Summary
Metodene som beskrives i denne artikkelen viser hvordan du kan konvertere en kommersiell blekkskriver inn en bioprinter med samtidig UV polymerisasjon. Skriveren er i stand til å konstruere 3D vev struktur med celler og biomaterialer. Studien viste her konstruert en 3D neocartilage.
Abstract
Bioprinting, som er basert på termisk blekkutskrifter, er en av de mest attraktive brytende teknologi innen tissue engineering og regenerativ medisin. Med digital kontrollceller, stillaser, og vekstfaktorer kan være nøyaktig avsatt på det ønskede to-dimensjonale (2D), og tre-dimensjonale (3D) steder raskt. Derfor er denne teknologien en ideell tilnærming til å dikte vev etterligne sine opprinnelige anatomiske strukturer. For å ingeniør brusk med innfødte sone organisasjon, ekstracellulære matrise sammensetning (ECM), og mekaniske egenskaper, utviklet vi en bioprinting plattform å bruke en kommersiell blekkskriver med samtidig fotopolymerisasjon stand for 3D brusk tissue engineering. Menneskelige kondrocytter suspendert i poly (etylenglykol)-diakrylat (PEGDA) ble trykket på 3D neocartilage konstruksjon via lag-for-lag sammenstillingen. De trykte celler ble fastsatt til sine opprinnelige avsatt stillinger, støttet av omgiunding stillaset samtidig fotopolymerisasjon. De mekaniske egenskapene til det trykte vev var lik den opprinnelige brusk. Sammenlignet med konvensjonelle vev fabrikasjon, som krever lengre UV-eksponering, levedyktighet av de trykte celler med samtidig fotopolymerisasjon var betydelig høyere. Trykket neocartilage oppviste utmerket glykosaminoglykan (GAG) og kollagen type II-produksjon, noe som var i samsvar med genekspresjon. Derfor er denne plattformen ideell for nøyaktig celle distribusjon og tilrettelegging for anatomisk tissue engineering.
Introduction
Bioprinting basert på termisk blekkutskrifter er en av de mest lovende teknologiene innen tissue engineering og regenerativ medisin. Med digital kontroll og høy gjennomstrømning hodene celler, stillas, og vekstfaktorer kan være nøyaktig avsatt på det ønskede to-dimensjonale (2D), og tre-dimensjonale (3D) posisjoner hurtig. Mange vellykkede applikasjoner har blitt oppnådd ved hjelp av denne teknologien i tissue engineering og regenerativ medisin 1-9. I denne utredningen, ble en bioprinting plattform etablert med en modifisert Hewlett-Packard (HP) Deskjet 500 termisk blekkskriver og en samtidig fotopolymerisasjon system. Syntetiske hydrogeler formulert fra poly (etylenglykol) (PEG), har vist at kapasiteten til å opprettholde levedyktighet og chondrocyttransplantasjon fremme chondrogenic ECM produksjon 10,11. I tillegg er photocrosslinkable PEG lett oppløselig i vann med lav viskositet, noe som gjør den ideell for samtidig polymerrization under 3D bioprinting. I denne utredningen, menneskelige chondrocytes suspendert i poly (etylen) glykol diacrylate (PEGDA; MW 3400) ble nettopp trykt å konstruere neocartilage lag-på-lag med 1400 dpi i 3D-oppløsning. Homogen fordeling av avsatt celler i en 3D-stillaset ble observert, noe som ble generert bruskvev med gode mekaniske egenskaper og forbedret ECM-produksjon. I motsetning til dette, ved manuell fabrikasjon cellene samlet på bunnen av gelen i stedet for de innledningsvis avsatt posisjoner som følge av langsommere stillaset polymerisasjon, noe som førte til inhomogene bruskdannelse etter dyrkning 2,3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Bioprinting Platform Etablering
Skriveren modifikasjon var basert på en HP Deskjet 500 termisk blekkskriver og HP 51626A svart blekkpatron.
- Fjern den øverste plastdekselet på skriveren og forsiktig løsne kontrollpanelet fra dekselet.
- Løsne de tre kablene mellom skriveren øverste delen og basen. Fjern skriverens toppdelen fra basen.
- På skriver øverste delen, fjern den lille plast og gummi tilbehør (rengjøring av skrivehodet system) på høyre side under blekkpatronen.
- Ta av bunnen av papirskuffen med fjærer.
- Fjern metallisk plate som dekker plast papirmating bar.
- Klipp av plast papirmating bar på midten fôring hjulstilling ved hjelp av en håndsag eller annet skjærende verktøy.
- Fjern de to papirmatingshjulene utsatt etter at det forrige trinnet. Hjulet plast er meget vanskelig, og et elektroniskSagen vil være nyttig.
- Rengjør støv og rusk ved hjelp av trykkluft på boks og etanol våtservietter.
- Fest skriverens toppdelen til underlaget.
- UV-sterilisere den modifiserte skriveren i minst to timer i en laminær hette før bruk.
- Skjær av korken på en HP 51626A blekkpatron ved hjelp av en håndsag eller annet skjærende verktøy.
- Tømme blekk og fjerne filteret som dekker bunnen godt reservoar av brusk.
- Skyll kassetten grundig med rennende vann fra springen.
- Ultrasonicate patronen i deionisert (DI) vann i 10 minutter for å fjerne overskytende blekk.
- Undersøke kassetten for å sikre at alt blekket har blitt fjernet. Skyll eller spray patronen grundig med 70% etanol for sterilisering, etterfulgt av sterilisert DI vann.
- Sett opp en langbølget ultrafiolett lampe over utskrift plattform for å gi samtidig fotopolymerisasjon kapasitet.
- Mål UV intensiteten ved utskrift plattform ved hjelp av en UV-lysmeter. Justere avstanden mellom UV-lampe og skriveren plattformen slik at intensiteten ved trykking gjenstand er mellom 4-8 mW / cm 2 (omtrent 25 cm fra lampen til skriveren plattform).
2. Bioink Forberedelse
- Monolayer chondrocyttransplantasjon utvidelse
- Plate 5000000 humane kondrocytter i hver T175 vevskultur-kolbe for celle ekspansjon i Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) supplert med 10% kalveserum og 1 x penicillin-streptomycin-glutamin (PSG). Kultur-celler ved 37 ° C med fuktig luft inneholdende 5% CO 2. Endring kulturmediet etter 3 dager før kolben er 85% sammenløp. Bruk celler fra den samme passasje.
- Oppløs PEGDA i PBS til en sluttkonsentrasjon på 10% w / v. Legg fotoinitiator I-2959 til en endelig konsentrasjon på 0,05% w / v. Filtrer sterilisere oppløsningen.
- Suspender dyrkede humane kondrocytter i det fremstilt PEGDA oppløsning ved 5 x 10 6 celler /ml.
Tre. Bruskvev Utskrift
- Slå på skriveren og laptop.
- Lag en utskrift mønster av en solid sirkel med 4 mm i diameter ved hjelp av Microsoft Word eller Adobe Photoshop.
- Justere plasseringen av mønsteret og sørge for at det blir skrevet ut nøyaktig inn i plast mold.
- Beregn antall utskrifter som trengs for å nå ønsket tykkelse på stillaset. For 4 mm i høyden, er 220 utskrifter nødvendig for å skape den ønskede stillaset.
- Laste bioink inn i blekkpatronen. Dekk til kassetten med aluminiumsfolie for å beskytte mot direkte UV-eksponering under utskrift.
- Utskrift kommandoen Send til skriveren. Trekk papirsensoren når skriveren begynner å skrive ut. Hele trykkeprosessen bør ta mindre enn 4 min for et stillas med 4 mm i diameter og 4 mm høyde.
- Overføring trykt neocartilage til en 24-brønns plate og tilsett 1,5 ml kulturmedium til hver brønn.
- Inkuber trykt neocartilage i LIVE / DEAD levedyktighet / Cytotoksisitet arbeidsløsning ved romtemperatur i 15 min i mørket.
- Kutt celle-Laden hydrogel i to og ta fluorescerende bilder av skjæreområdet.
- Count levende (grønn) og døde (røde) celler av en blindet observatør på fem tilfeldig tatt bilder. Beregn cellelevedyktighet ved å dividere antall levende celler ved det totale antall levende og døde celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den modifiserte termisk blekkskriver var i stand for celle-og stillas deponering ved høy gjennomstrømming og utmerket celle levedyktighet. Kombinere med samtidig fotopolymerisasjon og lysfølsomme biomaterialer, er denne teknologien i stand til å fikse celler og andre trykte stoffer til opprinnelig avsatt steder. Ifølge egenskapene til den modifiserte termisk blekkskriver, 2D-oppløsning var 300 dpi med en enkelt blekkdråpevolum på 130 pl. Det er 50 avfyrings dyser i hvert skrivehode med 3,6 kHz avfyringsfrekvens 12,13. Derfor for et representativt konstruksjon av 4 mm diameter og 4 mm høyde, volum og tykkelsen av hvert trykte lag under lag-for-lag konstruksjon var 0,23 mL og 18 um henholdsvis. Hele trykkeprosessen tok mindre enn 4 min for å bygge brusk vev (Figur 1).
Figur 2A viser en jevn celle fordeling av printed chondrocytes i 3D stillas på grunn av samtidig fotopolymerisasjon av den omkringliggende stillas under celle deponering. I motsetning til dette, uten at samtidig fotopolymerisasjon (stillaset polymerisert etter celle seeding), sank de deponerte celler til bunnen eller sone grensesnitt i stedet for de innledningsvis avsatt steder på grunn av tyngdekraften (fig. 2B). Denne cellen opphopning ble også observert i tidligere rapporter om manuell fabrikasjon av brusk vev 14,15. Den trykte menneskelige chondrocytes i 3D PEG hydrogel utvinnes chondrogenic fenotype og demonstrert gradvis økt proteoglycan produksjon i løpet av kultur (figur 3) tre.
Figur 1. Trykt neocartilage vev. A) Skjematisk av brusk bioprinting med samtidig fotopolymerisasjon og låer-for-lag sammenstillingen. B) En trykt neocartilage vevet med 4 mm i diameter og 4 mm høyde. Scale Bar = 2 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Chondrocytes merket med grønne og oransje fluorescerende fargestoffer demonstrerte sone brusk bioprinting gjennomførbarhet. A) Trykt-celler opprettholdt deres opprinnelig avsatt stillinger i 3D-hydrogel. Trykkingen og fotopolymerisasjon prosess gjennomført i 4 min med celle-levedyktighet på 90% (n = 3). B) Celler samlet seg til bunnen eller grensesnitt som følge av tyngdekraften, uten samtidig fotopolymerisasjon. Det tok 10 minutter for UV-eksponering til gel konstruktet med samme størrelse med en med en cellelevedyktighet63% (n = 3). Scale barer = 100 mikrometer.
Figur 3. Safranin-O farging av trykte chondrocytes i PEG hydrogel viser økt proteoglycan produksjon i løpet av kulturen. Scale barer = 100 mikrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne 3D bioprinting system med samtidig fotopolymerisasjon kapasitet gir en betydelig større utskriftsoppløsning enn de beste tidligere rapportert metode for in situ utskrift av osteochondral defekter ved hjelp av sprøyte ekstrudert celle alginat hydrogel 16. Høyere oppløsning er spesielt kritisk for brusk tissue engineering å gjenopprette den anatomiske brusk sone organisasjon. Samtidig fotopolymerisasjon under lag-på-lag montering er avgjørende for å opprettholde presis deponering av celler og biomateriale stillaser for 3D konstruksjon. Microfabrication med hver utskrevne lag også resultert i jevne overganger mellom sonelagene, noe som minsker faren for degradering på grunn av delaminering. Ved nøyaktig justering av bioprinting parametere og komponenter av bioink, vi vil være i stand til å fremstille den komplekse 3D-strukturer som kreves for å helbrede et bredt utvalg av brusklesjoner.
Med Synergistic vekstfaktor stimulering, den bioprinted neocartilage hadde den beste chondrogenic fenotype og mest celleproliferasjon tre. Derfor cellen seeding tettheten som brukes i denne undersøkelsen, som er mulig for bioprinting, er også velegnet for brusk regenerering ved behandling med egnede vekstfaktorer. Brusk reparasjon ved hjelp av autologe chondrocytes er sterkt begrenset i kliniske applikasjoner på grunn av begrenset antall chondrocytes høstet i biopsi. Implantering av direkte høstet autologe chondrocytes eller mesenchymale stamceller (MSCS) sammen med biomaterialer for brusk reparasjon uten monolayer utvidelse er meget attraktiv. Derfor er det viktig å utvide de trykte celle tall den optimale celletetthet som kreves for bruskdannelse, uten at det går ut over kvaliteten på bruskmatrise gitt begrenset antall celler. Videre begrenser innledende celletettheten vil i stor grad optimalisere og maksimere bioprinting oppløsning. Dermed bioprinlingen metoden som er beskrevet her er fullt ut kompatibel med de lave celletall i klinisk setting, og har potensiale til å bli brukt for bruskvev engineering.
I konklusjonen, demonstrerer vårt arbeid muligheten for å fabrikere anatomiske bruskstrukturer ved å levere chondrocytes og biomateriale stillasmateriell til presise målrettede posisjoner. En PEG hydrogel med humane kondrocytter ble kontinuerlig bioprinted via lag-for-lag sammenstillingen. Samtidig fotopolymerisasjon opprettholdt de utskrevne celler på sine opprinnelige avsatte stillinger og redusert fototoksisitet. Celler i den trykte neocartilage opprettholdt chondrogenic fenotype med konsistent genuttrykk og biokjemisk analyse to. Derfor er denne teknologien en lovende forhånd for anatomisk brusk tissue engineering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen økonomisk interesse i denne studien.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke våre fra New York Capital Region Forskning Alliance Grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HP Deskjet 500 thermal inkjet printer | Hewlett-Packard | C2106a | Discontinued. Purchased refurbished from internet vendor. |
| HP black ink cartridge | Hewlett-Packard | 51626a | |
| Ultraviolet lamp | UVP | B-100AP | |
| UV light meter | General Tools | UV513AB | |
| Zeiss LSM 510 laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 510 | |
| Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) | Mediatech | 10-013 | |
| Penicillin-streptomycin-glutamine (PSG) | Invitrogen | 10378-016 | |
| Accutase cell dissociation reagent | Invitrogen | A11105-01 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Invitrogen | 10010-023 | |
| Live/Dead viability/cytotoxicity Kit | Invitrogen | L-3224 | |
| Poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) | Glycosan Biosystems | GS700 | |
| Irgacure 2959 | Ciba Specialty Chemicals | I-2959 | |
| Human articular chondrocytes | Lonza | CC-2550 |
References
- Cui, X., Boland, T. Human microvasculature fabrication using thermal inkjet printing technology. Biomaterials. 30, 6221-6227 (2009).
- Cui, X., Breitenkamp, K., Finn, M. G., Lotz, M., D'Lima, D. D. Direct human cartilage repair using three-dimensional bioprinting technology. Tissue Eng Part A. 18, 1304-1312 (2012).
- Cui, X., Breitenkamp, K., Lotz, M., D'Lima, D. Synergistic action of fibroblast growth factor-2 and transforming growth factor-beta1 enhances bioprinted human neocartilage formation. Biotechnol. Bioeng. 109, 2357-2368 (2012).
- Cui, X., Breitenkamp, K., Finn, M. G., Lotz, M., Colwell, C. W. Direct human cartilage repair using thermal inkjet printing technology. Osteoarthritis and Cartilage. 19, (2011).
- Cui, X., Boland, T. Simultaneous deposition of human microvascular endothelial cells and biomaterials for human microvasculature fabrication using inkjet printing. NIP24/digital Fabrication 2008: 24th International Conference on Digital Printing Technologies, Technical Program and Proceedings. 24, 480-483 (2008).
- Cui, X., Dean, D., Ruggeri, Z. M., Boland, T. Cell damage evaluation of thermal inkjet printed Chinese hamster ovary cells. Biotechnol. Bioeng. 106, 963-969 (2010).
- Cui, X., Hasegawa, A., Lotz, M., D'Lima, D. Structured three-dimensional co-culture of mesenchymal stem cells with meniscus cells promotes meniscal phenotype without hypertrophy. Biotechnol. Bioeng. 109, 2369-2380 (2012).
- Cui, X., Gao, G., Qiu, Y. Accelerated myotube formation using bioprinting technology for biosensor applications. Biotechnol. Lett. 35, 315-321 (2013).
- Cui, X., Boland, T., D'Lima, D. D., Lotz, M. K. Thermal inkjet printing in tissue engineering and regenerative medicine. Recent Pat Drug Deliv Formul. 6, 149-155 (2012).
- Bryant, S. J., Anseth, K. S. Hydrogel properties influence ECM production by chondrocytes photoencapsulated in poly(ethylene glycol) hydrogels. Journal of Biomedical Materials Research. 59, 63-72 (2002).
- Elisseeff, J., et al. Photoencapsulation of chondrocytes in poly(ethylene oxide)-based semi-interpenetrating networks. Journal of Biomedical Materials Research. 51, 164-171 (2000).
- Buskirk, W. A., et al. Development of A High-Resolution Thermal Inkjet Printhead. Hewlett-Packard Journal. 39, 55-61 (1988).
- Harmon, J. P., Widder, J. A. Integrating the Printhead Into the HP Deskjet Printer. Hewlett-Packard Journal. 39, 62-66 (1988).
- Kim, T. K., et al. Experimental model for cartilage tissue engineering to regenerate the zonal organization of articular cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 11, 653-664 (2003).
- Sharma, B., et al. Designing zonal organization into tissue-engineered cartilage. Tissue Engineering. 13, 405-414 (2007).
- Cohen, D. L., Lipton, J. I., Bonassar, L. J., Lipson, H. Additive manufacturing for in situ repair of osteochondral defects. Biofabrication. 2, (2010).
