Summary
इस पत्र में वर्णित तरीकों एक साथ यूवी polymerization के साथ एक bioprinter में एक वाणिज्यिक इंकजेट प्रिंटर परिवर्तित करने के लिए कैसे दिखा. प्रिंटर कोशिकाओं और biomaterials के साथ 3 डी ऊतक संरचना के निर्माण के लिए सक्षम है. यहाँ का प्रदर्शन अध्ययन एक 3 डी neocartilage का निर्माण किया.
Abstract
थर्मल inkjet मुद्रण पर आधारित है जो bioprinting, ऊतक इंजीनियरिंग और पुनर्योजी चिकित्सा के क्षेत्र में सबसे आकर्षक सक्षम प्रौद्योगिकियों में से एक है. डिजिटल नियंत्रण कक्षों, scaffolds, और वृद्धि कारकों ठीक तीन आयामी (3 डी) स्थानों तेजी से वांछित दो आयामी (2 डी) के लिए जमा किया जा सकता है. इसलिए, इस तकनीक के लिए अपनी मूल शारीरिक संरचनाओं नकल उतार ऊतकों के निर्माण की एक आदर्श तरीका है. देशी जोनल संगठन, बाह्य मैट्रिक्स संरचना (ईसीएम), और यांत्रिक गुणों के साथ उपास्थि इंजीनियर के क्रम में, हम 3 डी उपास्थि ऊतक इंजीनियरिंग के लिए सक्षम एक साथ photopolymerization साथ एक वाणिज्यिक इंकजेट प्रिंटर का उपयोग कर एक bioprinting मंच विकसित की है. पाली (इथाइलीन ग्लाइकॉल) diacrylate (PEGDA) में निलंबित मानव chondrocytes परत दर परत विधानसभा के माध्यम से 3 डी neocartilage निर्माण के लिए मुद्रित किया गया. मुद्रित कोशिकाओं surro द्वारा समर्थित, उनके मूल जमा पदों पर तय किया गयाएक साथ photopolymerization में पाड़ unding. मुद्रित ऊतक के यांत्रिक गुणों देशी उपास्थि के समान थे. अब यूवी जोखिम की आवश्यकता है जो पारंपरिक ऊतक निर्माण, की तुलना में, एक साथ photopolymerization साथ मुद्रित कोशिकाओं की व्यवहार्यता काफी अधिक था. मुद्रित neocartilage उत्कृष्ट ग्लाइकोसमिनोग्लाइकन (भूमिकाः) और जीन अभिव्यक्ति के अनुरूप था जो कोलेजन प्रकार द्वितीय उत्पादन, प्रदर्शन किया. इसलिए, इस मंच शारीरिक ऊतक इंजीनियरिंग के लिए सही सेल वितरण और व्यवस्था के लिए आदर्श है.
Introduction
थर्मल inkjet मुद्रण के आधार पर bioprinting ऊतक इंजीनियरिंग और पुनर्योजी चिकित्सा के क्षेत्र में सबसे होनहार सक्षम प्रौद्योगिकियों में से एक है. डिजिटल नियंत्रण और उच्च throughput printheads साथ कोशिकाओं, scaffolds, और वृद्धि कारकों ठीक तीन आयामी (3 डी) के पदों पर तेजी से वांछित दो आयामी (2 डी) के लिए जमा किया जा सकता है. कई सफल अनुप्रयोगों ऊतक इंजीनियरिंग और पुनर्योजी चिकित्सा 1-9 में इस तकनीक का प्रयोग कर प्राप्त किया गया है. इस पत्र में, एक bioprinting मंच एक संशोधित Hewlett-Packard (HP) Deskjet 500 थर्मल इंकजेट प्रिंटर और एक साथ photopolymerization प्रणाली के साथ स्थापित किया गया था. पाली (इथाइलीन ग्लाइकॉल) (खूंटी) से तैयार सिंथेटिक हाइड्रोजेल उपास्थिकोशिका व्यवहार्यता बनाए रखने और chondrogenic ईसीएम उत्पादन 10,11 को बढ़ावा देने की क्षमता दिखाई है. इसके अलावा, photocrosslinkable खूंटी एक साथ polyme के लिए आदर्श बनाता है, जो कम चिपचिपापन, साथ पानी में अत्यधिक घुलनशील है3 डी bioprinting दौरान rization. इस पत्र में, पाली (ethylene) ग्लाइकोल diacrylate (PEGDA; मेगावाट 3400) में निलंबित मानव chondrocytes ठीक 3D संकल्प में 1,400 डीपीआई के साथ neocartilage परत दर परत का निर्माण करने के लिए मुद्रित किया गया. एक 3 डी पाड़ में जमा कोशिकाओं के सजातीय वितरण उत्कृष्ट यांत्रिक गुणों और बढ़ाया ईसीएम उत्पादन के साथ उपास्थि ऊतक उत्पन्न है, जो मनाया गया. इसके विपरीत, पुस्तिका निर्माण में होने के कारण संस्कृति 2,3 के बाद inhomogeneous उपास्थि गठन हुआ जो धीमी पाड़ polymerization, करने के बजाय उनके शुरू में जमा पदों की जेल जमा के नीचे कोशिकाओं.
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Protocol
1. Bioprinting प्लेटफ़ॉर्म स्थापना
प्रिंटर संशोधन एक हिमाचल प्रदेश Deskjet 500 थर्मल इंकजेट प्रिंटर और हिमाचल प्रदेश 51626a काली स्याही कारतूस के आधार पर किया गया था.
- प्रिंटर के ऊपर प्लास्टिक कवर निकालें और ध्यान से कवर से नियंत्रण कक्ष को अलग.
- प्रिंटर शीर्ष भाग और आधार के बीच 3 केबल कनेक्शन को अलग करें. आधार से प्रिंटर शीर्ष भाग निकालें.
- प्रिंटर शीर्ष भाग पर, स्याही कारतूस के नीचे दाहिने हाथ की ओर पर छोटे प्लास्टिक और रबर के सामान (printhead सफाई व्यवस्था) को हटा दें.
- स्प्रिंग्स के साथ कागज ट्रे के आधार निकालें.
- प्लास्टिक कागज खिला बार कवर धातु की थाली निकालें.
- एक हाथ देखा या अन्य काटने के उपकरण का उपयोग मध्य खिला पहिया स्थिति पर प्लास्टिक कागज खिला बार काट दिया.
- पिछले चरण के बाद उजागर 2 कागज खिला पहियों निकालें. पहिया प्लास्टिक बहुत कठिन है और एक इलेक्ट्रॉनिक हैदेखा मददगार होगा.
- कैन्ड हवा और इथेनॉल पोंछे का उपयोग कर धूल और मलबे को साफ.
- आधार के लिए प्रिंटर शीर्ष भाग देते हैं.
- उपयोग करने से पहले एक लामिना का प्रवाह हुड में कम से कम 2 घंटे के लिए संशोधित प्रिंटर बाँझ यूवी.
- एक हाथ देखा या अन्य काटने के उपकरण का उपयोग कर एक HP 51626a स्याही कारतूस की टोपी काट दिया.
- स्याही खाली और उपास्थि के नीचे अच्छी तरह से जलाशय को शामिल किया गया है कि फिल्टर हटा दें.
- अच्छी तरह से नल का पानी चल रहा है का उपयोग कारतूस कुल्ला.
- Ultrasonicate 10 मिनट के लिए de-ionized (डी) पानी में कारतूस अवशिष्ट स्याही को दूर करने के लिए.
- सुनिश्चित करें कि सभी स्याही हटा दिया गया है बनाने के लिए कारतूस की जाँच करें. निष्फल डि पानी के बाद नसबंदी के लिए 70% इथेनॉल के साथ अच्छी तरह से कारतूस, कुल्ला या स्प्रे.
- एक साथ photopolymerization क्षमता प्रदान करने के लिए मुद्रण के मंच पर एक लंबी तरंग दैर्ध्य पराबैंगनी दीपक स्थापित करें.
- एक पराबैंगनी प्रकाश का उपयोग कर मुद्रण मंच पर यूवी तीव्रता को मापनेमीटर. मुद्रण विषय पर तीव्रता 4-8 के बीच मेगावाट / 2 सेमी (प्रिंटर मंच को दीपक से लगभग 25 सेमी) है तो यूवी दीपक और प्रिंटर मंच के बीच की दूरी को समायोजित करें.
2. Bioink तैयारी
- Monolayer उपास्थिकोशिका विस्तार
- Dulbeccos में सेल के विस्तार के लिए प्रत्येक T175 टिशू कल्चर फ्लास्क में प्लेट 5 लाख मानव chondrocytes 10% बछड़ा सीरम और 1x पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन-glutamine (पीएसजी) के साथ पूरक ईगल्स मध्यम (DMEM) संशोधित. 5% सीओ 2 युक्त humidified हवा के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति कोशिकाओं. कुप्पी 85% संगम है जब तक हर 3 दिन संस्कृति के माध्यम से बदलें. एक ही मार्ग से कोशिकाओं का उपयोग करें.
- 10% डब्ल्यू / वी. के अंतिम एकाग्रता के लिए पीबीएस में PEGDA भंग 0.05% w / वी. के अंतिम एकाग्रता के लिए photoinitiator मैं-2959 जोड़ें समाधान बाँझ फ़िल्टर.
- 5 x 10 6 कोशिकाओं में तैयार PEGDA समाधान में सुसंस्कृत मानव chondrocytes निलंबित /मिलीलीटर.
3. उपास्थि ऊतक मुद्रण
- प्रिंटर और लैपटॉप पर बारी.
- माइक्रोसॉफ्ट वर्ड या Adobe Photoshop का उपयोग व्यास में 4 मिमी के साथ एक ठोस सर्कल के एक मुद्रण पैटर्न बनाएँ.
- पैटर्न की स्थिति को समायोजित करें और इसे प्लास्टिक मोल्ड में बिल्कुल प्रिंट होगा सुनिश्चित करें.
- पाड़ की इच्छित मोटाई तक पहुँचने की जरूरत प्रिंट की संख्या की गणना. ऊंचाई में 4 मिमी के लिए, 220 प्रिंट वांछित पाड़ बनाने के लिए आवश्यक हैं.
- स्याही कारतूस में bioink लोड करें. मुद्रण के दौरान प्रत्यक्ष यूवी जोखिम से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कारतूस कवर.
- प्रिंटर के लिए मुद्रण आदेश भेजें. प्रिंटर मुद्रित करने के लिए शुरू होता है जब कागज सेंसर खींचो. पूरे मुद्रण प्रक्रिया व्यास में 4 मिमी और ऊंचाई में 4 मिमी के साथ एक पाड़ के लिए कम से कम 4 मिनट लेना चाहिए.
- स्थानांतरण एक 24 अच्छी तरह से थाली को neocartilage मुद्रित और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 1.5 मिलीलीटर संस्कृति के माध्यम जोड़ें.
- अंधेरे में 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर लाइव / मृत व्यवहार्यता / cytotoxicity काम कर समाधान में मुद्रित neocartilage सेते हैं.
- छमाही में सेल से लदी हाइड्रोजेल कट और कटौती क्षेत्र के फ्लोरोसेंट छवियों ले.
- पांच बेतरतीब ढंग से लिए गए चित्रों में एक अंधा पर्यवेक्षक द्वारा (हरा) और मृत (लाल) कोशिकाओं लाइव गणना. रहते हैं और मृत कोशिकाओं की कुल संख्या से जीवित कोशिकाओं की संख्या से विभाजित करके सेल व्यवहार्यता की गणना.
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Representative Results
संशोधित थर्मल इंकजेट प्रिंटर उच्च throughput और उत्कृष्ट सेल व्यवहार्यता पर सेल और पाड़ बयान के लिए सक्षम था. एक साथ photopolymerization और सहज biomaterials के साथ मेल है, इस तकनीक के शुरू में जमा स्थानों के लिए कोशिकाओं और अन्य मुद्रित पदार्थों को ठीक करने में सक्षम है. संशोधित थर्मल इंकजेट प्रिंटर के गुणों के अनुसार, 2 डी मुद्रण संकल्प 130 पी एल के एक एकल स्याही बूंद की मात्रा के साथ 300 डीपीआई था. 3.6 kHz फायरिंग आवृत्ति 12,13 साथ प्रत्येक printhead में 50 फायरिंग नलिका रहे हैं. इसलिए 4 मिमी व्यास और 4 मिमी ऊंचाई, मात्रा और परत दर परत निर्माण के दौरान प्रत्येक मुद्रित परत की मोटाई के एक प्रतिनिधि के निर्माण के लिए क्रमश: 0.23 μl और 18 माइक्रोन थे. पूरे मुद्रण प्रक्रिया उपास्थि ऊतक (चित्रा 1) के निर्माण के लिए कम से कम 4 मिनट लग गए.
चित्रा 2A prin का एक भी कोशिका वितरण से पता चलता हैटेड के कारण सेल बयान के दौरान आसपास के पाड़ के एक साथ photopolymerization के लिए 3 डी पाड़ में chondrocytes. इसके विपरीत, एक साथ photopolymerization (सेल बोने के बाद पाड़ polymerized) के बिना, जमा कोशिकाओं के बजाय गुरुत्वाकर्षण (चित्रा 2 बी) के कारण उनके शुरू में जमा स्थानों के नीचे या जोनल इंटरफ़ेस से डूब गया. यह सेल संचय भी उपास्थि ऊतक 14,15 का मार्गदर्शन निर्माण की पिछली रिपोर्टों में मनाया गया. 3 डी खूंटी hydrogel में मुद्रित मानव chondrocytes chondrogenic phenotype बरामद और संस्कृति के दौरान धीरे - धीरे वृद्धि हुई proteoglycan उत्पादन (चित्रा 3) 3 प्रदर्शन किया.
चित्रा 1. Neocartilage ऊतक छपी. ए) एक साथ photopolymerization साथ उपास्थि bioprinting के योजनाबद्ध और रखनाव्यास में 4 मिमी और ऊंचाई में 4 मिमी के साथ एर दर परत विधानसभा. बी) एक मुद्रित neocartilage ऊतक. = 2 मिमी स्केलपट्टी. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2. हरे और नारंगी फ्लोरोसेंट रंगों के साथ लेबल chondrocytes जोनल उपास्थि bioprinting व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया. ए) मुद्रित कोशिकाओं 3D हाइड्रोजेल में उनके शुरू में जमा पदों को बनाए रखा. मुद्रण और photopolymerization प्रक्रिया 4 से 90% की सेल व्यवहार्यता के साथ न्यूनतम (n = 3). बी) के कारण एक साथ photopolymerization बिना गुरुत्वाकर्षण के नीचे या इंटरफेस को संचित कोशिकाओं में पूरा किया. यह एक सेल व्यवहार्यता के साथ एक के एक ही आकार के साथ निर्माण जेल यूवी जोखिम के 10 मिनट लिया63% (n = 3). स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन.
खूंटी hydrogel शो में मुद्रित chondrocytes की चित्रा 3. सैफरैनीन हे धुंधला संस्कृति दौरान proteoglycan उत्पादन में वृद्धि हुई. = 100 माइक्रोन स्केल सलाखों.
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Discussion
एक साथ photopolymerization क्षमता के साथ इस 3 डी bioprinting प्रणाली एक सेलुलर alginate hydrogel 16 extruded सिरिंज का उपयोग osteochondral दोष के सीटू मुद्रण में से सबसे अच्छा जैसा कि पहले बताया विधि की तुलना में काफी अधिक मुद्रण संकल्प प्रदान करता है. उच्च मुद्रण संकल्प शारीरिक उपास्थि जोनल संगठन को बहाल करने के लिए उपास्थि ऊतक इंजीनियरिंग के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. परत दर परत विधानसभा के दौरान एक साथ photopolymerization 3 डी निर्माण के लिए कोशिकाओं और biomaterial scaffolds के सटीक बयान को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है. प्रत्येक मुद्रित परत के साथ Microfabrication भी कारण delamination को गिरावट के लिए संभावित कम से कम, जोनल परतों के बीच चिकनी संक्रमण में हुई. ठीक bioprinting मापदंडों और bioink के घटकों को समायोजित करके, हम उपास्थि घावों की एक विस्तृत विविधता को चंगा करने के लिए आवश्यक जटिल 3D संरचनाओं करने में सक्षम बनाना होगा.
उस वक़्त के साथrgistic वृद्धि कारक उत्तेजना, bioprinted neocartilage सबसे अच्छा chondrogenic phenotype और सबसे सेल प्रसार 3 था. उचित वृद्धि कारकों के साथ व्यवहार करते हैं, इसलिए, bioprinting के लिए संभव है जो इस अध्ययन में इस्तेमाल सेल बोने घनत्व, भी उपास्थि उत्थान के लिए आदर्श है. ऑटोलॉगस chondrocytes का उपयोग उपास्थि की मरम्मत बहुत कारण बायोप्सी में काटा chondrocytes की सीमित संख्या के लिए नैदानिक अनुप्रयोगों में प्रतिबंधित है. Monolayer विस्तार के बिना उपास्थि की मरम्मत के लिए biomaterials के साथ सीधे काटा ऑटोलॉगस chondrocytes या mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) दाखिल बेहद आकर्षक है. इसलिए, यह सीमित सेल नंबर दिया उपास्थि मैट्रिक्स की गुणवत्ता से समझौता किए बिना उपास्थि गठन के लिए आवश्यक इष्टतम सेल घनत्व को मुद्रित सेल नंबर विस्तार करने के लिए महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, प्रारंभिक सेल घनत्व सीमित बहुत अनुकूलन और bioprinting संकल्प को अधिकतम जाएगा. इस प्रकार, bioprinयहाँ वर्णित ting विधि नैदानिक सेटिंग में कम सेल नंबर के साथ पूरी तरह से संगत है और उपास्थि ऊतक इंजीनियरिंग के लिए इस्तेमाल किया जा करने की क्षमता है.
अंत में, हमारे काम सटीक निशाना बनाया पदों को chondrocytes और biomaterial पाड़ सामग्री देने से शारीरिक उपास्थि संरचनाओं fabricating की व्यवहार्यता को दर्शाता है. मानव chondrocytes साथ एक खूंटी हाइड्रोजेल लगातार परत दर परत विधानसभा के माध्यम से bioprinted गया था. एक साथ photopolymerization अपने प्रारंभिक जमा पदों पर मुद्रित कोशिकाओं को बनाए रखा और phototoxicity कम कर दिया. मुद्रित neocartilage में कोशिकाओं लगातार जीन अभिव्यक्ति और जैव रासायनिक विश्लेषण 2 के साथ chondrogenic phenotype बनाए रखा. इसलिए, इस तकनीक शारीरिक उपास्थि ऊतक इंजीनियरिंग के लिए एक आशाजनक अग्रिम है.
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Disclosures
लेखक इस अध्ययन में कोई वित्तीय हित है.
Acknowledgments
लेखकों न्यूयॉर्क राजधानी क्षेत्र रिसर्च एलायंस अनुदान से समर्थन स्वीकार करना चाहते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HP Deskjet 500 thermal inkjet printer | Hewlett-Packard | C2106a | Discontinued. Purchased refurbished from internet vendor. |
| HP black ink cartridge | Hewlett-Packard | 51626a | |
| Ultraviolet lamp | UVP | B-100AP | |
| UV light meter | General Tools | UV513AB | |
| Zeiss LSM 510 laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 510 | |
| Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) | Mediatech | 10-013 | |
| Penicillin-streptomycin-glutamine (PSG) | Invitrogen | 10378-016 | |
| Accutase cell dissociation reagent | Invitrogen | A11105-01 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Invitrogen | 10010-023 | |
| Live/Dead viability/cytotoxicity Kit | Invitrogen | L-3224 | |
| Poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) | Glycosan Biosystems | GS700 | |
| Irgacure 2959 | Ciba Specialty Chemicals | I-2959 | |
| Human articular chondrocytes | Lonza | CC-2550 |
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