度过滤灭菌的溶液中。
- 暂停在制备PEGDA溶液培养的人软骨细胞以5×10 6个细胞/毫升。
3，软骨组织印刷
- 关闭打印机和笔记本电脑上。
- 创建一个实心圆与直径4毫米使用Microsoft Word或Adobe Photoshop中的印刷图案。
- 调整图案的位置，并确保它会准确打印到塑料模具。
- 计算到达支架的所需厚度所需的打印数。为4毫米高度，220的打印需要创建所需的脚手架。
- 加载到生物油墨墨盒。盖上铝箔盒在打印过程中，以保护从直接紫外线照射。
- 发送打印命令到打印机。拉纸传感器，当打印机开始打印。整个印刷过程只需要不到4分钟用于直径4毫米和4毫米高支架。
- 转印印刷neocartilage到24孔板中并加入1.5毫升培养培养基到每个孔中。
- 孵育印刷neocartilage在LIVE / DEAD活力/细胞毒性工作在室温下在黑暗中15分钟，溶液中。
- 削减了一半的细胞充满水凝胶，并采取切削区的荧光图像。
- 现场计数（绿色）和死（红）细胞由不知情的观察者五个随机拍摄的图像。通过将活细胞的数目由活细胞和死细胞的总数计算细胞存活率。
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Representative Results
修改后的热喷墨打印机是能够用于细胞和支架材料沉积在高吞吐量和出色的细胞活力。与同时进行光致聚合和光敏生物材料相结合，这种技术能够以固定细胞和其他印刷物质的最初沉积的位置。根据修改后的热喷墨打印机的属性，在2D打印分辨率为300 dpi，采用130 PL单个墨滴体积。有50个发射喷嘴每个打印头与3.6 kHz的发射频率12,13。因此，对于直径4毫米和4毫米的高度，体积和各印刷层的层 - 层施工时厚度的代表性构造为0.23微升和18微米。在整个印刷过程中只用了不到4分钟，以构建软骨组织（ 图1）。
图2A示出首席的偶数细胞分布特德软骨细胞在三维支架由于在细胞沉积周边支架同时光聚合。与此相反，没有同时光聚合（细胞接种后的支架聚合），沉积的细胞沉到，而不是他们由于重力（ 图2B）最初沉积位置的底部或纬向接口。这种细胞的积累中也观察到的软骨组织14,15手工制作的以前的报告。在三维的PEG水凝胶的印刷人软骨细胞恢复软骨细胞表型，并展示了培养过程中逐渐增加的蛋白聚糖的生产（ 图3）3。
图1。印刷neocartilage组织。一）示意图生物印刷软骨与同步光聚合打下呃-层组装B）的印刷neocartilage组织用直径4毫米和4毫米的高度。比例尺= 2毫米请点击此处查看该图的放大版本。
图2软骨细胞标记绿色和橙色荧光染料表现出纬向生物印刷软骨的可行性。 a）印刷细胞保持在3D水凝他们最初存放位置。印刷及光聚合过程中完成的4分钟，90％的细胞活力（N = 3），B），累积在底部或接口由于重力的作用不同步光聚合电池。它采取了紫外线照射10分钟，用A与一个细胞的存活率同样大小的凝胶结构63％（N = 3）。比例尺=100μm左右。
在PEG水凝胶展示印刷软骨细胞图3。番红-O染色的培养过程中增加蛋白多糖的生产。比例尺= 100微米。
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Discussion
这种3D生物印刷系统和同步光聚合产能提供比使用注射器挤出蜂窝海藻酸钠水凝胶16骨软骨缺损的原位印刷的最佳先前报道的方法一个显著更高的打印分辨率。较高的打印分辨率是特别关键的软骨组织工程恢复解剖软骨带状组织。层 - 层组装过程中同时进行光聚合反应是至关重要的，以维持细胞和生物材料支架的三维结构的精确沉积。微细加工与各印刷层也导致带状层之间的平滑过渡，最大程度地降低了潜在的因脱层。通过精确地调整生物印刷参数和生物油墨组件，我们将能够制造医治各种软骨病变所需的复杂的三维结构。
与地久天长rgistic生长因子刺激时，bioprinted neocartilage有最好的软骨细胞表型和大多数细胞增殖3。因此，在本研究中使用的细胞接种密度，这对于生物印刷是可行的，也是理想的软骨再生时用适当的生长因子治疗。使用自体软骨细胞的软骨修复被大大由于软骨细胞收获在活检的数量有限限制在临床应用。植入的直接收获自体软骨细胞或骨髓间充质干细胞（MSCs）与生物材料用于软骨修复而不单层扩张是非常有吸引力的。因此，关键是要扩大印刷单元编号，而不损害在有限的细胞数量的软骨基质的质量所需的软骨形成的最佳细胞密度。此外，限制初始细胞密度将大大优化和最大化的分辨率生物印刷。因此，bioprin这里描述汀的方法是用在临床环境中的低细胞数目完全兼容，并具有将用于软骨组织工程的潜力。
总之，我们的工作表明，通过提供软骨细胞和生物材料支架材料，以精确的目标位置制造软骨的解剖结构的可行性。的PEG水凝胶与人体软骨细胞不断通过层 - 层组装bioprinted。同时保持光聚合印细胞在它们的初始沉积位置和减少光毒性。在印刷neocartilage细胞维持软骨细胞表型一致的基因表达和生化分析2。因此，这种技术是一种很有前途的预先解剖软骨组织工程。
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Disclosures
作者没有任何金融利益在这项研究中。
Acknowledgments
作者要感谢来自纽约首都地区研究联盟资助的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HP Deskjet 500 thermal inkjet printer | Hewlett-Packard | C2106a | Discontinued. Purchased refurbished from internet vendor. |
| HP black ink cartridge | Hewlett-Packard | 51626a | |
| Ultraviolet lamp | UVP | B-100AP | |
| UV light meter | General Tools | UV513AB | |
| Zeiss LSM 510 laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 510 | |
| Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) | Mediatech | 10-013 | |
| Penicillin-streptomycin-glutamine (PSG) | Invitrogen | 10378-016 | |
| Accutase cell dissociation reagent | Invitrogen | A11105-01 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Invitrogen | 10010-023 | |
| Live/Dead viability/cytotoxicity Kit | Invitrogen | L-3224 | |
| Poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) | Glycosan Biosystems | GS700 | |
| Irgacure 2959 | Ciba Specialty Chemicals | I-2959 | |
| Human articular chondrocytes | Lonza | CC-2550 |
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